стабилизирующий состав для получения лиофилизированных положительных контрольных сывороток, используемых в тест- системах для определения специальных антител к вирусам и микроорганизмам

Формула изобретения

СТАБИЛИЗИРУЮЩИЙ СОСТАВ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ КОНТРОЛЬНЫХ СЫВОРОТОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ТЕСТ-СИСТЕМАХ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСАМ И МИКРООРГАНИЗМАМ, включающий пептидные и/или смесь пептидных и углеводородных компонентов, воду, отличающийся тем, что состав дополнительно содержит этилендиаминтетраацетат при следующем соотношении компонентов, мас. % :

Этилендиаминтетраацетат 0,02 - 0,22

Пептидные и/или смесь пептидных и углеводородных компонентов 1 - 20

Вода Остальное

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения стабильных форм иммунобиологических препаратов.

Для сохранения специфических свойств биопрепаратов при лиофилизации и хранении используют стабилизирующие составы, основу которых составляют, как правило, белковые (полипептидные) и углеводные компоненты. Сыворотки крови являются сложными биологическими смесями, основу которых составляют белки. В силу этого сыворотки крови нашли широкое применение в качестве стабилизирующих составов при лиофилизации биопрепаратов [1] .

Действующее начало положительной сыворотки - специфические антитела. Стабилизирующий состав должен, во-первых, способствовать сохранению активности антител, во-вторых, предотвращать появление ложноположительного сигнала за счет неспецифической сорбции компонентов сыворотки. Белковые компоненты положительной сыворотки являются защитной средой для специфических антител, однако они не обеспечивают полного сохранения активности антител при лиофилизации и хранении.

Известны стабилизирующие составы для получения лиофилизированных препаратов сывороток и плазмы крови человека, включающие углеводы [2] , например сахароза, глюкоза.

Недостатком таких составов является то, что при их использовании в процессе лиофилизации достижение заданной влажности (1-3% ) препарата затруднено и требует специальных режимов досушивания. Кроме того, они не обеспечивают сохранение сигнала в иммуноферментном анализе (ИФА) при хранении при положительных температурах.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является стабилизирующий состав для получения лиофилизированных контрольных положительных сывороток крови на антитела к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ-1), включающий пептидные и/или смесь пептидных и углеводных компонентов [3] . В качестве пептидных компонентов используют отрицательную сыворотку крови человека, не содержащую специфические антитела к ВИЧ-1 (7,0% ), а в качестве смеси пептидных и углеводных компонентов - сыворотку крови человека, не содержащую специфические антитела к ВИЧ-1 (6,3% ) и сахарозу (4,7).

Недостатком стабилизирующего состава-прототипа является то, что он не достаточно обеспечивает сохранение сигнала в ИФА при хранении положительных контрольных сывороток, используемых в тест-системах для определения специфических антител.

В основу изобретения поставлена задача создания такого стабилизирующего состава, который обеспечивал бы сохранение сигнала в ИФА за счет снижения потерь специфической активности положительных контрольных сывороток (при их хранении), используемых в тест-системах для определения специфических антител.

Поставленная задача решается тем, что в стабилизирующий состав, включающий пептидные и/или смесь пептидных и углеводных компонентов, согласно изобретению, дополнительно вводят этилендиамин- тетраацетата (ЭДТА) при следующем соотношении компонентов, мас. % :

Этилендиаминтет-

раацетат (ЭДТА) 0,02-0,22% ;

Пептидные и/или смесь

пептидных и углеводных

компонентов 1-20%

Вода Остальное.

В состав дополнительно вводят этилендиаминтетраацетат при следующем соотношении всех компонентов, мас. % :

Этилендиаминтетра-

ацетат 0,02-0,22% ;

Пептидные и/или смесь

пептидных и

углеводных компонентов 1-20% ;

Вода Остальное.

Сравнение заявляемого стабилизирующего состава с известными составами того же назначения показывает, что отличительные от прототипа компоненты состава и их количественное соотношение обеспечивают новое, неизвестное ранее свойство, а именно снижение потерь специфической активности при хранении положительных контрольных сывороток, используемых в тест-системах для определения специфических антител. Снижение потерь специфической активности при хранении препарата обусловлено тем, что введение в состав ЭДТА обеспечивает связывание ионов тяжелых металлов в растворе препарата. Ионы тяжелых металлов являются инициаторами перекисных процессов в лиофилизированном препарате. Устранение процессов окисления обеспечивает сохранение биологической активности препарата при его хранении.

