способ получения вещества, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку в-лимфоцитов

Формула изобретения

Способ получения средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, из сырья животного происхождения, включающий гомогенизацию предварительно замороженного при -40°C сырья с последующей экстракцией в 3%-ном растворе уксусной кислоты при соотношении 1 часть сырья к 5 частям раствора уксусной кислоты и добавление хлорид цинка из расчета 1 г на 1 л 3%-ной уксусной кислоты при pH 3,5-4,0, полученный экстракт отфильтровывают, центрифугируют, надосадочную жидкость приливают в охлажденный ацетон в соотношении 1:5, формируют осадок, осаждают ацетоном, с последующей фильтрацией и лиофилизацией, отличающийся тем, что в качестве сырья используют ткань эндометрия свиней, экстракцию проводят в течение 36 часов, экстракт центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, а формирование осадка продолжается 12 часов при -4°C, целевой продукт дополнительно очищают ультрафильтрацией с пределом молекулярного удержания 5 кД.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности и касается получения биологически активных средств из сырья животного происхождения, стимулирующих антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов.

Известен способ получения гемолимфопоэтических ростковых факторов из супернатанта культуры клеток костного мозга (см. патент США № 5264418, МКИ⁵ C07K 3/20, 1993), включающий ионообменную хроматографию на DEAE-целлюлозе, Con-A аффинную хроматографию, гель-фильтрацию на Sephacryl S-300, ионообменную хроматографию на mono-Q колонке, гель-фильтрацию на Superose 12. Получаемое вещество (HLGF-1) обладает способностью стимулировать дифференцировку пре-B клеток. Однако данный способ является сложным многостадийным процессом, требующим большого количества реактивов и специального оборудования, процесс требует длительного времени, а препарат активен лишь в концентрации от 5 до 10 мг/мл. Конечный продукт имеет белковую природу с ММ 110-140 кД, что придает веществу дополнительные аллергенные свойства.

Известен способ получения вещества, стимулирующего созревание В-лимфоцитов, из ткани сумки Фабрициуса птиц (см. а.с. СССР № 1438044, МПК A61K 39/00, 1985, опуб. 10.04.1999), который по технической сущности и достигаемому результату является наиболее близким к предлагаемому решению и является его прототипом. Способ включает гомогенизацию предварительно замороженного при -40°C сырья с последующей экстракцией в 3%-ном растворе уксусной кислоты при соотношении 1 часть сырья к 5 частям раствора уксусной кислоты и добавление хлорид цинка из расчета 1 г на 1 л 3%-ной уксусной кислоты при pH 3,5-4,0, полученный экстракт отфильтровывают, центрифугируют, надосадочную жидкость приливают в охлажденный ацетон в соотношении 1:5, формируют осадок, осаждают ацетоном, с последующей фильтрацией и лиофилизацией.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является расширение ассортимента высокоэффективных лекарственных средств, стимулирующих антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов.

Результат достигается тем, что способ получения средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, из сырья животного происхождения, включающий гомогенизацию предварительно замороженного при -40°C сырья с последующей экстракцией в 3%-ном растворе уксусной кислоты при соотношении 1 часть сырья к 5 частям раствора уксусной кислоты и добавление хлорид цинка из расчета 1 г на 1 л 3%-ной уксусной кислоты при pH 3,5-4,0, в котором полученный экстракт отфильтровывают, центрифугируют, надосадочную жидкость приливают в охлажденный ацетон в соотношении 1:5, формируют осадок, осаждают ацетоном, с последующей фильтрацией и лиофилизацией, отличается тем, что в качестве сырья используют ткань эндометрия свиней, экстракцию проводят в течение 36 часов, экстракт центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин, а формирование осадка продолжается 12 часов при -4°C, целевой продукт дополнительно очищают ультрафильтрацией с пределом молекулярного удержания 5 кД.

В предлагаемом способе используют матки свиней в возрасте от 2 до 5 лет, отделяют эндометрий, который после промывки в холодной проточной воде замораживают при -40°C, гомогенизируют и загружают в реактор с охлаждением и мешалкой в 3%-ный раствор уксусной кислоты (1 часть сырья к 5 частям раствора уксусной кислоты) и добавляют хлорид цинка из расчета 1 г на 1 л 3%-ной уксусной кислоты (pH 3,5-4,0). Экстракцию проводят в течение 36 ч при 4°C. Экстракт отфильтровывают, центрифугируют (3000 об/мин в течение 20 мин) и надосадочную жидкость приливают в охлажденный ацетон в соотношении 1:5 (1 часть экстракта к 5 частям ацетона). Формирование осадка продолжается 12 ч при -4°C. Осадок отфильтровывают под вакуумом, отмывают чистым ацетоном и высушивают на воронке Бюхнера с использованием фильтровальной бумаги. Полученный порошок далее высушивают при 18-20°C и растворяют в дистиллированной воде в соотношении 1 г/10 мл и подвергают ультрафильтрации через фильтр с пределом молекулярного удержания 5000 Д. Полученный фильтрат стерилизуют фильтрацией, разливают в стерильные флаконы по 1 мл и лиофилизируют.

