способ количественного определения иммуноглобулина в сыворотке крови человека

Формула изобретения

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОГЛОБУЛИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА путем постановки реакции преципитации с моноспецифической антисывороткой и фотометрическим анализом преципитата, отличающийся тем, что реакцию проводят в присутствии 0,0013 М раствора полиэтиленгликоля с мол. м. 6000.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии.

Известен способ количественного определения иммуноглобулинов в сыворотке крови человека путем радиальной иммунодиффузии по Манчини. Но этот способ слишком продолжителен. Определение длится 48 ч. Известен более быстрый способ количественного определения иммуноглобулинов (определение за 1 ч) в жидкой фазе с использованием раствора сернокислого кадмия. Недостатками известного способа являются низкая чувствительность и большой расход реактивов.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является иммунохимический способ определения иммуноглобулинов в забуференном растворе NaCl с рН 7,5 с помощью фотометрии. Согласно известному способу стандартные растворы, исследуемые образцы и антисыворотки разводят забуференным раствором хлорида натрия с рН 7,5. Используют кроличьи антисыворотки в разведении 1: 5-1: 20. Сливают растворы антигена и антисыворотки. Инкубация при 20^оС длится 2 ч. После этого определяют экстинцию растворов в проходящем свете при 450 нм против холостой пробы. Концентрацию иммуноглобулина определяют по калибровочному графику.

Недостатками известного способа являются довольно большая продолжительность способа (больше 2 ч), а также недостаточная чувствительность процессa: низкие концентрации иммуноглобулинов этим способом определить нельзя.

Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорения способа.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе количественного определения иммуноглобулинов, включающем постановку реакции преципитации с моноспецифическими антисыворотками против иммуноглобулинов в буферном растворе при рН 7,4-7,5 и фотометрический анализ полученного преципитата, реакцию иммунопреципитации проводят в присутствии 0,0013 М раствора полиэтиленгликоля с мол. м. 6000.

Полиэтиленгликоль способствует более полному осаждению преципитата и поэтому достаточно низких концентраций иммуноглобулина, чтобы определить изменение экстинции на спектрофотометре. Чувствительность способа по сравнению с прототипом увеличивается при этом в 20 раз. Кроме того, с введением полиэтиленгликоля (см. таблицу) в реакцию повышается в 4 раза скорость преципитации. Так инкубация по заявляемому способу длится 30 мин, а по прототипу 2 ч.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается наличием в реакции раствора полиэтиленгликоля мол. м. 6000 и концентрацией 0,0013 М.

Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию "новизна".

При сравнении заявляемого способа с другими техническими решениями выявлено, что известно применение полиэтиленгликоля для осаждения агрегированных иммунных комплексов. Однако в заявляемом способе полиэтиленгликоль в забуференном виде при рН 7,4-7,5 и при выбранной концентрации 0,0013 М проявляет новую функцию - осаждает иммуноглобулины. Поэтому заявляемый способ соответствует критерию "существенные отличия".

При рН 7,4-7,5 и концентрации полиэтиленгликоля 0,0013 М наблюдается максимальное осаждение преципитата. Отклонение от этих величин в любую сторону отрицательно влияет на достоверность результатов.

Ход определения.

Используемые реактивы:

0,15 М раствор хлорида натрия для разбавления сыворотки.

Сухие моноспецифические антисыворотки для определения иммуноглобулинов A, M, G Горьковского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии.

0,02 М фосфатный буфер (KH₂PO₄ и Na₂HPO₄).

0,0013 М раствор полиэтиленгликоля мол. м. 6000 на фосфатном буфере (см. п. 3).

Моноспецифические сыворотки растворяют в 1 мл дистиллированной воды и оставляют на 15-20 мин. Затем разводят в соотношении 1: 3 0,0013 М раствором полиэтиленгликоля. Для определения иммуноглобулинов A и М берут 0,1 мл сыворотки, разведенной 0,15 М раствором хлорида натрия 1: 10 для определения иммуноглобулина G - 0,05 мл. Затем доводят объем каждой пробы для всех иммуноглобулинов до 0,9 мл. Через 5 мин во все пробирки добавляют 0,1 мл соответствующей моноспецифической сыворотки для определения иммуноглобулинов A, M и G, разведенных, как указано.

Учет реакции производят через 25-30 мин на отечественных колориметрах марок "КФО", "КФК-2", "КФК-2МП", "КФК-3" при длине волны 340 нм, кювета 3 мл против контрольной пробы, а также на спектрофотометре марки "СФ-46".

