синтетические олигонуклеотидные праймеры для идентификации вируса блютанга нуклеотипа с (6, 14 и 21 серотипы) методом от-пцр

Формула изобретения

Синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные участкам вариабельного 2-го сегмента генома вируса блютанга нуклеотипа С (6, 14 и 21 серотипы), используемые в ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации для идентификации вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов, имеющие следующий состав (5'-3'):

Прямой: GRAYATGRTGGATATWCCG

Обратный: GGCTGCACRTCCAYYGARTC

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления РНК вируса блютанга генетической группы (нуклеотипа С), объединяющей 6, 14 и 21 серотипы.

Известно, что геном вируса состоит из 10 сегментов дцРНК, упакованных в икосаэдрический нуклеокапсид, состоящий из семи структурных белков [1-3]. Внешний слой капсида представлен двумя белками VP2 и VP5, которые имеют высокую степень гетерогенности аминокислотной последовательности, одинаково как между, так и внутри каждого серотипа [4]. Серотип вируса детерминирован VP2 белком, который имеет нейтрализующие эпитопы вируса [5].

VP2 белок кодирует 2 сегмент генома вируса. C помощью филогенетического анализа более 300 изолятов вируса блютанга по сегменту 2 генома установили их разделение на 26 групп или кладов, точно отражающих серотип вируса, с менее 33% нуклеотидных изменений впоследовательности относительно каждого серотипа, и от 29% до 59% замен между серотипами [4]. Однако некоторые серотипы вируса генетически наиболее близко связанны, чем другие, что позволяет сгруппировать их в 12 различных нуклеотипов, стандартно они обозначаются буквами A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L и имеют от 29% до 33% нуклеотидных различий между вирусами, принадлежащими к разным серотипам, но одному и тому же нуклеотипу по 2 сегменту. Серотипы вируса, представляющие один нуклеотип, по 2 сегменту также могут иметь близкое антигенное родство [4].

Сейчас известно о наличии 26 генетических вариантов вируса, 25 из которых в антигенном отношении представляют различные серотипы вируса.

Данные молекулярной эпидемиологии говорят о высокой генетической гетерогенности его популяции, которая позволяет разделить вирусы на типы, топотипы, квазитипы. Уже известно более 300 вариантов вируса, генетически отличающихся друг от друга.

В настоящее время широко применяются тесты, основанные на ОТ-ПЦР, в режиме реального времени для идентификации отдельных серотипов, что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае дифференцировать серотип вируса [8; 9]. Однако при появлении вспышек заболевания, вызванных новым серотипом, т.е. тем, который ранее не регистрировали на территории, возникает ряд сложностей. В связи с тем, что серотипов вируса 25, необходимо проводить соответственно 25 серотипспецифических реакций.

Проведенный анализ нуклеотидных последовательностей 2 сегмента генома вируса блютанга показал, что существует возможность разработать нуклеотипспецифические олигонуклеотидные праймеры для классического варианта ПЦР (с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза) с целью обнаружения одной из генетических групп вируса, что существенно ускоряет и упрощает процесс типирования каждого нового изолята вируса. Аналоги не опубликованы и не представлены на коммерческом рынке ни за рубежом, ни в нашей стране.

Целью изобретения являлась разработка пары олигонуклеотидных праймеров для идентификации вируса блютанга нуклеотипа С методом ОТ-ПЦР.

Изобретение - олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа C, а именно участка нуклеотидной последовательности 2 сегмента генома вируса блютанга 6, 14 и 21 серотипов методом ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Процедура анализа включает следующие этапы:

1. Денатурация дцРНК вируса блютанга.

2. Обратная транскрипция - синтез кДНК.

3. ПЦР.

4. Электрофоретическая детекция продуктов амплификации.