Данный способ позволяет получить средство, обладающее высокой биологической активностью. Так, средство, полученное этим способом, стимулировало созревание T- и B-лимфоцитов в культуре клеток в концентрации 1 мг/мл. Молекулярная масса данного средства колеблется от 600 до 5000 Д.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1. Брали 500 г свежезамороженной ткани эндометрия свиней, гомогенизировали в гомогенизаторе. Гомогенат заливали 5 объемами (2,5 литра) 3%-ной уксусной кислоты с хлоридом цинка в концентрации 1 г/литр раствора кислоты. Экстракцию проводили в течение 36 часов при температуре +4°C при постоянном перемешивании. Затем экстракт фильтровали через бязевую ткань, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 минут. К полученному экстракту добавляли охлажденный до -4 -5°C ацетон в соотношении 1:5 (1 часть экстракта и 5 частей ацетона), осадок формировали в течение 12 часов при температуре -4°C. Полученный осадок отфильтровывали под вакуумом, тщательно промывали чистым ацетоном и высушивали. Порошок растворяли в 10 объемах дистиллированной воды, перемешивая в течение 1 часа, и подвергали ультрафильтрации на мембране Millipore (США) с пределом молекулярного удержания 5 кД. Выход активного вещества составил 5,8 г. При инкубации с лимфоцитами полученное вещество в концентрации 1 мг/мл повышало количество B-лимфоцитов с Ig-рецепторами до 32,5±1,5% (контроль 22,7±1,1%).

Полученное вещество представляет собой комплекс пептидов с молекулярной массой до 5000 Д. Пептидная природа средства, полученного по предлагаемому способу, подтверждается следующими данными:

1) дает цветную реакцию с биуретовым реактивом;

2) молекулярная масса компонентов, определенная с помощью гель-хроматографии, составляет 600-5000 Д;

3) основной спектр (пик) поглощения в ультрафиолетовом свете колеблется в пределах 220-230 нм (спектрофотометрически).

Все вышеуказанное позволяет достаточно точно провести идентификацию полученного средства.

При сопоставительном анализе заявляемого способа и способа-прототипа выявлены следующие сходные признаки:

1) оба способа предназначены для получения средства, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов;

2) в качестве исходного сырья используют ткани животного происхождения;

3) сырье предварительно замораживают;

4) сырье гомогенизируют;

5) гомогенат подвергают экстракции;

6) экстракт фильтруют и центрифугируют;

7) осадок отфильтровывают под вакуумом;

8) полученное вещество лиофильно высушивают.

Однако известный способ-прототип и предлагаемый способ имеют следующие отличия:

1) в прототипе экстракцию проводят из сумки Фабрициуса птиц, а в предлагаемом способе экстракцию осуществляют из ткани эндометрия свиней, что более доступно;

2) в способе-прототипе время экстракции составляет 48-72 часа, а в предлагаемом способе экстракцию осуществляют в течение 36 часов;

3) в предлагаемом способе с целью дополнительной очистки целевого продукта осадок подвергают ультрафильтрации с пределом молекулярного удержания 5 кД;

4) в способе-прототипе целевой продукт представлен щелочными полипептидами с молекулярной массой от 2000 до 12000 Д, а в предлагаемом способе выделяют пептиды преимущественно с ММ от 600 до 5000 Д.

Таблица 1
Сравнение различных способов получения вещества, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-клеток
№	Отличительный признак	Способ-прототип	Предлагаемый способ
1	Субстрат	Сумка Фабрициуса птиц	Ткань эндометрия свиней
2	Длительность экстракции	48-72 ч	36 ч
4	Дополнительная фильтрация		Ультрафильтрация с порогом 5 кД
5	Характеристика целевого продукта	Щелочные полипептиды с ММ 2-12 кД	Щелочные пептиды с ММ 0,6-5 кД
6	Активная концентрация препарата	5-10 мг/мл	1 мг/мл

Доказательство правильности выбранных в предлагаемом способе параметров экстракции и ультрафильтрации приведены в таблицах 2-5. Количество B-лимфоцитов, несущих Ig-рецепторы, определяли методом прямой антиглобулиновой розеточной реакции с антисыворотками к иммуноглобулинам человека (Кудрявцева Е.Р., 1983). Концентрация пептидов в опыте составляла 1 мг/мл.

