способ получения n-карбоксиангидридов или n- тиокарбоксиангидридов уретанзащищенных аминокислот

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ N-КАРБОКСИАНГИДРИДОВ ИЛИ N-ТИОКАРБОКСИАНГИДРИДОВ УРЕТАНЗАЩИЩЕННЫХ АМИНОКИСЛОТ общей формулы



где R - H;

R - низший алкил, не замещенный или замещенный аминогруппой, гидроксигруппой, группой

NH-C

или R -

CH₂-

бензил или циклоалкил;

Z = O, S

R - низший алкил, не замещенный или замещенный арилом,

отличающийся тем, что N-карбоксиангидрид или N-тиокарбоксиангидрид аминокислот общей формулы



где R, R и Z имеют указанные значения

вводят во взаимодействие с галоидформиатом общей формулы R-O--X, ,

где X - галоид;

R имеет указанные значения,

в инертном разбавителе в безводных условиях в присутствии третичного аминового основания.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве третичного аминового основания используют n-метилморфолин.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что n-карбоксиангидрид уретанзащищенной аминокислоты, являющийся продуктом реакции, выделяют с помощью кристаллизации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способам получения N-карбоксиангидридов или N-тиокарбоксиангидридов уретанзащищенных аминокислот, которые могут найти применение в синтезе пептидных и белковых цепей.

Известно использование N-карбоксиангидридов и их производных в качестве ацилирующих агентов при образовании пептицидных связей (1). Эти производные позволяют получать ди- и трипептиды в системах органических и водных растворителей путем тщательного регулирования температуры, рН и т. п. Однако при этом могут быть получены лишь пептиды с короткой цепью, причем получаемые продукты требуют тщательной очистки.

Цель изобретения - способ получения новых N-карбоксиангидридов или N-тиокарбоксиангидридов уретанзащищенных аминокислот, использование которых позволяет получать пептиды с различной длиной цепи по упрощенной схеме за счет устранения необходимости в активации, фильтровании и сочетании до реакции образования пептидной связи, а также исключает рацемизацию.

Поставленная цель достигается описыввемым способом получения N-карбоксиангидридов или N-тиокарбоксиангидридов уретанзащищенных аминокислот общей формулы I где R = Н; R₁ - низший алкил, незамещенный или замещенный аминогруппой, гидроксигруппой, группой -NHC или R₁ - CH₂- , бензил или циклоалкил Z = О, S

R₁₁ - низший алкил, незамещенный или замещенный арилом, заключающийся в том, что N-карбоксиангидрид или N-тиокарбоксиангидрид аминокислот общей формулы II: где значения R, R₁ и Z - указаны выше, вводят во взаимодействие с галоидформиатом R₁₁-O--X где Х = галоид, значения R₁₁ указаны выше, в инертном разбавителе, в безводных условиях в присутствии третичного аминового основания. Предпочтительными условиями осуществления способа являются использование в качестве третичного амина N-метилморфолина, выделение продукта реакции - N-карбоксиангидрид уретанзащищенной аминокислоты, с помощью кристаллизации.

П р и м е р 1. Разложение N-карбоксиангидрида в зависимости от основания.

А. N-Карбоксиангидрид валина (12 мг) растворяют в сухом дистиллированном тетрагидрофуране (12 мл) и добавляют триэтиламин (30 мкл). После исчезновения N-карбоксиангидрида проводят инфракрасную спектроскопию.

В. N-Карбоксиангидрида валина (72 мг) растворяют в тетрагидрофуране (2 мл) и добавляют N-метилморфолин (25 мкл). После исчезновения N-карбоксиангидрида проводят инфракрасную спектроскопию.

Результаты экспериментов А и В приведены на графике, представленном на чертеже 1.

П р и м е р 2. N-Карбоксиангидрид N-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-L-аланина.

А. Смесь L-аланина (40,3 г, 0,45 моля) и фосгена (275 мл 3,3 М раствора в тетрагидрофуране, 0,90 моля) перемешивают при температуре 62-64^оС в течение 4 ч. Полученный раствор оставляют для охлаждения до комнатной температуры, фильтруют и при пониженном давлении удаляют летучие вещества. Полученное масло растворяют в 100 мл тетрагидрофурана и при перемешивании добавляют 300 мл гексана с последующим охлаждением до -20^оС. Выход N-карбоксиангидрида L-аланина составил 35,79 г (69% ).

В. Раствор N-метилморфолина (8,15 г, 80,5 моля) в толуоле (50 мл) добавляют к смеси N-карбоксиангидрида L-аланина (8,84 г, 76,8 ммоля) и 9-флуоренилметилоксикарбонилхлорида (19,9 г, 76,8 ммоля) в толуоле (200 мл), находящейся при температуре 0^оС. Реакционную смесь перемешивают при температуре 0^оС в течение 2 ч и фильтруют. Объем растворителя доводят до 20 мл и после добавления 100 мл гексана выполняют кристаллизацию, в результате чего было получено 21,4 г (82% ) сырого N-карбоксиангидрида 9-флуоренилметилоксикарбонил-L-аланина. Этот продукт чистят путем растирания в порошок с холодным простым диизопропиловым эфиром, после чего производят рекристаллизацию из этилацетата и гексана: температура плавления 106-107^оС, инфракрасный спектр (СН₂Сl₂) 1870, 1801, 1740 см^-1; спектр ЯМР (CDCl₃) 6-90-7,80 (m, 8 Н), 3,95-4,55 (m, 4 Н), 1,35 (d, I = 7 Гц, 3 Н).

