способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа

Формула изобретения

Способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа, включающий предварительную обработку полимерного твердофазного носителя, на который сорбируется антиген вируса герпеса 1 типа водным 20% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-20), с последующей адсорбцией на носителе в 0,2 М карбонат-бикарбонатном буферном растворе с pH 9,6 лизатного высокоочищенного антигена вируса герпеса 1 типа, приготовленного из штамма вируса простого герпеса 1 типа - АТСС VR-539, отмывку, лиофильную сушку, инкубацию сорбированных антигенов с блокирующим раствором, который готовится следующим образом: вносят из расчета на 1 литр дистиллята трис(гидроксиметил)аминометана - 12,1 г, БСА-5 г и сахарозы - 20 г, pH буферного раствора доводят до 7,2-7,3 соляной кислотой, после чего носитель повторно лиофильно высушивают.

Описание изобретения к патенту

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической лабораторной диагностике, иммунохимии, и касается диагностики вируса простого герпеса первого типа методом твердофазного иммуноферментного анализа - ИФА, который является наиболее используемым при диагностике различных вирусных, бактериальных и других инфекций. Метод удобен для выполнения большого числа однотипных исследований.

Предшествующий уровень техники

Известен способ получения иммуносорбента для диагностики вирусного гепатита C (патент РФ № 2095815, класс МКИ G01N 33/543). Сущность способа заключается в том, что лунки полистиролового планшета обрабатывают вирусспецифическим белком (ФАВ), инкубируют при заданной температуре, избыток ФАВ удаляют, промывают планшет фосфатным буфером и высушивают на воздухе при комнатной температуре. Для снижения неспецифической сорбции на носителе после удаления раствора и высушивания лунки планшета обрабатывают 10% раствором осветленной сыворотки крупного рогатого скота. Затем планшет герметично запаивают в полиэтиленовые пакеты. Иммуносорбент (твердофазный носитель с иммобилизованным антигеном) сохраняет высокую специфическую активность в течение года.

Недостатком этого способа является то, что в качестве вирусспецифического антигена используют рекомбинантный штамм E.coli, использование которого не гарантирует высокой чувствительности теста.

Известен также способ получения иммуносорбента для диагностики текущей инфекции ЦМВ с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) (патент РФ № 2028156, класс МКИ A61K 39/245). Сущность способа заключается в том, что из ядерной фракции клеток, инфицированных ЦМВ, через 48-72 ч после их инфицирования выделяют вирусспецифические "ранние" белки, которые адсорбируют в лунках 96-луночных полистироловых пластин. Заражают перевиваемую линию клеток фибробластов эмбриона человека цитомегаловирусом, штамм AD-169, который был получен из Американской коллекции вирусов и в настоящее время поддерживается в лаборатории диагностики вирусных инфекций НИИ вирусных препаратов Российской АМН СССР. Через 48-72 ч после заражения проводят выделение ядерной фракции клеток. Для этого инфицированные вирусом клетки отделяют от стекла раствором трипсина и однократно промывают фосфатно-буферным раствором pH 7.4 (ФСБ). Осадок клеток, разведенный в дважды дистиллированной воде, содержащей 2% фетальной телячьей сыворотки, инкубируют в течение 15 минут в ледяной бане. Затем добавляют равный объем 1% раствора неионного детергента (NP-40) и полученную смесь гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса. Ядра отделяют от цитоплазматических осколков центрифугированием через 22,5% раствор Ficoll 400, приготовленного на ФСБ, pH 7,4, при 1800 g в течение 15 мин при 4°C. Осадок однократно промывают ФСБ, pH 7,4, ресуспендируют в том же буфере и обрабатывают ультразвуком (три цикла по 30 с с интервалом между циклами в 1 мин). Полученный "ядерный" антиген, содержащий ранние белки ЦМВ, осветляют центрифугированием при 8000 g в течение 20 мин. Для получения иммуносорбента в лунки нечетных рядов (A, C, E, G) полистироловых 96-луночных микротитровальных пластин вносят по 100 мкл (0,1 мл) вирусного антигена в концентрации не менее 1 мкг на лунку. В лунки четных рядов (B, D, F, H) вносят по 100 мкл контрольного антигена, выделенного из незараженной культуры клеток тем же способом, что и вирусный антиген. Пластины, закрытые крышками, инкубируют при 4-10°С в течение 18-20 ч. После 3-кратного промывания дистиллированной водой, содержащей 2% твина-20, пластины с нагруженными антигенами хранят при 4-10°С до использования. Срок хранения иммуносорбента 6 мес.

