питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов

Формула изобретения

Питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит цеолит при следующем соотношении ингредиентов, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.60-0.70
Гидрофосфат калия	0.12-0.20
Сульфат магния гептагидрат	0.15-0.25
Хлорид натрия	0.15-0.25
Сульфат кальция дигидрат	0.02-0.06
Молибдат натрия	0.0005-0.0007
Сульфат железа(II)	0.002-0.004
Сахароза	18.0-22.0
Цеолит	1.0-2.0
Вода дистиллированная	до 1 л

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.

Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [1]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста на ней азотфиксирующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, что делает ее малопригодной для выращивания их консорциума.

Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая глюкозу, аспарагин, сульфат калия, кукурузный экстракт, хлорид кальция, фосфат натрия и воду [2]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста азотфиксирующих микроорганизмов, что делает ее также малопригодной для выращивания их консорциума.

Наиболее близким к заявляемому нами объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду [3]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с только что отмеченным обстоятельством выбрана нами в качестве объекта-прототипа, также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов и, значит, и их консорциума в целом.

Целью данного изобретения является увеличение скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов при сохранении скорости роста азотфиксирующих микроорганизмов при выращивании консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов.

Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II) и воду, дополнительно содержит цеолит при следующем соотношении компонентов, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.60-0.70
Гидрофосфат калия	0.12-0.20
Сульфат магния гептагидрат	0.15-0.25
Хлорид натрия	0.15-0.25
Сульфат кальция дигидрат	0.02-0.06
Молибдат натрия	0.0005-0.0007
Сульфат железа(II)	0.002-0.004
Сахароза	18.0-22.0
Цеолит	1.0-2.0
Вода дистиллированная	до 1 л

В результате использования данной питательной смеси скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов остается практически неизменной, тогда как скорость роста фосфатмобилизующих возрастает в 4-5 раз по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3].

На данный момент времени в литературе не описана питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность компонентов вообще и цеолит в частности. Это обстоятельство позволяет нам сделать вывод, что заявляемый нами объект подпадает под первый критериальный признак изобретения, установленный патентным законодательством РФ, а именно новизна. Сопоставление известных признаков питательной среды-прототипа [3] и отличительных признаков, характеризующих заявляемый нами объект (а именно - введение в питательную среду цеолита), не позволяет предсказать априори появления у него новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше резкого увеличения скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, входящих в состав вышеуказанного консорциума, при сохранении практически неизменной скорости роста азотфиксирующих микроорганизмов. Данный факт позволяет утверждать, что заявляемый нами объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня и соответствует второму установленному законодательством РФ критериальному признаку изобретения - изобретательский уровень. Заявляемая нами на предмет изобретения питательная среда достаточно легко может быть получена в промышленном масштабе, не вызывает сколько-нибудь существенных затруднений и ее применение для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, а значит, вышеуказанный объект подпадает и под третий критериальный признак изобретения РФ - промышленная применимость.

Заявляемый нами объект иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1

Готовят питательную среду для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.60
Гидрофосфат калия	0.12
Сульфат магния гептагидрат	0.15
Хлорид натрия	0.15
Сульфат кальция дигидрат	0.02
Молибдат натрия	0.0005
Сульфат железа(II)	0.002
Сахароза	18.0
Цеолит	1.0
Вода дистиллированная	до 1 л

Составляют консорциум азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов {Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) и (Sphingobacterium multivorum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10385), соответственно с соотношением 1:1, по количеству КОЕ (колониеобразующих единиц), для чего предварительно выращивают азотфиксирующие микроорганизмы на агаризованной среде Эшби, а фосфатмобилизующие - на агаризованной среде Муромцева. После этого обе эти культуры микроорганизмов высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (6,0 сут), по его достижении этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев образовавшегося консорциума на агаризованные питательные среды (среда Эшби в случае азотфиксирующих и среда Муромцева в случае фосфатмобилизирующих микроорганизмов) и определяют среднюю скорость их роста в (млн·г ^-1·сут^-1) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут). Итоговые результаты по определению средней скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды даны в Таблице 1.

Пример 2

Выполняют по общей технологической схеме Примера 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.64
Гидрофосфат калия	0.16
Сульфат магния гептагидрат	0.20
Хлорид натрия	0.20
Сульфат кальция дигидрат	0.05
Молибдат натрия	0.0006
Сульфат железа(II)	0.003
Сахароза	20.0
Цеолит	1.5
Вода дистиллированная	до 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.

Пример 3

Осуществляют как и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.70
Гидрофосфат калия	0.20
Сульфат магния гептагидрат	0.25
Хлорид натрия	0.25
Сульфат кальция дигидрат	0.06
Молибдат натрия	0.0007
Сульфат железа(II)	0.004
Сахароза	22.0
Цеолит	2.0
Вода дистиллированная	до 1 л

Данные по определению скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.

Пример 4 (сравнительный)

Выполняют таким же образом, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.64
Гидрофосфат калия	0.16
Сульфат магния гептагидрат	0.20
Хлорид натрия	0.20
Сульфат кальция дигидрат	0.05
Молибдат натрия	0.0005
Сульфат железа(II)	0.003
Сахароза	20.0
Цеолит	0.7
Вода дистиллированная	до 1 л

Результаты по определению скорости роста поименованных выше микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 5 (сравнительный)

Проводят как и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.64
Гидрофосфат калия	0.16
Сульфат магния гептагидрат	0.20
Хлорид натрия	0.20
Сульфат кальция дигидрат	0.05
Молибдат натрия	0.0005
Сульфат железа(II)	0.003
Сахароза	20.0
Цеолит	2.5
Вода дистиллированная	до 1 л

Значения скорости роста микроорганизмов для такого случая приведены в Таблице 1.

