реагент, позволяющий инактивировать микроорганизмы, экстрагировать и сохранять днк бактерий в форме, пригодной для высокоэффективной молекулярной диагностики
| Классы МПК: | G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) |
| Автор(ы): | Варламов Дмитрий Александрович (RU), Сочивко Дмитрий Гарриевич (BY), Аляпкина Юлия Сергеевна (RU), Кузубов Алексей Владимирович (RU), Черноусова Лариса Николаевна (RU), Смирнова Татьяна Геннадьевна (RU), Ларионова Елена Евгеньевна (RU), Андреевская Софья Николаевна (RU), Нестеренко Владимир Георгиевич (RU), Милитицкий Виктор Вениаминович (RU), Суслов Анатолий Петрович (RU), Макарова Наталия Юрьевна (RU) |
| Патентообладатель(и): | Общество с ограниченной ответственностью "НИАРМЕДИК ПЛЮС" (RU) |
| Приоритеты: |
подача заявки:
2013-08-20 публикация патента:
10.02.2016 |
Изобретение относится к области медицины, а именно к реагенту для предварительной подготовки биологического образца in vitro диагностике инфекционного заболевания. Реагент для предварительной подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР представляет собой водный раствор, содержащий спирт, щелочь и третичный амин в концентрациях, обеспечивающих повышение эффективности амплификации не менее чем на 2 цикла. Способ предварительной подготовки биологического образца. Способ хранения биологического образца. Применение реагента для предварительной подготовки биологического образца. Использование заявленного реагента позволяет эффективно очистить клетки от ингибиторов ПЦР-реакции, инактивировать микроорганизмы в биологических образцах, осуществить их разжижение с сохранением стабильности ДНК, обеспечив повышение амплификации не менее чем на 2 цикла. 4 н. и 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 1 пр.
Формула изобретения
1. Реагент для предварительной подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР, представляющий собой водный раствор, содержащий спирт, щелочь и третичный амин в концентрациях, обеспечивающих повышение эффективности амплификации не менее чем на 2 цикла.
2. Реагент по п. 1, который содержит 40% изопропанол, 0,2 М (2,4%) NAOH и 0,075-0,3% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламин.
3. Способ предварительной подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР, предусматривающий обработку реагентом по п. 1 или 2 в течение не менее 1 часа.
4. Способ хранения биологического образца, пригодного для in vitro диагностики инфекционного заболевания методом ПЦР, предусматривающий осуществление способа по п. 3.
5. Применение реагента по п. 1 или 2 для предварительной подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР и хранения указанного биологического образца.
Описание изобретения к патенту
Область изобретения
Изобретение относится к области биохимии, химии и медицины и касается разработки реагента для предварительной подготовки биологических образцов к in vitro диагностике инфекционных заболеваний молекулярно-генетическим методом.
Предпосылки изобретения
В настоящее время заболеваемость инфекционными заболеваниями остается очень высокой, а их распространенность - глобальной. До сих пор в мире ежегодно регистрируется свыше 1 миллиарда случаев инфекционных болезней желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей. Например, заболеваемость гриппом в отдельные годы составляет свыше 10-15% населения только в странах Европы и Америки. Еще 75 млн человек переносят другие острые респираторные инфекции (ОРЗ). Во время пандемий грипп приобретает характер стихийного бедствия, нанося странам огромный экономический ущерб.
Каждый год в мире регистрируется несколько десятков миллионов случаев заболеваний, вызванных стрептококками (ангины, скарлатина, рожа и другие). Широко распространена холера, которая в последние годы регистрируется более чем в 30 странах мира. В мире насчитывается более 400 млн больных трахомой и 11 млн больных проказой. Продолжает расти заболеваемость вирусными гепатитами.
В условиях, когда отступили самые массовые и тяжелые инфекции, в структуре инфекционной патологии стали более заметными болезни, которые вызываются условно-патогенными микроорганизмами и даже обычными «нормальными» обитателями организма человека.
В последние годы в разряд инфекционных перешли болезни, ранее к таковым не относившиеся. Имеется в виду почти неизвестная ранее группа очень своеобразных «медленных» инфекций. Так, отечественными исследователями М.С. Маргулисом, В.Д. Соловьевым, А.К. Шубладзе, Е.Н. Бычковой была доказана вирусная природа тяжелых болезней центральной нервной системы - острого энцефаломиелита человека и рассеянного склероза.
В соответствии с информацией ВОЗ, около 2 миллиардов людей, треть общего населения Земли, инфицировано M. tuberculosis. В настоящее время туберкулезом ежегодно заболевает 9 миллионов человек во всем мире, из них 3 миллиона умирают от его осложнений.
Проблемы борьбы с туберкулезом прежде всего заключаются в ранней диагностике этого заболевания, своевременно начатом лечении и проведении комплекса профилактических мероприятий в «очаге туберкулезной инфекции».