Вычислено, % : С 67,65; Н 4,48; N 4,15.

С₁₉Н₁₅NO₅.

Найдено, % : С 67,73; Н 4,65; N 4,19.

П р и м е р 3. N-карбоксиангидрид N-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-L-лейцина.

А. N-Карбоксиангидрид L-лейцина получают из L-лейцина с достижением 78% выхода с помощью процедуры, описанной в примере ПА.

В. Смесь N-карбоксиангидрида L-лейцина) 9,2 г, 58,4 ммоль) и 9-фтороксилметилоксикарбонилхлорида (15,1 г, 58,4 ммоля) в толуоле (125 мл) охлаждают до 0^оС и по каплям добавляют раствор N-метилморфолина (6,5 г, 64 ммоля) в 20 мл толуола. Реакционную смесь перемешивают при температуре 0^оС в течение 2,5 ч, фильтруют и объем растворителя уменьшают до 20 мл. Добавляют гексан (480 мл), после чего этот раствор охлаждают до -20^оС в течение ночи, в результате чего было получено 18,8 г (85% ) N-карбоксиангидрида N-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-L-лейцина. Аналитический образец был получен путем рекристаллизации из смеси простого эфира, метиленхлорида и гексана: температура плавления 119-120^оС; спектр ЯМР (CCl₄) 7: 35-7,91 (m, 8 Н); 4,72 (t, I = 7 Гц, 2 Н); 4,58 (m, 3 Н); 4,37 (t, I = 7 Гц, 1 Н); 2,05 (m, 2 Н); 1,09 (t, I = 6 Гц, 6 Н).

Вычислено, % : С 69,64; Н 5,58; N 3,69.

С₂₂Н₂₁NO₅.

Найдено, % : С 69,08; Н 5,97; N 3,70.

П р и м е р 4. N-Карбоксиангидрид N-а-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-N-8-трет-бутилоксикарбонил-L-лизина.

А. Смесь N--трет-бутилоксикарбонил-L-лизина (1,23 г, 5,0 ммолей) и хлортриметилсилана (1,08 г, 10,0 ммолей) в тетрагидрофуране (50 мл) охлаждают до 0^оС, после чего по каплям добавляют раствор триэтиламина (1,01 г, 10,0 ммолей) в 5 мл тетрагидрофурана. Эту смесь перемешивают при 0^оС в течение 2,5 ч, фильтруют и добавляют к раствору фосгена (10 ммолей) в 15 мл тетрагидрофурана. Температуру повышают до 60^оС и раствор перемешивают в течение 2,0 ч, затем в течение ночи при температуре окружающей среды. Летучие примеси удаляют посредством ротационного испарения, в результате чего было получено 0,79 г (58% ) N-карбоксиангидрида - N- -трет-бутилоксикарбонил-L-лизина. Инфракрасный спектр (СН₂Сl₂) 1860, 1795, 1710 см^-1.

В. Смесь N-карбоксиангидрида-N--третбутилоксикарбонил-L-лизина (0,79 г, 2,90 ммоля) и 9-флуоренилметилоксикарбонилхлорида (0,75 г, 2,90 ммоля) и в толуоле (25 мл) охлаждают до 0^оС, после чего по каплям добавляют раствор N-метилморфолина (0,32 г, 3,2 ммоля) в толуоле (5 мл). Взаимодействие осуществляют так же, как описывалось в примере 3 В, в результате чего получают 0,88 г (66% ) N-карбоксиангидрида N-а-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-N--трет-бутилоксикарбонил- L-лизина: температура плавления 81-85^оС (этилацетат/гексан).

Спектр ЯМР (CDCl₃) 7,3-7,7 (m, 8 Н), 4,11-4,58 (m, 5Н), 2,95-3,20 (m, 2Н); 1,90-1,98 (m, 2Н); 0,9-1,4 (m, 13 Н).

Вычислено, % : С 65,57; Н 6,11; N 5,67.

С₂₆Н₃₀N₂O₇.

Найдено, % : С 66,33; Н 6,38; N 5,67.

П р и м е р 5. N-Карбоксиангидрид N-бензилоксикарбонил-L-аланина.

Раствор N-метилморфолина (1,06 г, 10,5 ммоля) в этилацетате (20 мл) по каплям добавляют к смеси N-карбоксиангидрида-L-аланина (из примера ПА) (0,81 г, 7,0 ммолей) и бензилкарбонилхлорида (1,89 г, 10,5 ммоля) в этилацетате (80 мл) при 0^оС. Реакционную смесь перемешивают в течение 1,5 ч при 0^оС, фильтруют и уменьшают объем раствора до 75 мл. При перемешивании добавляют гексан (75 мл) с последующим охлаждением до -20^оС, в результате чего было получено 1,20 г (71% ) N-карбоксиангидрида N-бензилоксикарбонил-L-аланина, температура плавления 101-104^оС.

Спектр ЯМР (CDCl₃) 7,33 (S, 5Н), 5,27 (S, 2 Н), 4,60 (q, I = 7 Гц, 1 Н), 1,61 (d, I = 7 Гц, 3 Н).

Вычислено, % : С 57,83; Н 4,45; N 5,62.

С₁₂ Н₁₁NO₅.

Найдено, % : С 57,60; Н 4,50; N 5.53.

П р и м е р 6. N-Карбоксиангидрид N-бензилоксикарбонил-L-лейцина.