Пример 6 (сравнительный)

Осуществляют таким же образом, как и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.50
Гидрофосфат калия	0.09
Сульфат магния гептагидрат	0.10
Хлорид натрия	0.15
Сульфат кальция дигидрат	0.015
Молибдат натрия	0.0003
Сульфат железа(II)	0.001
Сахароза	14.0
Цеолит	1.5
Вода дистиллированная	до 1 л

Сведения о скорости роста микроорганизмов для этого случая даны в Таблице 1.

Пример 7 (сравнительный)

Выполняют как и Пример 1, но выращивание консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.90
Гидрофосфат калия	0.30
Сульфат магния гептагидрат	0.30
Хлорид натрия	0.35
Сульфат кальция дигидрат	0.09
Молибдат натрия	0.0010
Сульфат железа(II)	0.006
Сахароза	28.0
Цеолит	1.5
Вода дистиллированная	до 1 л

Величины скорости роста обоих этих микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.

Пример 8 (сравнительный)

Выполняют как и Пример 1, но для выращивания консорциума микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.50
Гидрофосфат калия	0.09
Сульфат магния гептагидрат	0.10
Хлорид натрия	0.15
Сульфат кальция дигидрат	0.015
Молибдат натрия	0.0003
Сульфат железа(II)	0.001
Сахароза	14.0
Цеолит	2.5
Вода дистиллированная	до 1 л

Значения скорости роста микроорганизмов для этого случая представлены в Таблице 1.

Пример 9 (сравнительный)

Выполняют таким же образом, как и Пример 1, но выращивание консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.90
Гидрофосфат калия	0.30
Сульфат магния гептагидрат	0.30
Хлорид натрия	0.35
Сульфат кальция дигидрат	0.09
Молибдат натрия	0.0010
Сульфат железа(II)	0.006
Сахароза	28.0
Цеолит	2.5
Вода дистиллированная	до 1 л

Данные скорости роста микроорганизмов для этого случая см. в Таблице 1.

Пример 10 (по прототипу [3])

Выполняют с использованием той же общей схемы, что и в Примере 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.64
Гидрофосфат калия	0.16
Сульфат магния гептагидрат	0.20
Хлорид натрия	0.20
Сульфат кальция дигидрат	0.05
Молибдат натрия	0.0005
Сульфат железа(II)	0.003
Сахароза	20.0
Вода дистиллированная	до 1 л

Сведения о скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая также приведены в Таблице 1.

Пример 11 (по аналогу [1])

Выполняют с использованием той же технологической схемы, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Дигидрофосфат калия	0.10
Гидрофосфат калия	0.20
Сульфат магния гептагидрат	0.20
Хлорид натрия	0.20
Карбонат кальция	5.00
Сахароза	20.0
Вода дистиллированная	до 1 л

Данные по скорости роста микроорганизмов для указанного случая также приведены в Таблице 1.

Пример 12 (по аналогу [2])

Выполняют по той же технологической схеме, что и Пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:

Сульфат калия	0.20
Хлорид кальция гексагидрат	3.30
Фосфат натрия додекагидрат	3.80
Кукурузный экстракт	0.20
Глюкоза	10.0
Аспарагин	1.00
Вода дистиллированная	до 1 л

Показатели, характеризующие рост микроорганизмов для рассматриваемого случая, также приведены в Таблице 1.

Таблица 1
№ примера	Содержание цеолита в питательной смеси, г/л	Средняя скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum), млн·г -1·сут-1	Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов (Sphingobacterium multivorum), млн·г-1·сут-1
1	1.0	34/6	720/6
2	1.5	35/6	740/6
3	2.0	35/6	740/6
4 (сравнительный)	0.7	33/6	640/6
5 (сравнительный)	2.5	36/6	730/6
6 (сравнительный)	1.5	33/6	680/6
7 (сравнительный)	1.5	32/6	690/6
8 (сравнительный)	2.5	33/6	670/6
9 (сравнительный)	2.5	33/6	680/6
10 (по прототипу)[3])	-	36/6	175/6
11 (по аналогу [1])	-	55/6	6/6
12 (по аналогу [2])	-	12/6	180/6

Из приведенных в Таблице 1 данных видно, что использование заявляемой нами питательной среды, содержащей цеолит в количестве (1.0-2.0) г/л, позволяет весьма значительно увеличить скорости роста фосфатмобилизующих (Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов при сохранении практически неизменной скорости роста азотфиксирующих [Pseudomonas brassicacearum) организмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3] и сред-аналогов [1] и [2]. Отметим, что заявляемые нами количества цеолита в питательной смеси являются существенными: при превышении указанного верхнего заявляемого уровня (2.0 г/л) дальнейшего прироста скорости роста как тех, так и других микроорганизмов уже не наблюдается (и даже происходит некоторое ее снижение), при уменьшении же ниже указанного нижнего заявляемого уровня (1.0 г/л) имеет место снижение скорости роста фосфатмобилизующих микроорганизмов,

Аналогичные результаты были получены нами и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, регистрационный номер в ВКПМ В-10386).

Источники информации

[1] Руководство к практическим занятиям по микробиологии. 3-е издание переработанное, под ред. Н.С.Егорова. М.: Издательство Московского университета. 1995. С.204.

[2] Основные микробиологические и биохимические методы исследования почвы (Методические рекомендации) / Под ред. Ю.М.Возняковской. - Л.: ВНИИСХМ, 1987. С.31.

[3] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК C05F 11/08, C12N 1/20 (прототип).