Существующие методы лабораторной диагностики инфекционных заболеваний не отвечают потребностям клинической практики.
Быстрый метод бактериоскопии обладает низкой чувствительностью, так для обнаружения микобактерий туберкулеза (МБТ) в 1 мл патологического материала должно содержаться не менее 100000 клеток возбудителя. Люминесцентная микроскопия увеличивает чувствительность бактериоскопии на 10-30% и позволяет обнаружить 3000-10000 клеток возбудителя. Чувствительность бактериологического посева на плотные питательное среды в настоящее время остается золотым стандартом и составляет 50-100 МБТ. Однако по продолжительности это исследование составляет не менее 2 месяцев.
В этой связи разработка и внедрение в практику эффективных методов выявления и этиологического подтверждения этого заболевания, а также других инфекционных заболеваний приобретают первостепенное значение в современной клинической практике.
Одним из наиболее перспективных методов обнаружения возбудителей инфекционных заболеваний является метод обнаружения ДНК возбудителей с помощью полимеразой цепной реакции (ПЦР).
ПЦР-диагностика позволяет выявить инфекционные заболевания, в частности туберкулез, в несколько раз быстрее, чем бактериологический метод. С другой стороны, с помощью ПЦР можно осуществлять эпидемиологический контроль за бактериовыделителями и тем самым решать вопросы продолжения антибактериального лечения для каждого конкретного случая, несмотря на кажущуюся клинико-рентгенологическую стабилизацию специфического процесса.
Обнаружение ДНК микроорганизмов методом ПЦР применяется в составе комплексной диагностики инфекционных заболеваний, позволяет быстро определить наличие специфического возбудителя и разработать эффективные клинические и эпидемиологические мероприятия в отношении больного.
Метод ПЦР обеспечивает высокую чувствительность и специфичность (подавляющее число производителей подобных тестов гарантируют чувствительность выше 95%, специфичность выше 98%).
В этой связи этот метод может быть использован как скрининговый при диагностике инфекционного заболевания, определении политики лечения, контроля его качества и оценке эпидемической значимости больного.
Время, затрачиваемое на определение ДНК инфекционных агентов, составляет 4-5 часов.
В случае массового скрининга больных на инфекционные заболевания, включая определение лекарственной устойчивости, с учетом внедрения автоматизированных (роботизированных) платформ для пробоподготовки, количество образцов может возрастать до 300 и более (при норме нагрузки 36 образцов обычной бактериологической лаборатории) за рабочий день, что свидетельствует о возможности концентрации большого количества биологически опасного материала в одном месте.
Кроме того, существенным препятствием для широкомасштабного скрининга на инфекционные заболевания является то, что экстракция ДНК из биологических образцов должна быть проведена в течение 48 часов после забора материала. Это обстоятельство предполагает ограничения для проведения скрининга и делает доставку и транспортировку материла (в течение указанного времени) чрезвычайно дорогостоящей и трудоемкой, особенно при реализации исследований, проводимых в дальних труднодоступных регионах. В случае забора биологических образцов, их доставки и последующего хранения свыше указанного срока образцы должны быть заморожены. Размораживание-замораживание образцов не допустимо из-за возможности разрушения в них ДНК, что существенно ограничивает скрининг на инфекционные заболевания, даже при наличии высокоспециализированной сети ПЦР-лабораторий (в доступных источниках не описан способ (кроме заморозки) доставки и транспортировки).
При обработке и исследовании биологического материала в ПЦР-лабораториях создается высокий риск инфицирования сотрудников и объектов окружающей среды. Несмотря на существующие меры противоэпидемической защиты в соответствии с действующими нормативно-методическими документами разработаны комплексные меры защиты персонала лабораторий. Заболеваемость персонала лабораторий, осуществляющих диагностику туберкулеза, остается чрезвычайно высокой и в 6-10 раз превышает таковую среди общего населения. Лекарственная устойчивость микобактерий среди сотрудников противотуберкулезной службы существенно превышает уровень лекарственной устойчивости среди общего населения и доходит до 50%. Лекарственная устойчивость среди других инфекционных заболеваний неуклонно возрастает по данным государственной статистики.
Образцы мокроты, поступающие в лаборатории на исследования, отличаются высоким содержанием инфекционного агента (от 5000 до 1000000 микроорганизмов в 1 мл материала). Манипуляции, производимые в лабораториях, даже при наличии средств защиты, являются несомненным фактором риска заражения медицинского персонала, поскольку при обработке данного материала формируется аэрозоль, который может содержать до 1000000 микроорганизмов.
Опасность также представляют транспортировка и хранение биологического материала, для которых требуются специальные условия по безопасности в определенный временной промежуток.