Раствор N-метилморфолина (0,76 г, 7,50 ммоля) в этилацетате (10 мл) по каплям добавляют к раствору N-карбоксиангидрида L-лейцина (0,79 г, 5,0 ммолей) (из примера 3А) и бензилоксикарбонилхлорида (1,35 г, 7,50 ммоля) в этилацетате (50 мл) при 0^оС. Реакционную смесь перемешивают при 0^оС в течение 1,25 ч, фильтруют и уменьшают объем раствора до 5 мл. Добавляют гексан (50 мл) с последующим охлаждением до -20^оС, в результате чего было получено 0,89 г (61% ) N-карбоксиангидрида N-бензилоксикарбонил-L-лейцина: температура плавления 72-73,5^оС (простой эфир и гексан).

Спектр ЯМР (CDCl₃) 7,40 (S. 5 Н), 5,33 (S, 2Н). 4,71 (t, I = 6 Гц, 1 Н), 1,80-2,04 (m, 3 Н), 0,91 (m, 6Н).

Вычислено, % : С 61,84; Н 5,88; N 4,81.

С₁₅Н₁₇NO₅.

Найдено, % : С 61,64; Н 6,02; N 4,90.

П р и м е р 7. N-Карбоксиангидрид N-фенилоксикарбонил-L-валина.

А. N-Карбоксиангидрид L-валина получают из L-валина с 75% выходом в соответствии с процедурой, описанной в примере ПА.

В. Повторяют процедуру, описанную в примере 5, заменяя бензилхлорформиат фенилхлорформиатом и N-карбоксиангидрид лейцина N-карбоксиангидридом валина. В результате был достигнут 78% выход N-карбоксиангидрида N-фенилоксикарбонил-L-валина: температура плавления 105-106^оС (хлороформ и гексан).

Спектр ЯМР (CDCl₃): 7,30 (m, 5 Н), 4,70 (d, J = 3,5 Гц, 1 Н), 2,60 (m, 1 Н), 1,22 (d, J = 7 Гц, 3 Н), 1,07 (d, J = 7 Гц, 3 Н). 1,07 (d, J = 7 Гц, 3 Н).

Вычислено, % : С 59,31; Н 4,98; N 5,32.

С₁₂Н₁₃NO₅.

Найдено, % : С 59,09; Н 4,91; N 5,49.

П р и м е р 8. N-Карбоксиангидрид N-этилоксикарбонил-L-аланина.

Повторяют процедуру, описанную в примере 5, заменяя бензилхлорформиат этилхлорформиатом. В результате этого был достигнут 62% выход N-карбоксиангидрида N-этилоксикарбонил-L-аланина: температура плавления 72-73,5^оС (этилацетат и гексан).

Спектр ЯМР (CDCl₃) 4,73 (g, I = 7 Гц, 2 Н), 4,33 (g, I = 7 Гц, 1Н), 1,70 (d, I ) 7 Гц, 3 Н), 1,33 (t, J = 7 Гц, 3 Н).

Вычислено, % : С 44,92; Н 4,85; N 7,49.

С₇Н₉NO₅.

Найдено, % : С 45,08; Н 5,03; N 7,33.

П р и м е р 9. А. N-Карбоксиангидрид L-фенилаланина получают из L-фенилаланина с достижением 53% выхода в результате выполнения процедуры, описанной в примере ПА.

В. К раствору N-карбоксиангидрида L-фенилаланина (2,5 г 13 ммолей) и бензилхлорформиата (3,4 г, 20 ммолей) в этилацетате (130 мл) по каплям добавляют раствор N-метилморфолина (2,0 г 20 ммолей) в этилацетате (10 мл) при 0^оС. Полученную смесь перемешивают при температуре 0^оС в течение 2,5 ч и обрабатывают так, как описано в примере 5, в результате чего было получено 2,0 г (48% ) N-карбоксиангидрида N-бензилоксикарбонил-L-фенилаланина: температура плавления 108-109^оС; спектр ЯМР (CDCl₃) 7-35 (S, 5 Н) 7,00 (m, 5 Н), 5,31 (S, 2 Н), 4,83 (m, 1 Н), 3,28 (m, 2 Н).

Вычислено, % : С 68,13; Н 5,40; N 4,42.

С₁₈Н₁₇NO₅.

Найдено, % : С 68,11; Н 5,38; N 4,20.

П р и м е р 10. N-Тиокарбоксиангидрид фенилоксикарбонил-L-аланина.

А. О-Этил-S-метилксантогенат. К раствору этилксантогената калия (16,0 г, 100 ммолей) в воде (50 мл) по каплям добавляют диметилсульфат (12,6 г 100 ммолей) при температуре 4+1^о С. После окончания добавления реакционную смесь промывали дихлорметаном (2х40 мл), после чего соединенные органические фракции высушивают (MgSO₄) и концентрируют с образованием О-этил-N-метилксантогената, имеющего достаточную чистоту; необходимую для использования на следующей стадии.

В. Этоксикарбонил-L-аланина. К О-этил-S-метилксантогенату полученному выше, добавляют раствор L-аланина (8,9 г, 100 ммолей) и NaОН (4,0 г, 100 ммолей) в воде (100 мл. ). Этот раствор нагревают до 45^оС в течение 2,3 ч. При осуществлении продувки N₂ добавляют метанол (50 мл), после чего эту смесь перемешивают при температуре 45^оС еще в течение 0,7 ч. Реакционную смесь составляют для охлаждения до комнатной температуры, промывают дихлорметаном (3х25 мл), подкисляют до рН 2,5 концентрированной НСl и экстрагируют этилацетатом (2 х 50 мл). Соединенные органические растворы высушивают (MgSO₄) и концентрируют. Добавление гексана к полученному маслу позволило получить 9,5 г (54% ) этилокситиокарбонил-L-аланина в виде бесцветного твердого вещества, которое плавилось при температуре 74-78^оС. Этот материал далее очищали рекристаллизацией из простого этила и гексана: температура плавления 77-79^оС; инфракрасный спектр (CCl₄) 3397, 1716 см^-1.