Денатурацию дцРНК осуществляют при температуре 95°C в течение 5 минут в реакционной смеси с нуклеотипспецифической парой олигонуклеотидных праймеров, фиксируют денатурированную РНК путем замораживания. Синтез кДНК осуществляют при температуре 42°C в течение 30 минут в реакционной смеси для обратной транскрипции, включающей дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (ДНТФ), буфер для обратной транскрипции и фермент ревертазу (обратную транскриптазу). 3атем реакцию терминируют при 88°C в течение 5-ти минут. кДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции. Готовят стандартную смесь для ПЦР, включающую буфер для ПЦР, ДНТФ, пару олигонуклеотидных нуклеотипспецифических праймеров, и фермент ДНК-полимеразу. Профиль реакции следующий: удержание температуры - 95°C - 3 мин; циклирование: 95°C - 15 с, 58°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторяют 45 раз. Анализ результатов ПЦР проводят методом электрофореза в агарозном геле. Готовят 2% TAE-гель с добавлением бромистого этидия 0,5 мкг/мл. Электрофорез проводят при не более 8 В/см в течение 20 мин. Результаты электрофореза учитывают с помощью трансиллюминатора в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся полос на уровне 210 п.о. относительно маркера молекулярного веса. Для сохранения результатов реакции используются гель-документирующие системы.

Выбор и анализ нуклеотипспецифических праймеров (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «BioEdit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей 2-го сегмента референтных штаммов и изолятов 26 (1-26) серотипов вируса, опубликованных в GenBank.

Таблица 1
Нуклеотипспецифические олигонуклеотидные праймеры для выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6,14 и 21 серотипы)
ПЦР-мишень	наименование праймера	нуклеотидная последовательность (н.п.), 5'-3'	локализация на н.п.2 сегмента
			RSArrrr/6, (AJ585127)	RSArrrr/14, (AJ585135)	RSArrrr/21, (AJ585142)
2 сегмент	прямой	gRAYATgRTggATATWCCg	149-167	149-167	149-167
	обратный	GGcTGcAcRTccAYYGARTc	339-358	339-358	339-358

Техническим результатом изобретения является возможность определения генетической группы - нуклеотипа C вируса блютанга с помощью ОТ-ПЦР, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по определению серотипа вируса блютанга в образцах исследуемого биологического материала.

Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных нуклеотипспецифических олигонуклеотидных праймеров проводят ОТ-ПЦР, позволяющую выявить РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6, 14 и 21 серотипы).

Пример конкретного выполнения

Выявление РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6, 14 и 21 серотипы) в образцах биологического материала: культуральный материал вируса из музея штаммов микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, образцы интактных культур клеток, кровь от интактных животных и культуральный материал гетерологичных вирусов.

Из представленных образцов с использованием реагента Тризол (Invitrogen) и согласно инструкции производителя были выделены нуклеиновые кислоты. Далее препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации дцРНК. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препарат кДНК в количестве 10 мкл использовали для постановки собственно ПЦР (результаты представлены в таблице 2).

Проведение реакции обратной транскрипции

В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации дцРНК, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата выделенных нуклеиновых кислот. Реакцию денатурации проводят при температуре 95°C в течение 5 минут. Далее необходимо поместить пробирки в условия с отрицательной температурой, для этого используют штатив с хладагентом.

Готовят смесь для обратной транскрипции, для этого на одну пробу в отдельной пробирке смешивают 9,8 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки с денатурированной РНК вносят по 10 мкл смеси для обратной транскрипции с ферментом. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°C в течение 30 минут. После окончания реакции кДНК используют для постановки ПЦР.

Проведение ПЦР

В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 13 мкл смеси для ПЦР, 2 мкл смеси праймеров и 0,2 мкл Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 15 мкл в пробирки, объемом 0,6 или 0,2 см³, на поверхность смеси вносят воск в объеме 25 мкл. В подготовленные для ПНР пробирки на воск вносят по 10 мкл кДНК. Профиль реакции:

1. Удержание температуры - 94°C - 3 мин.