В настоящее время широко распространена ПЦР-диагностика различных возбудителей в крови. Однако, даже при самых серьезных заболеваниях, возбудитель достаточно редко определяется в крови (за исключением инфекций, передаваемых через кровь), что свидетельствует о необходимости исследования других биологических материалов, взятых у больных, с целью этиологического подтверждения диагноза.
Вместе с тем, биологический материал, полученный у больных, такой как мокрота, биоптаты, спинно-мозговая жидкость и тому подобное, содержит достаточно много биологических примесей, таких как кровь, гной, разнообразные белковые субстанции, которые в свою очередь являются ингибиторами ПЦР-реакции и не позволяют эффективно выделить ДНК возбудителя.
Разработка методов предварительной подготовки биологических образцов, позволяющих в последующем проводить эффективную экстракцию ДНК на основе очищения микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции на стадии подготовки самого биологического образца, одновременно инактивировать микроорганизмы, разжижать образец и проводить данную подготовку однократным добавлением реагента к биологическому образцу (без дополнительных стадий смешения различных ингредиентов) и в последующем эффективно экстрагировать ДНК, хранить и транспортировать данный образец в течение длительного периода времени в целях проведения текущих и дальнейших исследований (на определение лекарственной устойчивости микроорганизмов), является важной задачей, позволяющей одновременно проводить качественную и быструю диагностику инфекционных заболеваний, эффективное лечение больного и осуществлять противоэпидемические мероприятия, направленные на защиту персонала лабораторий.
Наиболее сложными в отношении инактивации являются микобактерии туберкулеза. Благодаря особому химическому строению микобактерии туберкулеза обладают значительной устойчивостью к физическим и химическим агентам. Во влажной мокроте микобактерии выдерживают нагревание в течение 30 минут при 75ºС, при кипячении погибают через 5 минут. В выделенной мокроте МБТ погибают при 100ºС через 45 минут. В мокроте, выделенной и сохраняемой в темноте при комнатой температуре, жизнеспособность палочек сохраняется не менее 4 месяцев, в рассеянном свете они погибают через 1-11/2 месяца. В суховоздушной камере при увлажнении и температуре 80ºС МБТ выживают в течение 2 часов. Во внешней среде микобактерия туберкулеза достаточно устойчива. В уличной пыли МБТ сохраняются до 10 дней, на страницах книг - до 3 месяцев. В воде она может сохраняться до 150 дней. Высохшие микобактерии вызывают туберкулез у морских свинок через 1-1,5 года, лиофилизированные и замороженные жизнеспособны до 30 лет.
Существуют физические и химические способы инактивации микроорганизмов, к числу которых следует отнести кипячение, использование дезинфектантов, спиртов (этилового и изопропилового), четвертичных аммониевых соединений, гуанидиновых производных, альдегидов, третичных аминов. Устойчивость МБТ к физическим и химическим факторам обусловлена особенностью строения ее наружной мембраны.
С липидной фракцией внешней оболочки МБТ связывают устойчивость возбудителей туберкулеза к кислотам, щелочам и спиртам.
Известно, что гидроксид натрия (NaOH) обладает хорошим разжижающим эффектом. Этот реагент широко используется в пробоподготовке материала, особенно мокроты, полученной у больных туберкулезом, с целью его разжижения. Известно, что помимо разжижающего эффекта щелочь в концентрации более 2% способствует гибели клеток.
Обычно очистка от ингибиторов ПЦР-реакции проводится на стадии выделения ДНК, что предполагает лизис микробной клетки, выход ДНК в супернатант и ее смешивание с ингибиторами ПЦР-реакции, для чего требуются вспомогательные методы для дополнительного отделения искомой ДНК от других субстанций и ее последующая очистка и концентрация. В этой связи существующие методы выделения ДНК не обеспечивают достаточную чувствительность и специфичность ПЦР-анализа.
В доступных источниках описаны различные способы инактивации микроорганизмов, включая МБТ, к которым относятся кипячение, использование щелочей, органических растворителей, спиртов, детергентов и дезинфектантов.
Известны биоцидные моющие составы на основе N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламина, содержащие N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламин (ЕР 333143, 20.09.89), предназначенные для дезинфекции помещений и оборудования, но не предназначенные для использования в молекулярной диагностике.
Известно дезинфицирующее противомикобактиральное средство на основе N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламина и воды, содержащее, кроме N,N-бис-(3-аминопропил)лауриламина и воды, хлорид дидецилдиметиламмония, этоксилаты жирных спиртов С 8-С12, N-(лауриламинопропилен)глицин, додецилгуанидинацетат, метилендиаминтетраацетат натрия, хлорид лаурилдиметилбензиламмония, сульфаты жирных спиртов С12-С14, децилсульфонат, этанол, изопропиловый спирт (ЕР 343605, 29.05.89). Эти средства обладают бактерицидными свойствами, однако их использование в ПЦР-реакциях не предусматривается, они используются только в составе моющих средств при дезинфекции помещений и эндоскопического оборудования.