С. N-Тиокарбоксиангидрид L-аланина. К раствору этилокситиокарбонил-L-аланина (3,0 г, 17 ммолей) и имидазола (1,2 г, 17 ммолей) в тетрагидрофуране (20 мл) по каплям добавляют РВr₃ (5,4 г 20 ммолей) при температуре 20^оС. Перемешивание продолжают до тех пор, пока твердая масса не распадалась в высокодисперсионную суспензию. Эту реакционную смесь выливают в смесь насыщенного раствора NaHCO₃ (200 мл) и этилацетата (150 мл) Органический слой отделяют, промывают 1 М раствором НСl (2x х 100 мл), насыщенным раствором NaHCO₃ (100 мл) и рассолом (100 мл). высушивают (MgSO₄) и концентрируют. При выстаивании полученное масло затвердевало. Рекристаллизация твердого вещества позволила получить 0,75 г (34% ) N-тиокарбоксиан- гидрида-L-алалина: температура плавления 91-92^оС; инфракрасный спектр (ССl₄) 1750, 1695 см^-1.

Д. N-Тиокарбоксиангидрид фенилоксикарбонил-L-аланина.

К раствору N-тиокарбоксиангидрида L-аланина (0,49 г, 3,8 моля) в 50 мл этилацетата добавляют фенилхлорформиат (0,95 г, 6,1 ммоля) при температуре 0^оС, после чего по каплям добавляют раствор N-метилморфолина (0,57 г, 5,6 ммоля) в этилацетате (10 мл) при 0^оС. Полученную смесь перемешивают в течение 3 ч при 0^оС, фильтруют и концентрируют с образованием белого полутвердого вещества. Это полутвердое вещество растворяют в 20 мл этилацетата, добавляют гексан (150 мл), после чего смесь охлаждают до -20^оС, что позволило получить 0,55 г (62% ) N-тиокарбоксиангидрида фенилоксикарбонил-L-аланина: температура плавления 110-111^оС; спектр ЯМР (CDCl₃) 7,18 (m, 5Н), 4,83 (q, 1Н, I = 7 Гц), 1,71 (d, 3Н, J = = 7 Гц); инфракрасный спектр (СН₂Сl₂) 1810, 1740 (дублет), 0,1715 (плечо).

Вычислено, % : С 52,58; Н 3,61; N 5,58; S 12,76.

С₁₁Н₉NO₄S.

Найдено, % : С 52,75; Н 3,72. N 5,36; S 12,98.

П р и м е р 11. N-Карбоксиангидрид N-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-О- трет-бутил-L-треонина.

А. N-Карбоксиангидрид О-трет-бутил-L-треонина получают из О-трет-бутил-L-треонина с 57% выходом в результате использования процедуры на основе триметилсилила, описанной в примере 4А.

В. К раствору N-карбоксиангидрида О-трет-бутил-L-треонина (0,80 г, 4,0 ммоля) и 9-флуоренилметилоксикарбонилхлорида (1,0 г, 4,0 ммоля) в толуоле (50 мл) по каплям добавляют раствор N-метилморфолина (0,49 г, 4,8 ммоля) в 8 мл толуола при температуре 0^оС. Реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч при 0^оС, фильтруют и удаляют летучие вещества при пониженном давлении. Остаток кристаллизуют из смеси простого эфира и гексана с образованием 1,0 г (60% ) N-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-0-трет-бутил-L-треонина: температура плавления 124-127^оС; спектр ЯМР (CDCl₃) 7,08-7,78 (m, 8 Н), 4,05-4,61 (m, 4 Н). 1,18 (S, 9 Н), 1,16 (d, 3Н, I = 7 Гц).

Вычислено, % : С 68,07; Н 5,95; N 3,31.

С ₂₄Н₂₅NO₆.

Найдено, % : С 67,89; Н 5,96; N 3,28.

П р и м е р 12. N-Карбоксиангидрид этилоксикарбонил-а-аминоизомасляной кислоты.

А. N-Карбоксиангидрид а-аминоизомасляной кислоты получают с достижением 67% выхода в результате выполнения процедуры, описанной в примере 2А.

В. Повторяли процедуру, описанную в примере 8В, заменяя N-карбоксиангидрид L-аланина N-карбоксиангидридом аминоизомасляной кислоты, в результате чего был достигнут 16% выход N-карбоксиангидрида этоксикарбонил-L-аминоизомасляной кислоты: температура плавления 68-70^оС (хлороформ и гексан), спектр ЯМР (CCl₄) 4,59 (q, 2 Н, I = 7 Гц), 2,00 (S, 6 Н), 1,65 (t, 3 Н, I = = 7 Гц).

Вычислено, % : С 47,76; Н 5,51; N 6,96.

С₈Н₁₁NO₅.

Найдено, % : С 47,67; Н 5,51; N 7,14.

П р и м е р 13. N-Карбоксиангидрид N-трет-бутилоксикарбонил-L-аланина.