Получение заявляемого стабилизирующего состава приведено на примерах их подготовки для получения лиофилизированных положительных контрольных сывороток, используемых в тест-системах для определения специфических антител к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ-1). Компоненты стабилизатора (ЭДТА, пептидные компоненты или смесь пептидных и углеводных компонентов) перемешивают при комнатной температуре до полного растворения. Полученный раствор добавляют в положительные на антитела к ВИЧ-1 сыворотки для получения требуемой степени разбавления (обычно от 1/10 до 1/100). Препарат разливают по 0,1 мл во флаконы объемом 5-10 мл. Замораживание проводят при -60^оС в течение 10-16 ч. После чего проводят вакуумное обезвоживание, причем температура материала на этапе сублимации льда не превышает -35^оС. Скорость нагревания на этапе досушивания составляет 4-6^оС/ч. Конечная температура матриала 25^оС. Общее время вакуумного обезвоживания 20 ч. По окончании лиофилизации флаконы укупоривают под вакуумом. Остаточную влажность препарата определяют по стандартной методике, величина которой для всех экспериментальных образцов не превышает 2% .

Примеры стабилизирующих составов (прошедших экспериментальную проверку) приведены в табл. 1.

Следует отметить, что нижний предел концентрации ЭДТА (0,02% ) в составе ограничен погрешностью приготовления раствора заданной концентрации (погрешнос- тью взвешивания). Использование в составе больших концентраций ЭДТА (более 0,22% ) нецелесообразно, так как увеличение концентрации не приводит к увеличению стабилизирующего эффекта. Нижний предел (1% ) пептидных компонентов или их смеси с углеводами обосновывается тем, что при меньшей их концентрации не образуется таблетка (препарат не имеет товарного вида, возникают трудности с определением остаточной влажности). Верхний предел (20% ) этих компонентов ограничен тем, что при большем содержании сухого остатка резко увеличивается вязкость жидкого продукта, что технологически усложняет розлив препарата.

Активность специфических антител в положительных сыворотках определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) после лиофилизации и в процессе хранения при 37^оС. ИФА проводили в тест-системе "Рекомбинант ВИЧ" производства НПО "Вектор" в соответствии с инструкцией по применению. Специфическая активность антител определяется после взаимодействия антигена, сорбированного на планшете, с антителами сыворотки и проявления провзаимодействовавших антител конъюгатом белка А с пероксидазой хрена. Специфическая активность выражается в единицах оптической плотности (ОП) при = 492 нм (где - длина волны).

Результаты ИФА положительных контрольных сывороток при хранении приведены в табл. 2. Результаты показывают, что при хранении при 37^оС препаратов с составами, содержащими ЭДТА, имеют большее сохранение специфической активности, чем составы без ЭДТА. Специфическая активность положительной сыворотки, приготовленной с заявляемыми составами, сохраняется в течение времени наблюдения (7 нед. ), в пределах погрешности воспроизводимости. Активность положительной сыворотки с предлагаемым составом выше после трех недель выдерживания при 37^оС по сравнению с прототипом и аналогами и при увеличении срока хранения разница заметно увеличивается (в 1,4-1,9 раза). Более высокая активность положительной сыворотки (пример 1, табл. 1) через 1 нед. хранения объясняется ростом неспецифического сигнала (показано для сыворотки, заведомо несодержащей антитела к ВИЧ-1).

Погрешность сходимости результатов составляет 5% . Расчеты произведены относительно ЭДТА 5 мМоль/л исходя из того, что указанное количество ЭДТА является наиболее оптимальным в заявляемом соотношении компонентов состава. Следует отметить, что предлагаемый стабилизирующий состав (в заявляемом соотношении компонентов) может быть использован для контрольных сывороток, используемых в тест-системах для определения антител не только к ВИЧ-1, но и к другим вирусам или микроорганизмам. Действующим началом контрольной сыворотки являются специфические антитела. Специфические антитела к различным антигенам (например, ВИЧ, вирус герпеса и т. п. ) имеют общее строение, отличаясь лишь отдельными аминокислотными заменами в вариабельной части. Действие ЭДТА, как компонента стабилизирующего состава, основано на связывании ионов тяжелых металлов, что затормаживает процессы окисления и модифицирует окружение антитела. Поэтому защитное действие стабилизирующего состава на положительные сыворотки, содержащие антитела к различным антигенам (вирусов, микроорагнизмов), будет одинаково эффективным при одном и том же соотношении компонентов заявляемого состава.

Предлагаемый стабилизирующий состав по сравнению с прототипом [3] и аналогами [2] позволяет снизить потери специфической активности (в 1,4-1,9 и более раз) положительных контрольных сывороток (при их хранении), используемых в тест-системах для определения специфических антител к вирусам или микроорганизмам. (56) 1. Долинов. Основы технологии сухих биопрепаратов, М. , 1969, с. 208.

2. Подольский М. В. Высушивание препаратов крови и кровезаменителей. М. : Медицина, 1973, с. 101-102.

3. Экспериментально-производственный регламент "Тес-система иммуноферментная для выявления антител к вирусу иммунодефицита человека "Рекомбиат ВЧЧ" НПО "Вектор", Новосибирск, 1988, с. 1-7.