2. Циклирование: 94°C - 15 с, 58°C - 15 с, 72°C - 15 с.

Цикл повторить 40 раз.

3. Хранение - 4°C.

Анализ продуктов амплификации ПЦР методом электрофореза

Приготовление геля агарозы: взвешивают 2,0 г агарозы, помещают в стеклянную посуду, заливают 100 мл рабочего 1ХТАЕ - буфера и доводят до кипения в микроволновой печи для полного растворения агарозы. Охлаждают раствор агарозы до температуры примерно 60-65°C и заливают в специальную форму с гребенкой, дают гелю затвердеть. После этого гребенку осторожно вынимают и форму с агарозным гелем переносят в камеру для горизонтального электрофореза. Заливают в камеру рабочий 1XTAE-буфер так, чтобы он покрывал гель на 5-10 мм.

Проведение электрофореза: из пробирок с исследуемыми образцами после завершения ПЦР отбирают из-под масла по 12 мкл реакционной смеси и вносят в лунки агарозного геля, в последнюю лунку вносят 5 мкл маркера молекулярной массы. Электрофорез проводят при не более 8 В/см в течение 20 мин. Направление движения образцов в геле от "-" к "+". Длину амплифицированного фрагмента определяют в соответствии с маркером молекулярной массы (100-1000 пар оснований) и положительным контролем.

Результаты электрофореза учитывают на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся полос. Для сохранения результатов реакции используются гель-документирующие системы.

Положительными считаются пробы, полосы в которых располагаются в геле на таком же расстоянии от старта, что и полоса положительного контроля. Размер фрагмента, синтезируемого в ПЦР, составляет 210 пар оснований. Исследуемые пробы считаются отрицательными, если в них не выявлено никаких полос или полосы не соответствуют размеру фрагмента в контрольной пробе (т.е. располагаются на другом расстоянии от старта). Результаты ОТ-ПЦР с использованием разработанной нуклеотипспецифической системы олигонуклеотидов представлены в таблице 2.

Таблица 2
Результаты выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6, 14 и 21 серотипы) методом ОТ-ПЦР с использованием разработанной пары олигонуклеотидов
№ № проб	Характеристика биоматериала	Результат ОТ-ПЦР
1	культуральный вирус блютанга 1 серотип, RSArrrr/01 (AJ585122) референтный штамм	-
2	культуральный вирус блютанга 2 серотип, RSArrrr/02 (AJ585123) референтный штамм	-
3	культуральный вирус блютанга 3 серотип, RSArrrr/03 (AJ585124) референтный штамм	-
4	культуральный вирус блютанга 4 серотип, RSArrrr/04 (AJ585125) референтный штамм	-
5	культуральный вирус блютанга 5 серотип, RSArrrr/05 (AJ585126) референтный штамм	-
6	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 6 серотип, RSArrrr/06 (AJ585127)референтный штамм	+

7	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 7 серотип, RSArrr/07 (AJ585128)референтный штамм	-
8	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 8 серотип, RSArrrr/08 (AJ585129)референтный штамм	-
9	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 9 серотип, RSArrrr/09 (AJ585130)референтный штамм	-
10	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 10 серотип, RSArrrr/10 (AJ585131) референтный штамм	-
11	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 11 серотип, RSArrrr/11 (AJ585132) референтный штамм	-
12	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 12 серотип, RSArrrr/12 (AJ585133) референтный штамм	-
13	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 13 серотип, RSArrrr/13 (AJ585134) референтный штамм	-
14	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 14 серотип, RSArrrr/14 (AJ585135) референтный штамм	+
15	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 15 серотип, RSArrrr/15 (AJ585136)референтный штамм	-
16	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 16 серотип, RSArrrr/16 (AJ585137)референтный штамм	-
17	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 17 серотип, RSArrrr/17 (AJ585138)референтный штамм	-
18	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 18 серотип, RSArrrr/18 (AJ585139)референтный штамм	-
19	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 19 серотип, RSArrrr/19 (AJ585140)референтный штамм	-
20	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 20 серотип, RSArrrr/20 (AJ585141)референтный штамм	-
21	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 21 серотип, RSArrrr/21 (AJ585142)референтный штамм	+
22	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 22 серотип, RSArrrr/22 (AJ585143)референтный штамм	-