К раствору трет-бутилового спирта (1,25 г, 16,9 ммоля) и фосгена (3,4 мл 5 М раствора в диоксане, 17 ммолей) в 80 мл этилацетата по каплям добавляют N-метилморфолин (3,4 г, 34 ммоля) при температуре -50^оС. Эту реакционную смесь перемешивают в течение 0,5 ч. Затем добавляют N-карбоксиангидрид L-аланина (0,23 г, 2,0 ммоля) в этилацетате (10 мл), после чего смесь перемешивают при температуре -50^оС еще в течение 0,75 ч. Добавляют N-метилморфолин (1,0 г, 10 ммолей) и перемешивание продолжают еще в течение 0,75 ч. при температуре -50^оС. Твердые вещества удаляют фильтрованием, раствор концентрируют и после измельчения в порошок с гексаном получают целевой продукт. Рекристаллизация из толуола позволила получить 0,28 г (65% ) N-карбоксиангидрида N-трет-бутилокси- карбонил-L-аланина: температура плавления 103-104,5^оС; спектр ЯМР (CDCl₃) 4,71 (q, 1 Н, I = 7 Гц), 1,80 (d, 3 Н, I = 7 Гц), 1,70 (S, 9 Н).

Вычислено, % : С 50,23; Н 6,09; N 6,51.

С₈Н₁₃NO₅.

Найдено, % : С 50,66; Н 6,36; N 6,38.

П р и м е р 14. N-Карбоксиангидрид N-(трет-бутилоксикарбонил)-0-бензил-L-серина.

А. N-Карбоксиангидрид О-бензил-L-серина получают с достижением 68% выхода в результате выполнения процедуры, описанной в примере ПА.

В. Повторяют процедуру, описанную в примере 13 заменяя N-карбоксиангидрид L-аланина N-карбоксиангидридом О-бензил-L-серина, в результате чего был получен N-карбоксиангидрид N (трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил -L-серина с 52% выходом: температура плавления 98-99,5^оС.

Спектр ЯМР (CCl₄) 7,30 (m, 5Н), 4,64 (m, 3Н, бензил СН₂ и протон ядра NCА), 4,09 (dd, 1Н, I = 15,5 Гц), 3,88 (dd, 1 Н, J = 15,5 Гц), 1,65 (S, 9Н).

Вычислено, % : С 59,80; Н 5,96, N 4,36.

С₁₅Н₁₉NO₆.

Найдено, % : С 59,71; Н 6,25; N 4,05.

П р и м е р 15. Фенилоксикарбоксильное производное N-карбоксиангидрида 1-амино-1-циклогексанкарбоновой кислоты.

А. N-Карбоксиангидрид 1-амино-1-циклошексанкарбоновой кислоты получают из 1-амино-1-циклогексанкарбоновой кислоты с достижением 50% выхода в результате выполнения процедуры, описанной в примере ПА.

В. К раствору N-карбоксиангидрида, полученного в соответствии с примером А (0,85 г , 5,0 ммолей), и фенилхлорформиата (1,2 г, 7,5 ммоля) в этилацетате (30 мл), находящемуся при температуре 0^оС добавляют раствор N-метилморфолина (0,76 г, 7,5 ммоля) в 8 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 0^оС, фильтруют и концентрируют. Белый полутвердый остаток рекристаллизовывают из смеси простого этилового эфира, метиленхлорида и гексана с образованием 0,92 г (66% ) N-карбоксиангидрида: температура плавления 156,5-158^оС; спектр ЯМР (CDCl₃) 7,28 (m, 5 Н), 1,20-3,10 (m, 10 Н).

Вычислено, % : С 62, 27; Н 5,23; N 4,84.

С₁₅Н₁₅NO₅.

Найдено, % : С 62,03; Н 5,22; N 4,77.

П р и м е р 16. N-Карбоксиангидрид N-(9-флуоренилметилоксикарбонил)-L-лей-цина.

А. N-Карбоксиангидрид L-лейцина получали из L-лейцина с достижением 78% выхода в результате выполнения процедуры, описанной в примере ПА.

В. Смесь N-карбоксиангидрида L-лейцина (9,2 г, 58,4 ммоля в сухом дистиллированном этилацетате (150 мл) охлаждают до -10^оС после чего в течение 5 мин по каплям добавляют раствор триэтиламина (9 мл, 64 ммолей) в 20 мл этилацетата. Охлаждение прекращают и реакционную смесь перемешивают в течение 15 минут. Добавляют небольшое количество безводной хлористоводородной кислоты в диоксане (4,4 М раствор, 5 мл) с тем, чтобы убедиться в полной нейтрализации триэтиламина. Реакционную смесь фильтруют, а растворитель удаляют в условиях вакуума. Полученный сырой продукт растворяют в простом этиловом эфире, фильтруют, а целевой продукт получают путем кристаллизации после добавления к гексану.

После трех дополнительных тщательных кристаллизаций был получен N-карбоксиангидрид N-(9-флуоренил- метилоксикарбонил)-L-лейцина с 16% выходом (3,6 г). Аналитические данные были в основном идентичны результатам, полученным в примере 3.

П р и м е р 17. L-Лейцил-L-валин.