Описан инактивирующий реагент, входящий в состав диагностической системы GeneXpert. Составляющие этого инактивирующего реагента авторами не раскрыты. Однако в инструкции для пользователя и в многочисленных публикациях авторов сообщается, что инактивация МБТ ограничивается 100 клетками, полная инактивация образцов не гарантирована.
Известен раствор для инактивации микобактерий в биологическом образце, содержащий гидроксид натрия и изопропанол (Journal of Clinical Microbiology, Jan., 2010, p.229-237). Использование этого инактивирующего реагента, как отмечают сами авторы, не приводит к полной инактивации образца, а лишь снижает концентрацию микобактерий в образце до >2 КОЕ/мл.
Известен реагент для инактивации или деконтаминации микобактерий в клинических образцах, содержащий изотиоцианат гуанидина, Tris-Cl, N-лаурил саркозил, ЭДТК, меркаптоэтанол и ацетат аммония (патент RU 2338789, 20.01.08; заявка 2006124570). Использование этого раствора позволило авторам достигнуть чистоты выделенной ДНК. Вместе с тем, обработка клинических образцов этим раствором не приводит к адекватной концентрации ДНК в образце, что существенно снижает чувствительность ПЦР-анализа. Описанный реагент используется в модифицированном буфере для лизиса, который позволяет провести инактивацию образца на данной конкретной стадии. Обработка клинического образца данным реагентом приводит к лизису микобактериальной клетки и позволяет оптимизировать стадии очистки ДНК. Для разжижения образца по настоящему изобретению применяются вспомогательные стадии обработки щелочью средней силы и муколитическим средством. Авторы не сообщают об эффективности выделения ДНК с использованием описанного реагента и не указывают на возможность использования данного реагента для хранения и транспортировки образцов, а также о сохранении стабильности инактивированного образца со временем.
Таким образом, в литературе описаны многочисленные исследования, касающиеся использования различных реагентов для инактивации микроорганизмов в биологических (клинических) образцах. Однако ни в одном из них не рассматривается возможность использования такого реагента для комплексной подготовки биологических (клинических) образцов для ПЦР-исследования, включая очищение от ингибиторов ПЦР-реакции на стадии подготовки самих образцов, инактивацию, разжижение, возможность безопасной транспортировки, хранения клинических образцов и сохранения стабильности ДНК в данных образцах в течение длительного периода времени.
Цель изобретения
Основной целью изобретения является разработка реагента для предварительной подготовки биологического образца в форме, пригодной для in vitro диагностики инфекционных заболеваний молекулярно-генетическим методом.
Другая цель изобретения относится к дизайну реагента, позволяющего одновременно провести комплексную подготовку образца, включающую очищение микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции, инактивацию и разжижение биологического образца.
Еще одна цель изобретения относится к разработке метода безопасной транспортировки клинических образцов в связи с поддержанием стабильности сохраняемой ДНК в клинических образцах (после получения образцов до поступления в скрининговую лабораторию может пройти до 4 суток).
Еще одной целью изобретения является безопасное хранение клинических образцов за счет их консервации в новом реагенте в случае необходимости проведения дополнительных ПЦР-исследований, в частности, для динамических наблюдений за больным на состояние носительства, определения лекарственной устойчивости МБТ и контроля качества лечения.
Еще одна цель изобретения заключается в возможности сохранения самого реагента в подходящей таре, в частности, в пластиковой или стеклянной, в течение не менее 1 года для использования с сохранением стабильности всех его параметров.
Еще одной целью изобретения является возможность сокращения времени подготовки биологического образца с помощью его однократного добавления к биологическому материалу.
Сущность изобретения
В одном аспекте изобретение относится к реагенту для подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР. Реагент представляет собой водный раствор, содержащий спирт, щелочь и третичный амин в концентрациях, обеспечивающих повышение эффективности амплификации не менее чем на 2 цикла.
Совокупность признаков реагента обеспечивает комплексную подготовку биологических образцов, включающую очистку, отмывку микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции, инактивацию, разжижение и сохранение стабильности ДНК в течение не менее 3 месяцев, что позволяет безопасно транспортировать и хранить клинические образцы, а также использовать их для последующих исследований.
В некоторых случаях допустимо снижение содержания щелочи в составе реагента, что приводит к снижению коррозийных свойств, увеличивает срок годности реагента, упрощает условия хранения и использования, при этом не отмечается снижения эффективности пробоподготовки.
В другом аспекте изобретение относится к способу подготовки биологического образца к in vitro диагностике инфекционного заболевания методом ПЦР, предусматривающему обработку его реагентом в течение не менее 1 часа.
