средство, обладающее репаративной активностью

Формула изобретения

Применение пептидсодержащей фракции активированных нейтрофилов человека с мол. м. 500 - 10000 Дальтон в качестве средства, обладающего репаративной активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к экспериментальной и клинической медицине и биологии и касается регулирования процесса заживления ран.

В настоящее время внимание патологов и клиницистов направлено на изучение механизмов репарации ран, в частности ожоговых, и поиск средств, усиливающих их заживление. Перспективными для стимулирования заживления ожоговых ран являются иммуностимулирующие препараты.

Известен препарат крови - солкосерии, представляющий собой депротеинизированный экстракт гемолизированной крови телят и содержащий до 30% аминокислот, гидрокси- и кетокислот, кислых и основных полипептидов. Препарат широко применяется для лечения различных заболеваний, в том числе и для заживления ран (солкосерил существенено ускоряет заживление ран, улучшает энергетический обмен).

Однако солкосерил - известное среднемолекулирное вещество крови, обладающее репарационной активностью, будучи полученным из крови телят, а не человека, обладает гетерогенностью - чужеродностью для организма человека. Кроме того, по данным авторов солкосерил обладает слабой способностью усиливать отторжение первичного струпа, что ведет к более позднему очищению ран от патологически измененных тканей.

Целью изобретения является расширение ассортимента средств для ускорения репарации ран, в частности ожоговых.

Цель достигается применением среднемолекулярных пептидных веществ нейтрофилов крови человека - нейтрофилокинов.

Нейтрофилокины обладают способностью активно стимулировать процесс заживления ран, усиливая их эпителизацию. ; при этом, являясь эндогенными веществами, в отличие от других средств, ускоряющих репаративные процессы, нейтрофилокины обладают выраженным свойством ускорять отторжение струпа.

Известны иммунотропные свойства нейтрофилокинов.

Авторами впервые установлена возможность использования эндогенных (гомологичных) человеку пептидных веществ крови (точнее, нейтрофилов крови) - нейтрофилокинов - в качестве репарационного средства.

Среднемолекулярные пептидные вещества нейтрофилов крови человека получают следующим образом:

- у доноров забирают кровь, отстаивают ее в термостате при 37^оС с декстраном 1-500 в течение 30 мин для получения плазмы;

- плазму наслаивают на двойной градиент фиколл-верографина: = 1,075 и = 1,093. На границе двух градиентов образуется кольцо, содержащее 98-100% нейтрофилов. Выделяют те фракции клеток, которые содержат 100% взвесь нейтрофилов;

- после выделения клетки трижды отмывают средой 199 в течение 10 мин при 1500 об/мин и доводят до концентрации 5 х 10⁶ кл/мл;

- половину клеток инкубируют в среде 199 (без активатора), другую - в присутствии активатора - в среде 199 со взвестью латекса (полистирольного монодисперсного диаметром 1,7 мкм) в соотношении 1 кл: 100 частиц латекса, что способствует максимальной активации клеток (выбор полистирольного монодисперсного латекса диаметром 1,7 мкм в качестве активатора был обусловлен тем, что он соответствует определенным критериям - не разрушает нейтрофилы, не разрушается сам и, следовательно, не загрязняет среду инкубации продуктами распада клеток и активатора, из все опробованных активаторов обладает наибольшей способностью активировать нейтрофилы);

- инкубацию осуществляют в течение 50-70 мин, после чего клеточные элементы удаляют путем центрифугирования в течение 10 мин при 1500 об/мин, а частицы латекса - центрифугированием в течение 10 мин при 8000 об/мин;

- полученные супернатанты подвергают последовательной ультрафильтрации через фильтр УПМ-П 67000, задерживающий продукты с мол. мас. свыше 40 000 дальтон, и УАМ-50, пропускающий продукты и соли с мол. мас. менее 500 дальтон;

- концентрат ультрафильтрата наносят на колонку размером 5,5 х 50см с Сефадексом G-15. Элюцию проводят деионизированной водой. Регистрацию выходящих пиков осуществляют при помощи шведского аппарата IKB.

- фракции собирают, определяют концентрацию пептидных факторов микробиуретовым методом с помощью реактива Бенедикта спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-16, Е-330 нм, лиофилизируют, доводят до необходимой концентрации (2 10^-3 мг/мл).