23	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 23 серотип, RSAnrr/23 (AJ585144)референтный штамм	-
24	лиофилизированный культуральный вирус блютанга 24 серотип, RSArrrr/24 (AJ585145)референтный штамм	-
25	культуральный вирус блютанга 26 серотип, KUW2010/02 (HM590642)	-
26	интактная культура клеток Vero	-
27	интактная культура клеток ВНК-21	-
28	кровь от интактного животного (корова)	-
29	кровь от интактного животного (овца)	-
30	культуральный вирус ЭГБО, штамм «Нью-Джерси»	-

Таким образом разработана нуклеотипспецифическая пара олигонуклеотидных праймеров, позволяющая с помощью классической ОТ-ПЦР выявить РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6, 14 и 21 серотипы).

Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:

- специфичность и чувствительность способа выявления РНК вируса блютанга нуклеотипа C (6, 14 и 21 серотипы) с помощью ОТ-ПЦР, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности 2-го сегмента генома вируса блютанга группы серотипов;

- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала;

- относительная дешевизна метода, благодаря использованию ОТ-ПЦР для идентификации нуклеотипа.

Источники информации

1. Clinical aspects linked with the emergence of bluetongue in cattle in northern Europe: results of a two month longitudinal study/ C. Saegerman, A. Mauroy, H. Guyot// Rene. Rech. Ruminants. - 2007. - Vol.14. - P.215.

2. The dsRNA viruses/ P.P.C. Mertens// Virus Res. - 2004. -Vol.101. - P.3-13.

3. Bluetongue virus assembly and morphogenesis/ P. Roy, R. Noad// Curr Top Microbiollmmunol. - 2006. - Vol.309. - P.87-116.

4. Analysis and phylogenetic comparisons of full-length VP2 genes of the 24 bluetongue virus serotypes / S. Maan, N.S. Maan, A.R. Samuel, S. Rao, H. Attoui, P.P.C. Mertens// J Gen Virol. - 2007. - Vol.88. - P. 621-630.

5. Assignment of the genome segments of Bluetongue Virus Type-1 to the proteins which they encode/ P.P.C. Mertens, F. Brown, D.V. Sangar// Virology. - 1984. - Vol.135. - P.207-217.

6. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two differ-ent genomic segments/ J. F. Toussaint, C. Sailleau, E. Breard, S. Zientara, K. De Clercq// J. Virol. Methods. - 2007. - Vol.140. - P.115-123.

7. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment 1/ A.E. Shaw, P. Monaghan, H.O. Alpar, S. Anthony, K.E. Darpel, C.A. Batten, A. Guercio, G. Alimena, M. Vitale, K. Bankowska, S. Carpenter, H. Jones, C.A.L. Oura, D.P. King, H. Elliott, P.S. Mellor, P.P.C. Mertens// Journal of Virological Methods. - 2007. - Vol.145. - P.115-126.

8. Emergence of Bluetongue Serotypes in Europe, Part 1: Description and Validation of Four Real-Time RT-PCR Assays for the Serotyping of Bluetongue Viruses BTV-1, BTV-6, BTV-8 and BTV-11/ F. Vandenbussche, I. De Leeuw, E. Vandemeulebroucke and K. De Clercq// TransboundEmerg Dis. - 2009. - Vol.56 (9-10). - P.346-54.

9. Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Assays Specifically Detecting Bluetongue Virus Serotypes 1, 6, and 8/ B. Hoffmann, M. Eschbaumer, and M. Beer// Journal of Clinical Microbiology. - 2009. - Vol.47. - P.2992-2994.