Недостатком этого способа является короткий срок хранения предлагаемого иммуносорбента.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения иммуносорбента для диагностики вируса простого герпеса 1 типа, включающий шесть этапов - сорбция антигена, отмывка, лиофильная сушка в атмосфере азота, инкубация с блокирующим раствором, повторная лиофильная сушка в атмосфере азота и запайка планшетов в вакуумных пакетах, в качестве антигенов использованы высокоочищенные натуральные антигены ВПГ-1 штаммов MS и G, полученные на фирме Viro-Immun из разрушенных ультразвуком культур клеток почки обезьяны (Герпетическая инфекция (простой герпес). Этиология, эпидемиология, патогенез, клиника, лабораторная диагностика, лечение, С.Г. Марданлы, Г.И. Кирпичникова, В.А. Неверов. - Электрогорск: ЗАО «ЭКОлаб», 2011).

Недостатком этого способа является то, что в нем отсутствует стадия предварительной подготовки (активации) полимерного твердофазного носителя перед адсорбцией антигена, что приводит к увеличению расхода антигена при последующей обработке. Кроме того, практическое применение штаммов MS и G показало их нестабильность при хранении более 6 месяцев. Следует также отметить, что условия приготовления иммуносорбента оставляют возможность для неспецифического связывания компонентов реакционной смеси.

Цель и сущность изобретения

Целью настоящего изобретения явилось совершенствование способа получения иммуносорбента.

Сущность изобретения заключается в предварительной подготовке (активации) полимерного твердофазного носителя водным 20% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ-20), сушке с последующей адсорбцией на выделенных лунках планшета антигенов вируса герпеса 1 типа.

Далее проводят сорбцию 96-луночного разборного полистиролового планшета фирмы Nunc Maxi Sorp (Дания) в 0,2М карбонат-бикарбонатном буферном растворе с pH 9,6 лизатным высокоочищенным антигеном вируса герпеса 1 типа, приготовленным по следующей схеме: используют штамм вируса простого герпеса 1 типа McIntyre [коллекция АТСС -VR-539]. Вирус выращивается на культуре эпителиальных клеток почек зеленых мартышек Vero-B, предоставленных доктором Ходавандом, компания Viro-Immun, Германия. Данную культуру с посевной концентрацией 120 кл/мл выдерживают в «матрацах» при температуре 37±1°C в течение 4-х дней до образования плотного монослоя клеток. Затем вносят вирус герпеса 1-го типа в дозе 0,2 ТЦД (титр цитопатического действия) 90/клетку и проводят его адсорбцию. Зараженную культуру инкубируют 2 суток до полного разрушения монослоя в результате цитопатического действия вируса. С поверхности инфицированного клеточного монослоя удаляется ростовая среда и вносится фосфатно-солевой буферный раствор. После этого содержимое культурального флакона подвергают однократно замораживанию при -40°C и оттаиванию при комнатной температуре. Для окончательного высвобождения вируса из клеток данную вируссодержащую суспензию подвергают ультразвуковой обработке в течение 1 мин 30 с при частоте 20 Гц. Высокоскоростным центрифугированием (8000 об/мин, 30 мин, при 4±1°C) отделяют остатки разрушенных клеток (детрит), осадок удаляют, а полученный супернатант, содержащий антиген, замораживают при -70°C. Полученный таким способом антиген размораживается, разводится в КББ (карбонат-бикарбонатном буфере) до концентрации белка 2 мкг/мл, вносится в лунки по 100 мкл, инкубируется при температуре (22±4)°C в течение (20-24) часов, отмывается дистиллированной водой, обрабатывается блокирующим раствором и лиофильно высушивается на машине лиофильной сушки DELTA 1-24 LSK, при вакууме в 0,06 mbar в течение 3-х часов.