9-Флуоренилметилоксикарбонил-L-ва- лин, этерифицированный в пира-алкоксибензиловый спирт, замещенный 2% сетчатым полистиролом (0,25 г, 0,13 ммоля, валина), помещают в аппарат для твердофазного синтеза пептидов, Добавляют диметилформамид (5 мл) и суспензию встряхивают в течение 30 мин. Деметилформамид удаляют и разбухшую смолу дважды обрабатывают 10% пиперидином в диметилформамиде (5 мл в течение 5 мин, а затем 5 мл в течение 15 мин) с целью удаления 9-флуоренилметилоксикарбонильной защитной группы. Смолу промывают диметилформамидом (4 х 5 мл) и подвергают взаимодействию с N-карбоксиангидридом 9-флуоренилметилоксикарбонил-L-лейци-ном (145 мг, 0,38 ммоля) в диметилформамиде (6 мл) в течение 45 мин. Флуоренилметилоксикарбонильную защитную группу удаляют так, как описывалось выше, а смолу промывают диметилформамидом (3 х 5 мл) и метиленхлоридом (3 х 5 мл). Полученный дипептид отщепляют от смолы путем обработки метиленхлоридом и трифторуксусной кислотой (6 мл 1/1) в течение 45 мин. Раствор удаляют, а смолу промывают метиленхлоридом (3х5 мл) и метанолом (2х5 мл). Раствор, соединенный с промывками, выпаривают в условиях вакуума до полутвердого состояния, после чего полученное вещество растворяют в дистиллированной воде и фильтруют. Водный раствор сушат вымораживанием и полученное твердое вещество растворяют в порошок вместе с простым эфиром (ЭХ) с целью удаления загрязняющих примесей, относящихся к смоле, и высушивают при пониженном давлении с образованием N-лейцил-L-валина, выход которого составил > 90% . Идентичность дипептида была подтверждена высокоэффективной хроматографией (скорость перемещения фронта растворителя - 1,5 мл/мин, определение при длине волны 215 нм, 30% метанол в 0,5 М раствора хлорной кислоты) при совместном элюировании известным этанолом (время удержания 8,49 мин). Было установлено, что чистота этого продукта превышает 97% , причем все загрязняющие примеси имеют непосредственную связь со смолой. D-лейцил-L-валин (время удержания 32 мин) обнаружен не был (пределы обнаружения < 0,1% ).

П р и м е р 18. L-Лейцил-L-валин.

Повторяют процедуру, описанную в примере 16, за исключением того, N-карбоксиангидрид 9-флуоренилметилоксикарбонил-L-лейцина подвергают взаимодействию со свободным амином L-валина на смоле с использованием метиленхлорида (5 мл) вместо диметилформамида в качестве растворителя. Полученные результаты были сравнимы с результатами, полученными в примере 16.

П р и м е р 19. L-Лейцид-L-аланил-L-валин (процедура с использованием 9-флуоренометилкарбонила).

Процедуру, описанную в примере 16, используют для получения L-лейцил-L-аланил-L-валина. После отщепления от смолы и промывки простым эфиром был получен трипептид в виде белого твердого вещества, выход которого составил > 88% . Анализ посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях, описанных в примере 16, подтвердил идентичность этого продукта, который подвергают совместному элюированию известным эталоном. (Время удержания 16,28 мин. ). Отбрасываемые последовательности, такие как L-лейцил-L-валин и L-аланил-L-валин, обнаружены не были (пределы обнаружения < 0,1% ).

П р и м е р 20. L-Лейцил-L-аланил-L-валин (процедура с использованием трет-бутилоксикарбонила).

Трет-бутилоксикарбонил-L-валин, этерифицированный в метиллированный 2% сетчатый полистирол (то есть смола Меррифилда) 0,50 г, 0,23 ммоля валина), помещают в аппарат для твердофазного синтеза пептидов, добавляют метиленхлорид (5 мл) и суспензию встряхивают в течение 30 мин. Растворитель удаляют, а смолу обрабатывают смесью метиленхлорида и трифторуксусной кислоты (6 мл, 1/1) в течение 30 мин с целью удаления трет-бутилоксикарбонильной защитной группы. Смолу промывают метиленхлоридом (3 х 5 мл), нейтрализуют 10% триэтиламином в метиленхлоpиде (5 мл), промывают метиленхлоридом (3 х 5 мл), а затем подвергают взаимодействию с раствором N-карбоксиангидрида трет-бутилоксикарбонил-L-аланина (200 мг, 1,0 ммоль) в метиленхлориде (5 мл) в течение 45 мин. Полученную смолу с защищенным дипептидом промывают метиленхлоридом (3х5 мл). Эту смолу снова деблокируют, промывают, нейтрализуют так, как описывалось выше. К смоле добавляют N-карбоксиангидрид трет-бутилоксикарбонил-L-лейцина (240 мг, 1,0 ммоль) в метиленхлориде (6 мл), осле чего эту смесь встряхивают в течение 45 мин. Раствор удаляют, а смолу промывают метиленхлоридом (3х5 мл), метанолом (3х5 мл) и метиленхлоридом (3х5 мл), а затем высушивают в условиях вакуума. Смолу с трет-бутилоксикарбонилзащищенным трипептидом подвергают взаимодействию с жидким фтористым водородом при температуре 0^оС в течение 30 мин, Фтористый водород удаляют, а смолу высушивают в условиях вакуума. Пептид растворяют в воде, а смолу удаляют фильтрованием. Раствор сушат вымораживанием, в результате чего был достигнут почти количественный выход L-лейцил-L-аланил-L-валина. Результаты анализа, выполненного посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии, были сравнимы с результатами, полученными в примере 18.

П р и м е р 21. L-Аланил-L-фенилаланин (процедура с полной защитой).