Контрольные пробы приготавливают для каждого образца и каждого класса иммуноглобулинов, если для их определения берут разный объем сыворотки. В контрольную пробу вместо моноспецифической сыворотки добавляют соответствующее количество фосфатного буфера с 0,0013 М раствором полиэтиленгликоля. Расчет концентрации содержащихся в сыворотке иммуноглобулинов A, M и G производят по калибровочному графику. Для его построения готовят калибровочные растворы: специфические калибраторы для количественного определения белков фирмы "КОНЕ" (Финляндия) с различными концентрациями иммуноглобулинов или контрольные сыворотки, прилагаемые к наборам моноспецифических антисывороток. Контрольные сыворотки разводят физиологическим раствором до получения концентраций:

иммуноглобулина М, г/л: 0,3; 0,6; 1,2; 1,8; 2,4;

иммуноглобулина A, г/л: 0,8; 1,6; 3,2; 4,8; 6,4;

иммуноглобулина G, г/л: 3,3; 6,6; 13,6; 19,8; 27,2.

Затем полученные стандартные растворы разводят так же, как опытные образцы 0,15 М раствором хлорида натрия в соотношении 1: 10.

Конкретные примеры осуществления способа.

В платиновую пробирку автоматической мерной пипеткой "Labsystem" помещают 0,1 мл образца. Разводят в 10 раз согласно методике, описанной выше. В этом разведенном образце определяют количественное содержание иммуноглобулинов G, A и М.

П р и м е р 1. Определение IgG.

Для определения IgG в 2 пробирки помещают по 0,05 мл разведенной сыворотки. Затем добавляют до объема 0,9 мл 0,0013 М буферный раствор полиэтиленгликоля. Через 5 мин добавляют в одну пробирку 0,1 мл антисыворотки, разведенной согласно методике. В этой пробирке определяют содержание IgG. В другую пробирку помещают 0,1 мл буферного раствора полиэтиленгликоля. Эту пробирку используют при измерениях в качестве контрольной пробы. После инкубации в течение 03 мин при 25^оС измеряют экстинкцию пробы на спектрофотометре "СФ-46" при длине волны 340 нм против контрольной пробы. Получают экстинкцию 0,284. Согласно калибровочной кривой (см. фиг. 1) концентрация IgG составляет 6,4 г/л.

П р и м е р 2. Определение IgA.

Для определения IgA в 2 пробирки помещают по 0,1 мл разведенной сыворотки. Затем доводят объем каждой пробирки до 0,9 мл 0,0013 М буферным раствором полиэтиленгликоля. Через 5 мин в первую пробирку добавляют 0,1 мл антисыворотки для определения содержания в ней IgA. Антисыворотка разведена согласно методике. Во вторую пробирку вносят 0,1 мл 0,0013 М буферного раствора полиэтиленгликоля. После инкубации в течение 30 мин при 25^оС измеряют экстинкцию пробы против контрольной пробы на спектрофотометре "СФ-46". Получаем экстинкцию, равную 0,334. Согласно калибровочному графику (см. фиг. 2) содержание IgA в сыворотке крови составляет 2,83 г/л.

П р и м е р 3. Определение IgM.

В 2 пробирки помещают по 0,2 мл разведенной сыворотки. Затем с помощью 0,0013 М буферного раствора полиэтиленгликоля доводят объем содержимого пробирок до 0,9 мл. Через 5 мин добавляют в первую пробирку 0,1 мл антисыворотки, разведенной согласно методике, для определения IgM. Во вторую пробирку добавляют 0,1 мл 0,0013 М буферного раствора полиэтиленгликоля.

После инкубации в течение 30 мин при температуре 25^оС измеряют экстинкцию пробы на спектрофотометре "СФ-46" против контрольной пробы. Получают экстинкцию, равную 0,222. Согласно калибровочному графику (см. фиг. 3) концентрация IgM составляет 1,21 г/л.

Заявляемый способ количественного определения иммуноглобулинов в сыворотке крови человека по сравнению с прототипом имеет следующие преимущества:

- чувствительность понижается в 20 раз;

- время определения снижается в 4 раза. (56) 1. Манчини Г. Иммунологические методы. М. : Мир, 1979, с. 41-42.

2. Авторское свидетельство СССР N 13636075, кл. G 01 N 33/536, 1987.

3. Иммунологические методы. Под ред. Х. Фримеля. М. : Мир, 1979, с. 38-42.