В качестве блокирующего неспецифические реакции раствора используется раствор следующего состава: вносят из расчета на 1 литр дистиллята трис(гидроксиметил)аминометана - 12,1 г, БСА (бычий сывороточный альбумин) - 5 г и сахарозы - 20 г, pH буферного раствора доводят до 7,2-7,3 соляной кислотой. Планшеты снова инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°C. Содержимое планшетов вытряхивают в контейнер для сброса, затем планшеты лиофильно сушат на машине DELTA 1-24 LSK в течение 3-х часов.

Готовые иммуносорбенты вкладывают в пакеты из алюминиевой фольги на полиэтиленовой основе (ламинат) или из полиэтиленовой пленки и размещают вертикально в камере машины лиофильной сушки DELTA 1-24 LSK. Выбирают режим в соответствии с инструкцией по эксплуатации. Режим сушки - main drying. Продолжительность сушки - от 3 до 20 часов. Вакуум - 0,06 mbar. После этого производят вакуумную запайку иммуносорбентов. Планшеты вкладывают по одной штуке в пакеты из алюминиевой фольги на полиэтиленовой основе (ламинат) или из полиэтиленовой пленки и запаивают с помощью устройства для вакуумной запайки планшетов. В течение процесса сушки периодически контролируют работу оборудования. По окончании сушки камеру заполняют очищенным азотом. Основные параметры процесса сушки иммуносорбента регистрируют в журнале учета работы лиофилизатора.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобную заявляемому изобретению. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию - новизна.

Использование натурального лизатного высокоочищенного антигена вируса герпеса 1 типа АТСС - VR-539 позволяет значительно повысить чувствительность анализа, специальная система блокировки на основе триса позволяет нейтрализовать нежелательные неспецифические реакции, которые могли бы возникнуть при использовании натуральных антигенов.

Кроме того, дополнительным техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является улучшение условий сохранения активности реагентов на поверхности твердофазного носителя (1 год в сравнении с 6 мес.), уменьшение расхода реагентов (за счет использования высокоиммуногенных белков в вирусном лизатном антигене). Использование полиэтиленгликоля при обработке планшета повышает специфичность и чувствительность набора.

Иммуносорбент, получаемый по предлагаемому способу, найдет широкое применение в здравоохранении, в частности в клинических лабораториях, для проведения химического, иммунохимического и иммунологического анализа и может быть использован для детектирования маркера вируса герпеса 1 типа. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.

Способ применения иммуносорбента осуществляется следующим образом.

Пример. Проведение анализа с использованием иммуносорбента, полученного по предлагаемому способу.