Также изобретение относится к способу хранения биологического образца, пригодного для in vitro диагностики инфекционного заболевания методом ПЦР, предусматривающему обработку его реагентом в течение не менее 1 часа. Предложенный способ хранения позволяет повысить выход исследуемой ДНК после 4 дней и до 3 месяцев хранения.
Подробное описание изобретения
Авторами настоящего изобретения получен реагент для предварительной подготовки биологических образцов, таких как мокрота, спинно-мозговая жидкость, биоптаты тканей и другие, в форме, пригодной для in vitro диагностики инфекционных заболеваний молекулярно-генетическим методом вследствие очищения микробных клеток от ингибиторов ПЦР-реакции на стадии подготовки данных образцов, инактивации микроорганизмов, в том числе микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ), в биологических (клинических) образцах, разжижения образцов и сохранения стабильности ДНК в биологических образцах для проведения последующих исследований (после добавления реагента и экспозиции биологического материала в течение от не менее 1 часа до 4 суток). Возможность исследования данного биологического образца сохраняется в течение не более 3 месяцев. Кроме того, хранение реагента в стеклянной или пластиковой таре (полипропилен) в течение года обеспечивает сохранение и стабильность всех составляющих реагента, возможность его использования в течение данного времени, а также транспортировку к месту сбора биологических образцов. В связи с применением реагента (однократного добавления к биологическому материалу) и экспозиции не менее 1 часа сокращается время подготовки биологического образца (особенно мокроты) для ПЦР-диагностики по меньшей мере на 2-3 часа.
В состав реагента входят:
1. Спирт, например изопропанол. Использование изопропилового спирта позволяет снизить поверхностное натяжение на границе дезинфектант - клеточная мембрана микроорганизма, повысить проникновение действующих веществ (дезинфектанта) в клеточные структуры микроорганизма, что, в свою очередь, позволяет быстрее достигать инактивации микроорганизма и использовать для этого меньшие концентрации дезинфицирующего средства. Известно, что при равных концентрациях раствор изопропилового спирта проявляет большую бактерицидную активность, чем раствор этилового спирта.
2. Третичный амин, например N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина. В ходе проведенных исследований было неожиданно установлено, что третичный амин в сочетании со спиртом обеспечивает очистку микробных клеток и избавляет их от прилипших ингибиторов ПЦР-реакции, при этом не оказывая разрушающего действия на клеточную стенку и способствуя сохранению стабильности ДНК и облегчая ее экстракцию при дальнейшем исследовании.
3. NaOH в качестве разжижающего агента.
Были получены различные варианты реагента (изменялись соотношения компонентов, входящих в его состав) и изучена их активность. Подбор количественного соотношения компонентов, входящих в состав реагента, находится в компетенции специалиста в данной области и зависит от вида биологического образца, исследуемого на наличие того или иного патогенного или условно-патогенного инфекционного агента.
Изучение активности различных вариантов состава реагента
В этой связи, в соответствии с различиями в концентрациях были исследованы растворы А, В, С, D (таблица 1) и обычный метод - кипячение.
| Таблица 1 Состав растворов, используемых в работе | |
| Раствор | Состав раствора |
| A | Изопропанол 40%, 0,2М (2,4%) NaOH, 0,075% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина |
| B | Изопропанол 40% |
| C | Н-Бутанол 20% |
| D | Н-Бутанол 20%, 0,2М (4%) NaOH |
Были исследованы образцы, полученные у больных с диагнозом туберкулез легких. Из каждого образца был сделан мазок, который красили люминесцентными красителями для выявления кислотоустойчивых палочек. Во всех образцах были обнаружены кислотоустойчивые бациллы. Образцы мокроты разделяли на 5 групп, которые обрабатывались растворами А, В, С, D и кипячением.
Лучше всего разжижал мокроту раствор А (реагент).
Было использовано разное время экспозиции с растворами A, B, C, D: 1 час, 24 часа и 4 суток. По истечении срока экспозиции 0,5 мл каждого разжиженного и хорошо перемешанного образца отбирали в микроцентрифужную пробирку и использовали для выделения ДНК, 0,5 мл отбирали в 50-мл пробирку, отмывали 2 раза фосфатным буфером и засевали на жидкую питательную среду Middlebrook 7H9 в пробирки MGIT, которые помещали в аппарат BACTEC MGIT 960 для автоматической детекции роста.
В качестве контроля использовали мокроту 12 бациллярных больных, предобработанную стандартным методом с использованием реагента NALC-NaOH.
Отрицательный результат (роста микобактериальной культуры нет) выдавали через 42 дня после посева.