Таблица 2
Влияние pH среды экстракции на биологическую активность получаемого средства
pH среды экстракции	Количество B-лимфоцитов (%), имеющих Ig-рецепторы (n=20)
Контроль	21,3±1,2
7,0	22,3±1,4
6,5	23,2±1,3
6,0	23,4±1,2
5,5	24,1±1,4
5,0	31,2±1,3*
4,5	31,4±1,4*
4,0	32,5±1,5*
3,5	31,8±1,6*
3,0	25,1±1,2
2,5	22,4±1,5
* показатель достоверности различий между контролем и опытом P<0,01

Из таблицы 2 видно, что для получения вещества, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, необходимо проводить экстракцию при pH 4,0-3,5. Более высокие или более низкие значения pH приводят к снижению специфической активности получаемого вещества.

Таблица 3
Влияние времени экстракции на биологическую активность получаемого вещества
Время экстракции, ч	Количество B-лимфоцитов (%), имеющих Ig-рецепторы (n=18)
Контроль	21,3±1,2
6	22,3±1,7
12	23,7±1,9
24	29,7±1,6*
36	32,1±1,5*
48	31,8±1,9*
72	30,9±2,1*
* показатель достоверности различий между контролем и опытом P<0,01

Из таблицы 3 видно, что оптимальное время экстракции составляет 36 часов. Уменьшение или увеличение времени экстракции приводит к снижению активности целевого продукта.

Таблица 4
Влияние порога ультрафильтрации на биологическую активность получаемого вещества
Молекулярная масса вещества, кД	Количество B-лимфоцитов (%), имеющих Ig-рецепторы (n=17)
Контроль	21,3±1,2
До 3	27,3±2,3
До 5	32,1±1,5*
До 10	27,7±1,9
* показатель достоверности различий между контролем и опытом P<0,01

Из таблицы 4 видно, что максимальной специфической активностью обладает фракция с молекулярной массой около 5000 Д.

Биологическую активность полученного вещества, как и в способе-прототипе, изучали методом прямой антиглобулиновой розеточной реакции с антисыворотками к иммуноглобулинам человека (Кудрявцева Е.Р., 1983). Известно, что Ig-рецепторы являются маркером дифференцировки В-клеток и экспрессируются на зрелых B-лимфоцитах. Лимфоциты периферической крови больных с ожогами IIIб-IV степени 15-30% поверхности тела инкубировали в течение 2 часов при температуре 37°C в полной питательной среде с полученными пептидами в концентрации от 0,1 до 1 мг/мл. Исследование проводили на лимфоцитах ожоговых больных, поскольку известно, что при ожоговой болезни нарушается антигеннезависимая дифференцировка B-лимфоцитов и в периферической крови появляется большое количество незрелых или «нулевых» клеток (Эберт Л.Я., 1980). В качестве контроля использовали лимфоциты, инкубированные с добавлением аналогичного объема физиологического раствора.

Таблица 5
Влияние полученного вещества на экспрессию иммуноглобулиновых рецепторов B-лимфоцитов
Концентрация вещества, мкг/мл	Количество лимфоцитов (%), имеющих Ig-рецепторы (n=19)
Контроль	21,3±1,2
0,1	22,1±1,3
0,5	27,1±1,1*
1,0	32,6±1,4**
10,0	31,8±1,6**
20,0	30,5±1,3*
100,0	30,7±1,1*
* показатель достоверности различий между контролем и опытом P<0,05
** показатель достоверности различий между контролем и опытом P<0,01

Таким образом, по предлагаемому способу получают средство, обладающее стимулирующим действием на антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов. По сравнению со способом-прототипом предлагаемый способ позволяет достигнуть повышения активности целевого продукта, что выражается в снижении активной концентрации препарата. Так, средство, полученное по предлагаемому способу, обладает специфической активностью в концентрации от 1,0 до 10 мг/мл, в то время как по способу-прототипу - 5-10 мг/мл.

Средство, стимулирующее антигеннезависимую дифференцировку B-лимфоцитов, может найти применение в медицине для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний различной этиологии с преимущественным поражением гуморального звена иммунитета, в том числе и возникающего при развитии послеродового эндометрита.