Вносят контрольные и исследуемые образцы (соблюдая указанную последовательность): в одну лунку (например, A1) - 100 мкл раствора для разведения образца (РРО); в две лунки (например, B1, C1) - по 100 мкл контрольного положительного образца (К⁺), в две лунки (например, D1, E1) - по 100 мкл контрольного «порогового» образца (К⁺ _пор), в две лунки (например, F1, G1) - по 100 мкл отрицательного контрольного образца (K^-), в следующие лунки - по 100 мкл рабочих разведений (1:100) исследуемых образцов (по 1 лунке на образец). При использовании вспомогательного планшета для разведения образцов в соответствующие лунки иммуносорбента вносят по 90 мкл РРО, а затем - по 10 мкл образцов, разведенных 1:10 в лунках вспомогательного планшета, тщательно перемешивают пипетированием. Планшет закрывают крышкой или клейкой пленкой. Инкубируют 30 мин при температуре от 21 до 25°C в защищенном от света месте. С помощью промывателя удаляют образцы из лунок, 4 раза промывают планшет промывочным раствором, внося в лунки 350-370 мкл раствора. При наличии промывателя, позволяющего производить промывку в режиме "Overflow", используют именно этот режим. По окончании промывки удаляют остатки влаги из лунок, постукивая планшетом по фильтровальной бумаге, положенной на полиэтиленовую пленку. Во все лунки вносят по 100 мкл конъюгата. Планшет закрывают крышкой или клейкой пленкой. Инкубируют 30 мин при температуре от 21 до 25°C в защищенном от света месте. С помощью промывателя удаляют жидкость из лунок, 4 раза промывают планшет. Во все лунки вносят по 100 мкл раствора индикаторного, немедленно помещают планшет в защищенное от света место и выдерживают 10-15 мин при температуре от 21 до 25°C. Во все лунки (в той же последовательности, с которой вносился индикаторный раствор) вносят по 100 мкл стоп-реагента, осторожно (постукиванием по планшету) перемешивают содержимое лунок и не более чем через 10 мин приступают к учету результатов.

Исследуемые образцы учитываются:

как положительные при ОП>1,1×ОП(К+пор),

как отрицательные при ОП<0,9×ОП(К+пор).

Образцы с ОП в пределах от 0,9×ОП(К+пор) до 1,1×ОП(К+пор), т.е. в так называемой "серой" зоне, рекомендуется исследовать повторно, поскольку результаты, полученные в ней, не могут быть однозначно интерпретированы.

При повторном получении указанного результата рекомендуется мониторинг наличия антител у пациента для исключения неспецифических реакций, которые также могут давать сомнительные результаты.

Проведенные нами испытания с использованием иммуносорбента по настоящему изобретению (с использованием лизатных натуральных антигенов АТСС-VR-539) и иммуносорбента (по прототипу) на клиническом материале и на сыворотках доноров показали более высокую чувствительность и специфичность. Данные результаты отражены в сводной сравнительной таблице 1 по чувствительности и специфичности ИФА.

Дополнительно хотелось бы отметить, что проведенные нами испытания установили, что заявленная технология приготовления иммуносорбента позволила добиться сохранения активности реагентов на поверхности твердофазного носителя в течение 1 года.

Таблица 1
Заявляемый иммуносорбент			«ИФА-ВПГ 1-IgG»
№ образца	Титр в ИФА (по калибр. графику)	Результат	№ образца	Титр в ИФА	Результат
396	160	Положительный	396	100	отрицательный
473	460	положительный	473	400	положительный
514	390	положительный	514	300	положительный
515	390	положительный	515	300	положительный
480	320	положительный	480	200	положительный
485	160	положительный	485	100	отрицательный
425	180	положительный	425	100	отрицательный
468	370	положительный	468	300	положительный
430	420	положительный	430	300	положительный
461	190	положительный	461	100	отрицательный
505	160	положительный	505	100	отрицательный
512	460	положительный	512	400	положительный
421	230	положительный	421	200	положительный
435	180	положительный	435	200	положительный
452	170	положительный	452	100	отрицательный
501	370	положительный	501	300	положительный
424	190	положительный	424	200	положительный
528	160	положительный	528	100	сомнительный
480	370	положительный	480	300	положительный
491	170	положительный	491	100	отрицательный
472	180	положительный	472	100	отрицательный
478	180	положительный	478	200	положительный
473	500	положительный	473	500	положительный
514	420	положительный	514	400	положительный
515	430	положительный	515	300	положительный
480	310	положительный	480	200	положительный
485	170	положительный	485	100	отрицательный
425	220	положительный	425	200	положительный
468	340	положительный	468	300	положительный
доноры
100 образцов		2 образца определены как положительные с титром 1:200	100 образцов		5 образцов определены как положительные с титром 1:200 (3 образца) и 2 образца с титром 1:300