А. К пара-толуолсульфонату бензилового эфира L-фенилаланина )1,07 г, 2,5 ммоля) в тетрагидрофуране (20 мл), находящемуся при температуре 0^оС, добавляют N-метилморфолин (0,25 г, 2,5 ммоля). Эту смесь перемешивают в течение 0,5 ч при температуре 0^оС, а затем добавляют N-карбоксиангидрид N-бензилоксикарбонил-L-аланина (0,50 г, 2,0 ммоля). Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при , 0^оС, после чего добавляют воду (20 мл) и дихлорметан (50 мл). Слои разделяют и водный слой промывают дихлорметаном (25 мл). Соединенные органические фракции промывают 0,5 М раствором НСl (2 х 50 мл), 10% бикарбонатом натрия (50 мл) и водой (2 х 50 мл) высушивают (MgSO₄) и концентрировали. После добавления гексана выполняют кристаллизацию, в результате чего было получено 0,66 г (72% ) бензилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аланил-L-фенилаланина: температура плавления 118,5-119^оС.

Спектр ЯМР (CDCl₃) 7,64 (S, 1 Н), 6,82-7,39 (m, 6 Н), 5,04 (S, 3 Н), 5,00 (S, 2 Н), 4,56-4,92 (Sm, 2 Н), 3,07 (d, I = 6 Гц, 2Н), 1,29 (d, I = 7 Гц, 3 Н).

В. Смесь бензилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аланил-L-фенилаланина (0,50 г, 1,1 ммоля) и палладированного угля с 10% содержанием палладия (0,1 г) в этиловом спирте (150 мл) встряхивают в аппарате для гидрогенизации Парра в течение 6,5 часов при температуре 20^оС. Реакционную смесь фильтруют, а фильтрат промывают водой (100 мл). Раствор концентрируют с образованием 0,26 г (100% ) L-аланил-L-фенилаланина. Анализ, выполненный с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, показал, что чистота продукта составляет > 99% и у него отсутствуют признаки рацемизации.

П р и м е р 22. L-Аланил-L-фенилаланин (процедура с частичной защитой).

А. К раствору L-фенилаланина (0,33 г, 2,0 ммоля) в 0,20 М растворе карбоната калия (20 мл) и ацетонитрила (30 мл) по каплям добавляют N-карбоксиангидрид N-бензилоксикарбонил-L-аланина (0,45 г, 1,8 ммоля) в ацетонитриле (6 мл) при 0^оС. Эту смесь перемешивают в течение 40 мин при 0^оС и разбавляю этилацетатом (50 мл) и 1 М раствором хлористоводородной кислоты (10 мл). Слои разделяют и водный слой экстрагируют этилацетатом (2 х 35 мл). Соединенные органические фракции промывают рассолом (30 мл), 0,5 М раствором хлористоводородной кислоты (2 х 50 мл) и водой (2 х 50 мл), высушивают (MgSO₄) и концентрируют. Остаток рекристаллизуют из смеси хлороформа и гексана, в результате чего получают 0,26 г (39% ) N-бензилоксикарбонил-L-аланил-L-фенилаланина: температура плавления 121-122^оС.

Спектр ЯМР (ДМСО- d₆) 12,71 (S, 1Н), 8,06 (m, 1Н), 7,30 (m, 5 Н), 5,01 (S, 2Н), 4,43 (m, 1Н), 4,06 (m, 1 Н), 2,99 (m, 2 Н), 11,19 (d, 2 Н, I = 7 Гц).

В. Смесь N-бензилоксикарбонил-L-аланил-L-фенилаланина (0,208 г, 0,562 ммоля) и палладированного угля с 10% содержанием палладия (0,1 г) в 95% этиловом спирте (50 мл) встряхивают в аппарате для гидрогенизации Парра в течение 16 ч при температуре 20^оС. Реакционную смесь фильтруют и фильтрат промывают водой (100 мл). Соединенные растворы концентрируют с образованием 0,122 г (92% ) L-аланил- L-фенилаланина в виде белого твердого вещества. Анализ, выполненный с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, показал, что чистота продукта составляет > 99,5% и в нем отсутствуют следы рацемизации.

П р и м е р 23. Трет. бутилоксикарбонил-L-аланил-L-аланил-L-фенилаланин.

К раствору L-аланина-L-фенилаланина (0,236 г, 1,0 ммоля) в 0,20 М раствора карбоната калия (20 мл) и ацетонитрила (30 мл) добавляют по каплям раствор Н-трет-бутилоксикарбонил-L-аланина-НСА (0,194 г, 0,9 ммоля) в ацетонитриле (5 мл) при 0^оС. Смесь перемешивают в течение 1 ч при 0^оС и разбавляют 50 мл этилацетата и 10 мл 1 н. соляной кислоты. Фазы разделяют и экстрагируют водный слой 2 порциями этилацетата по 35 мл. Объединенные органические фракции промывают рассолом (30 мл), 0,5 М раствором соляной кислоты (2 х 50 мл) и водой (2 х 50 мл), сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме. Остаток осаждают посредством медленного введения продукта в хлороформе к охлажденному гексану при медленном перемешивании. Образующийся продукт собирают фильтрованием и сушат при высоком вакууме, получая в результате 0,2 г (выход 49% ) Boc-L-аланил-L-аланил-L-фенилаланина. Аминокислотный анализ свидетельствует о наличии 1 фенилаланина и 2 аланинов. Продукт является однородным по данным тонкослойной хроматографии (силикагель, хлороформ) метанол 8/20).

П р и м е р 24. L-серил-L-аланил-L-аланил-L-фенилаланин.