Результаты посева на BACTEC MGIT 960 представлены в таблице 2.
| Таблица 2 Результаты посева образцов мокроты, обработанных растворами А, В, С и D и стандартным реагентом NALC-NaOH |
| Метод предобработки мокроты | Время предобработки | Номер образца | Результат посева | Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни |
| Стандартное разжижение NALC-NaOH | 20 минут (стандартное) | 1 | рост есть | 7 |
| 2 | рост есть | 8 | ||
| 3 | рост есть | 9 | ||
| 4 | рост есть | 8 | ||
| 5 | рост есть | 8 | ||
| 6 | рост есть | 9 | ||
| 7 | рост есть | 8 | ||
| 8 | рост есть | 7 | ||
| 9 | рост есть | 7 | ||
| 10 | рост есть | 10 | ||
| 11 | рост есть | 7 | ||
| 12 | рост есть | 8 |
| Метод предобработки мокроты | Время предобработки | Номер образца | Результат посева | Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни |
| Раствор А | 1 час | 1А | роста нет | -- |
| 2А | роста нет | -- | ||
| 3А | роста нет | -- | ||
| 24 часа | 1А | роста нет | -- | |
| 2А | роста нет | -- | ||
| 3А | роста нет | -- | ||
| 4 суток | 1А | роста нет | -- | |
| 2А | роста нет | -- | ||
| 3А | роста нет | -- |
| Метод предобработки мокроты | Время предобработки | Номер образца | Результат посева | Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни |
| Раствор B | 1 час | 4B | роста нет | -- |
| 5B | роста нет | -- | ||
| 6B | роста нет | -- | ||
| 24 часа | 4B | роста нет | -- | |
| 5B | роста нет | -- | ||
| 6B | роста нет | -- | ||
| 4 суток | 4B | роста нет | -- | |
| 5B | роста нет | -- | ||
| 6B | роста нет | -- |
| Метод предобработки мокроты | Время предобработки | Номер образца | Результат посева | Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни |
| Раствор C | 1 час | 7C | роста нет | -- |
| 8C | роста нет | -- | ||
| 9C | роста нет | -- | ||
| 24 часа | 7C | роста нет | -- | |
| 8C | роста нет | -- | ||
| 9C | роста нет | -- | ||
| 4 суток | 7C | роста нет | -- | |
| 8C | роста нет | -- | ||
| 9C | роста нет | -- |
| Метод предобработки мокроты | Время предобработки | Номер образца | Результат посева | Время от момента посева до детекции роста в пробирке, дни |
| Раствор D | 1 час | 10D | роста нет | -- |
| 11D | роста нет | -- | ||
| 12D | роста нет | -- | ||
| 24 часа | 10D | роста нет | -- | |
| 11D | роста нет | -- | ||
| 12D | роста нет | -- | ||
| 4 суток | 10D | роста нет | -- | |
| 11D | роста нет | -- | ||
| 12D | роста нет | -- |
Результаты ПЦР представлены в таблицах 3-6.
| Таблица 3 Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором А | |||||||
| Краситель | Время экспозиции | Образец # 1А | Образец # 2А | Образец # 3А | |||
| Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | ||
| FAM | 1 час | 22,13 | 0,04 | 22,56 | 0,28 | 20,08 | 0,08 |
| 24 часа | 21,12 | 0,00 | 21,40 | 0,01 | 19,34 | 0,04 | |
| 4 суток | 19,55 | 0,04 | 20,07 | 0,03 | 17,32 | 0,03 | |
| ROX | 1 час | 27,43 | 0,01 | 27,78 | 0,15 | 25,32 | 0,08 |
| 24 часа | 26,31 | 0,06 | 26,71 | 0,06 | 24,51 | 0,10 | |
| 4 суток | 24,78 | 0,01 | 25,36 | 0,01 | 22,37 | 0,06 | |
| Таблица 4 Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором В | |||||||
| Краситель | Время экспозиции | Образец # 4В | Образец # 5В | Образец # 6В | |||
| Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | ||
| FAM | 1 час | 20,49 | 0,11 | 16,30 | 0,06 | 22,89 | 0,20 |
| 24 часа | 20,86 | 0,07 | 16,91 | 0,10 | 23,31 | 0,21 | |
| 4 суток | 21,00 | 0,30 | 16,82 | 0,33 | 23,38 | 0,01 | |
| ROX | 1 час | 26,09 | 0,10 | 21,64 | 0,02 | 28,40 | 0,21 |
| 24 часа | 26,41 | 0,04 | 22,23 | 0,09 | 28,62 | 0,18 | |
| 4 суток | 26,41 | 0,25 | 22,08 | 0,24 | 28,88 | 0,01 | |
| Таблица 5 Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором С | |||||||
| Краситель | Время экспозиции | Образец # 7С | Образец # 8С | Образец # 9С | |||
| Среднее значение(Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | ||
| FAM | 1 час | 23,40 | 0,06 | 22,85 | 0,05 | 23,70 | 0,57 |
| 24 часа | 23,02 | 0,06 | 22,80 | 0,06 | 22,04 | 0,03 | |