Репарационную активность полученной пептидсодержащей фракции активированных нейтрофилов с мол. мас. 500-10000 дальтон (нейтрофилокинов) изучали на модели стандартной ожоговой травы.

Травму наносили в двух точках эпилированной поверхности кожи спины мышей различных линий на кожную складку в течение 1 с паяльником, нагретым до 500^оС (площадь наконечника паяльника равна 0,3 см²). В результате термического воздействия образовывались 2 стандартные раны с ожогами III Б степени. Все манипуляции с животными проводили под эфирным наркозом.

Животным внутрибрюшинно вводили фракции интактных (неактивированных) и активированных нейтрофилов в дозе 2 10^-4 мг белка на мышь через 1 сут трехкратно, либо - 6-тикратно, в зависимости от задачи исследования. (табл. 1-6).

В табл. 1-2 представлены результаты изучения влияния нейтрофилокинов Н₁, А₁ и А₅ - фракций, обладающих высокой иммунотропной активностью 1 5 1 (номера фракций даны по очередности выхода их при элюции вслед за свободным объемом) на репарацию обожженных мышкй.

Как видно из представленных данных (табл. 1 и 2), все фракции достоверно усиливали отторжение ожогового струпа, а фракция А₁, кроме того, существенно по сравнению с контролем стимулировала эпителизацию ожоговых ран.

П р и м е р 1. Изучали влияние различных схем введения нейтрофилокинов (а именно, фракции А₁) на заживление ожоговых ран.

Нейтрофилокины получали описанным способом от 20 доноров и вводили обожженным мышам по трем схемам:

1 схема: вводили фракции А₁ нейтрофилокинов в дозе 2 10^-4 мг белка на мышь на 1,3 и 5 сут после ожога;

2 схема: вводили фракцию А₁ нейтрофилокинов в дозе 2 10^-4 мг белка на мышь на 7,9 и 11 сут после ожога;

3 схема: вводили фракцию А₁ нейтрофилокинов в дозе 2 10^-4 мг белка на мышь на 1, 3, 5, 7, 9 и 11 сут. после ожога.

(Примечание: ожог наносили в двух точках эпилированной поверхности кожи спины у мышей F₁ (СВА х С 57В1) - реципиентов в течение 1 с паяльником, нагретым до 500^оС.

Результаты исследования представлены в табл. 3

Как показали исследования, фракция А₁ усиливает эпителизацию ожоговых ран независимо от сроков и продолжительности введения. Однако более позднее введение нейтрофилокинов (см. схему 2 - введение нейтрофилокинов на 7, 9 и 11 сут после нанесения ожога) ведет к снижению скорости отторжения ожогового струпа, в то же время раннее начало введения фракции А₁ усиливает отторжение ожогового струпа по сравнению с контролем - средой 199 (табл. 4).

П р и м е р 2. Изучали влияние фракции А₁ нейтрофилокинов, солкосерила (прототип) и Т-активина на репарацию ожоговых ран.

Все препараты вводили внутрибрюшинно в дозе 2 10^-4 мг белка на мышь на 1,3 и 5 сут после ожога. Результаты представлены в табл. 5 и 6.

Из представленных данных видно, что Т-активин не оказывает достоверного влияния на репарацию ожоговых ран, в то время как солкосерил и нейтрофилокины (А₁ фракция) стимулируют заживление ожогов по сравнению с контролем. При этом следует отметить, что А₁ при равной способности стимулировать эпителизацию ожоговых ран обладает более выраженным свойством ускорять отторжение ожогового струпа (p < 0,05).

Таким образом, проведенные исследования позволили получить новые данные о свойствах среднемолекулярных пептидных продуктов нейтрофилов - обнаружено новое свойство нейтрофилокинов - стимулировать заживление ран.

Нейтрофилокины - продукты эндогенного (человеческого) происхождения - по сравнению с изветными средствами, например солкосерилом, наряду со способностью усиливать эпителизацию ран, обладают одновременно и способностью стимулировать отторжение ожогового струпа, что дает возможность их использования в клинической практике с целью стимуляции заживления ран, в частности ожоговых. (Следует учесть также доступность получения нейтрофилокинов, возможность их стандартизации по содержанию пептидов). (56) Malaker K. u Sellword R. A. Brit. J. Surg. , 1970, vol. 58, N 3, p. 221-223.

Авторское свидетельство N 1536977, кл. G 01 N 33/53, 1987.