А. Вос-L-аланил-L-аланил-L-фенилаланин (0,2 г, 0,5 ммоля) перемешивают в течение 45 мин с 4 М раствором хлористого водорода в диоксане (10 мл). Избыток хлористого водорода удаляют посредством отгонки в вакууме. Хлоргидрат L-аланил- L-аланил-L-фенилаланина получают посредством лиофилизации. Данный продукт используют без дальнейшей очистки.

В. К раствору L-аланил-L-аланил-L-фенилаланина (все количество, полученное в описанном выше эксперименте) в 0,20 М растворе карбоната калия (20 мл) и ацетонитриле (30 мл) добавляют по каплям раствор Н-трет-бутилоксикарбонил- (О-бензил)-L-серин-НСА (0,194 г, 0,7 ммоля) в ацетонитриле (5 мл) при 0^оС. Смесь перемешивают в течение 1 ч при 0^оС и разбавляют 50 мл этилацетата и 10 мл 1н. соляной кислоты. Фазы разделяют и экстрагируют водный слой 2 порциями этилацетата по 35 мл. Объединенные органические фракции промывают рассолом (30 мл), 0,5 М раствором соляной кислоты (2 х 50 мл и водой (2 х 50 мл), сушат над сульфатом магния и концентрируют в вакууме. Остаток осаждают посредством медленного введения продукта в хлороформе к охлажденному гексану при медленном перемешивании. Образующийся продукт собирают фильтрованием и сушат при высоком вакууме, получая в результате 0,202 г (выход 63% ) Вос-(О-бензил)-L-серил-L-аланил-L-аланил-L-фенилаланина.

С. Смесь Вос-(О-бензил)-L-серил-L-аланил-L-аланил-L-фенилаланина (0,2 г, 0,31 ммоля) и уксусной кислоты (50 мл) встряхивают в устройстве для гидрогенизации по Парру в течение 17 ч при 20^оС. Реакционную смесь фильтруют и получают продукт посредством лиофилизации уксусной кислоты.

1. Вос-L-серил-L-аланил-L-аланил-L-фенилаланин (все количество, полученное ранее, без дополнительной очистки) перемешивают в течение 45 мин с 4 М раствором хлористого водорода в диоксане (10 мл). Избыток хлористого водорода удаляют отгонкой в вакууме. L-серил-L-аланил-L-аланил-L-фенилаланин (0,102 г, 85% ) получают с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-18, 0,1% ТФА, линейный градиент из смеси вода/ацетонитрил от 95/5 до 50/50, спустя 1 час) с последующей лиофилизацией. Результаты аминокислотного анализа из расчета на (S ААР-серил-аланил-аланил-фенилаланина): S = 1, А = 2; F = 1. Найдено: S = 0,98. А = 2,03, F = 1,0. Масс-спектр (М+Н)+ - рассчитано на SAAF: 395, найдено 395.

П р и м е р 25. Ацильный пептид (65-74, VQAAItDyNG).

Ацильный пептид (65-74, VQAAIDYNG) получают в реакторе в потоке. Колонну загружают ГМОС-глициновой смолой (0,8 г, 0,36 мэкв/г) и уравновешивают сухим диметилформамидом при скорости потока 11 мл/мин. Все растворители сушат при пропускании через колонну с молекулярными ситами 4. Смолу последовательно вводят в реакцию с трехкратным избытком FМОС-аминокислот (NCА) (FМОС-валин-NСА, FМОС-(-тритил)-глицил-NСА, FМОС-аланин-NСА, FМОС-аланин-NСА, FМОС-изолейцин-NСА, FМОС-(трет-бутил)-аспаргин-NСА, FМОС-(о-трет-бутил)-тирозин-NСА, FМОС-изолейцин-NCА, FМОС-(тритил)-аспаргин-NСА) cогласно следующей методике: 1) снятие защиты (10% пиперидина в диметилформамиде), 10 мин при скорости 11 мл/мин; 2) промывка (диметилформамид), 5 мин при скорости 11 мл/мин; 3) расщепление (0,15 М U NСА в диметилформамиде), 45 мин при скорости 11 мл/мин; 4) промывка (диметилформамид), 5 мин при скорости 11 мл/мин; 5) повторение стадий 1-4. После снятия защиты с концевых защитных групп смолу удаляют из колонны, промывают сухим хлористым метиленом и сушат в вакууме. Пептид отщепляют от смолы посредством обработки в течение 1 ч 50% тетрагидрофурана в сухом хлористом метилене, содержащем 2,5% анизола и 2,5% пентаметилбензола. После удаления растворителей при пониженном давлении и лиофилизации получают неочищенный ацильный пептид (65-74) с выходом 73% .

Результаты аминокислотного анализа из расчета на (VQAAIDyNG): V = 1,00, Q = = 1,00, А = 2,00, I = 2,00, D + N = 2,00, y = 1,00, G = 1,00. Найдено: V = 1,00, Q = 1,02; А = 2,08, I = 2,05, D + N = 2,20, y = 1,05, G = 1,00. Масс-спектр: (М+Р) из расчета на VQAAIDyNG): 1064, найдено 1064.

V = валин

Q = глицин

A = аланин

I = изолейцин

D = аспарагин

y = тирозин

Описываемый способ позволяет получить оптически активные пептиды различной длины. (56) Hirschmann R. и др. The controlled synthesis of Peptides in Agueons Medium VIII.

The Preparation and use of Novel L-Amino Acid N-Carboxyanhyd - The rides. J. Amer. Chem, soc. 1971. 93, N 11, c. 2746-2774.

Патент США N 4267344, кл. С 07 D 407/02, 1981.