| 4 суток | 20,35 | 0,16 | 20,45 | 0,07 | 19,87 | 0,12 | |
| ROX | 1 час | 28,96 | 0,01 | 28,22 | 0,04 | 28,75 | 0,32 |
| 24 часа | 28,13 | 0,06 | 27,81 | 0,06 | 27,09 | 0,02 | |
| 4 суток | 24,84 | 0,03 | 25,21 | 0,13 | 24,45 | 0,11 | |
| Таблица 6 Результаты ПЦР после предобработки мокроты раствором D | |||||||
| Краситель | Время экспозиции | Образец # 10D | Образец # 11D | Образец # 12D | |||
| Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | Среднее значение (Ct) | SD (Ct) | ||
| FAM | 1 час | 21,79 | 0,30 | 20,14 | 0,09 | 19,19 | 0,05 |
| 24 часа | 22,17 | 0,01 | 21,15 | 0,25 | 18,62 | 0,27 | |
| 4 суток | 21,69 | 0,01 | 20,23 | 0,28 | 18,75 | 0,18 | |
| ROX | 1 час | 27,13 | 0,18 | 25,37 | 0,10 | 24,21 | 0,01 |
| 24 часа | 26,79 | 0,01 | 26,41 | 0,29 | 23,80 | 0,01 | |
| 4 суток | 26,62 | 0,09 | 25,04 | 0,13 | 23,97 | 0,22 | |
В результате проведенных исследований было установлено следующее.
1. Лучше всего разжижал мокроту раствор А (реагент).
2. Обработка материала растворами A, B, C и D в течение 1 ч и 24 ч экспозиции не влияла на эффективность выделения ДНК и ПЦР.
3. Экспозиция в течение 4 суток с растворами А и С приводила к увеличению эффективности выделения ДНК (в среднем на 2 амплификационных цикла) по сравнению с 1 ч и 24 ч экспозиции, тогда как экспозиция с растворами B и D в течение 4 суток не оказывала влияния на эффективность ПЦР.
4. Обработка мокроты растворами А, В, С и D приводила к гибели микобактериальных клеток при всех сроках экспозиции.
5. Предобработка реагентами более предпочтительна, чем кипячение, так как является более технологичным методом, сочетающим в себе разжижение, деконтаминацию и инактивацию мокроты одновременно.
На второй стадии была проведена работа по подбору оптимальных концентраций компонентов раствора (таблица 7), объемов реагента и протоколов пробоподготовки для молекулярно-генетического исследования мокроты больных с диагнозом туберкулез легких.
| Таблица 7 Подбор оптимальных концентраций компонентов раствора | |
| Раствор | Состав раствора |
| A2 | Изопропанол 40%, 0,6М (12%) NaOH |
| A3 | Изопропанол 40%, 0,2М (2,4%) NaOH, 0,3% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина |
| A4 | Изопропанол 40%, 1М (20%) NaOH |
| A5 | Изопропанол 40%, 0,2М (2,4%) NaOH, 0,075% N,N-бис-(3-аминопропил)додециламина |
Схему пробоподготовки образцов мокроты разрабатывали, используя растворы А2 и А3, далее сравнивали ее со стандартной схемой пробоподготовки с использованием NALC-NaOH. Выделение ДНК проводили ручным и автоматическим способами. Результат оценивали по следующим критериям: разжижение мокроты, образование осадка после центрифугирования, выход ДНК после выделения, деградация ДНК при действии реагента. Исследовали следующие способы пробоподготовки:
- стандартная обработка NALC-NaOH;
- добавление раствора А в количестве от 20 до 50 мл к образцу объемом 3-5 мл.
В результате проведенных исследований образцов мокроты было установлено следующее.
1. Лучше всего разжижает образцы раствор А3. В этом случае отмечался неожиданный эффект: по мере снижения концентрации щелочи и добавления третичного амина отмечалось более гомогенное разжижение, позволяющее эффективно проводить последующие стадии исследования. Кроме того, содержание в растворе щелочи в количестве 12% обуславливает выраженный коррозийный эффект, что создает опасность при работе с реагентом и ограничивает его транспортировку. Снижение концентрации щелочи до 2,4% существенным образом снижает это нежелательное свойство.
На образцах нативной мокроты был проведен эксперимент по влиянию предобработки с использованием растворов А2, А4 и А5 на выделение ДНК ручным и автоматическим способами. Схема пробоподготовки состояла в добавлении раствора А к образцам в количестве от 20 до 50 мл. Критерии оценки результата были аналогичны предыдущим экспериментам. Использованная схема пробоподготовки показала хорошие результаты, растворы А2 и А5 были выбраны для дальнейших экспериментов.
Влияние различных способов предобработки мокроты с использованием растворов А2 и А5 на выделение и деградацию ДНК в сравнении со стандартной процедурой обработки с помощью NALC-NaOH проводили на образцах мокроты. Исследовали следующие способы пробоподготовки:
- стандартная обработка NALC-NaOH;
- добавление раствора A2 к образцу мокроты в количестве до 50 мл и перемешивание в течение 1 ч;
- добавление раствора A2 к образцу мокроты в количестве до 50 мл, перемешивание в течение 1 ч и инкубация в течение 96 часов;
- добавление раствора A5 к образцу мокроты в количестве до 50 мл и перемешивание в течение 1 ч;
- добавление раствора A5 к образцу мокроты в количестве до 50 мл, перемешивание в течение 1 ч и инкубация в течение 96 часов.
В результате проведенных исследований были сделаны следующие выводы.
1. Предобработка А5 повышает выход ДНК и, следовательно, чувствительность системы по сравнению со стандартной предобработкой NALC-NaOH при автоматическом способе выделения в среднем в 16,3 раза, при ручном способе - в среднем в 11,4 раза.
2. Инкубация образцов, обработанных А5 в течение 96 часов, не только не приводит к деградации ДНК и уменьшению выхода при выделении, в сравнении с обработкой NALC-NaOH, но и значительно повышает выход ДНК даже при сравнении с образцами, которые перемешивали в присутствии реагента в течение 1 часа без последующей инкубации.
Для окончательного выбора состава реагента проводили сравнение обработки образцов мокроты с различным содержанием ДНК M. tuberculosis complex, обработанных растворами А2 и А5. Результаты представлены в таблице 8.
| Таблица 8 Оценка воздействия реагентов А2 и А5 на выделение ДНК из клеток M. tuberculosis при использовании ручного и автоматического способов пробоподготовки | ||||
| Количество клеток | Количество копий ДНК, А2 | Количество копий ДНК, А5 | ||
| ручной способ | автоматический способ | ручной способ | автоматический способ | |
| 107-109 | 0,3×10 8 | 0,6×107 | 0,6×108 | 0,8×10 7 |
| 104-106 | 0,4×105 | 0,3×10 5 | 0,7×105 | 0,6×105 |
| 50-100 | 0,6×102 | 0,4×102 | 0,8×10 2 | 0,6×102 |
| 0-20 | 50 | 24 | 70 | 36 |
Как видно из таблицы, обработка реагентом А5 приводила к более эффективному выделению ДНК как при ручном, так и при автоматическом способе пробоподготовки. Особенно важным является эффективная экстракция ДНК при малом количестве клеток в материале, которая заметно выше при обработке материала реагентом А5, который был выбран как наиболее эффективный.
В последующих экспериментах была показана возможность использования реагента А5 как на нативном материале, так и на материале, прошедшем стандартную пробоподготовку с помощью NALC-NaOH, причем эффективность выделения ДНК при использовании реагента по сравнению со стандартной пробоподготовкой была выше в 5-10 раз.
Испытания реагента для обработки диагностического материала проводили с использованием образцов мокроты у больных туберкулезом с массивным бактериовыделением, подтвержденным бактериоскопическим методом исследования. Образцы были поделены на 3 части. Первую часть образцов (контроль роста МБТ) подвергали стандартной предобработке NALC-NaOH, затем культивировали на жидкой среде в системе BACTEC MGIT 960. Другую часть образцов инкубировали 1 ч с 20-50 мл реагента, затем дважды отмывали фосфатным буфером и также культивировали в системе BACTEC MGIT 960. Третью часть образцов обрабатывали стандартным методом NALC-NaOH, к полученным осадкам добавляли 0,5 мл реагента.
Ни в одном из исследованных образцов при культивировании в течение 42 дней в системе BACTEC MGIT 960 после инкубации с реагентом А5 рост МБТ не выявлен. В контрольных пробирках, без обработки реагентом А5, получен рост МБТ. В целях понимания сущности улучшения экстракции ДНК при ПЦР-анализе было проведено исследование образцов после обработки выбранным реагентом в течение 1 часа. Исследовано 100 образцов мокроты. При рассмотрении в реверсивный микроскоп после обработки реагентом клетки оказывались чистыми
от примесей (фрагментов, «окружающих» клетку, волокон, белков). При этом разрыва клеток при обработке реагентом не происходило, т.о. внутриклеточная ДНК оставалась внутри клетки, а сама клетка оставалась свободной от ингибирующих ПЦР субстанций, что в последующем повышало эффективность экстракции ДНК. При обработке образцов реагентом, содержащим только щелочь и спирт, после 1 часа экспозиции эффекта, подобного таковому при обработке раствором А5, не наблюдалось. При рассмотрении в реверсивный микроскоп отмечалось большое число
прилипших
к клеткам субстанций, особенно волокон и эритроцитов.
Класс G01N33/48 биологических материалов, например крови, мочи; приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры)