C12N9/24 действующие на гликозилсодержащие соединения (32)
Автор(ы):
Тиунова Н.А., Зайкина И.В., Кобзева Н.Я.
Патентообладатель(и):
Тиунова Наталья Андреевна, Зайкина Ирина Васильевна, Кобзева Нина Яковлевна
Приоритеты:
подача заявки: 1991-03-29
публикация патента: 15.08.1994
Использование: в области биохимии, микробиологическая и пищевая промышленность. Сущность изобретения: исследуемый образец измельчают, добавляют ферментный препарат экзо - 1,3 - b - глюканазы гриба Geotrichum candidum ЦМПМ F-220 в количестве 0,1 - 1,5 МЕ 1,3 - b-глюканазной активности на 1 мг образца. Гидролиз проводят в течение 24 - 72 ч при 40 °С. Определяют количество образующейся глюкозы.
Формула изобретения
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -ГЛЮКАНОВ, предусматривающий ферментативный гидролиз исследуемого образца с последующим определением количества образовавшейся глюкозы, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения точности определения, ферментативный гидролиз проводят при 40oС в течение 24 - 72 ч с помощью ферментативного препарата экзо- 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> - -глюканазы гриба Geotrichum candidum ЦМПМ F-220, при этом препарат вводят в количестве 0,1 - 1,5 МЕ 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> - -глюканазной активности на 1 мг образца.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биохимии, а именно, к способу определения полисахаридов - 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюканов, и может найти применение в микробиологической, пищевой промышленности. Особенно большой интерес способ представляет для определения содержания ламинарана в водорослях при их переработке и хранении. Известен способ определения содержания 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюкана, в частности ламинарана в водорослях путем экстракции, осаждения, сушки и взвешивания. Этот способ является длительным и трудоемким. Кроме того, из-за многостадийности способа наблюдаются потери ламинарана, что снижает точность определения. В качестве пpототипа выбран способ количественного определения 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюканов, в частности ламинарана в водорослях, предусматривающий экстракцию 0,4% -ным раствором соляной кислоты, осаждение, ферментативный гидролиз содержащегося в осадке полисахарида с последующим определением количества образующейся глюкозы. При этом используют фермент моллюска, по механизму действия являющийся эндо-1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюканазой. Недостатками известного способа являются его многостадийность и невысокая точность определения, связанная, во-первых, с недостаточно полной экстракцией полисахарида раствором соляной кислоты, и, во-вторых, с особой специфичностью действия эндо-1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюканазы, которая имеет тот недостаток, что гидролизует полисахарид не полностью до глюкозы, а с образованием, также и коротких олигосахаридных цепей. Цель изобретения - повышение точности определения и упрощение анализа. Цель достигается применением ферментной системы экзо-1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюканаз гриба Geotrichum candidum ЦМПМ F-220. Ферментный препарат выпускает НПО "Биолар" (г. Олайне) под названием "Целлокандин" или "Целломикс". Штамм защищен с. N 1125247. Указанный гриб синтезирует три формы ферментов, расщепляющих 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюканы по концевому механизму действия посредством отщепления ангидроглюкозных остатков с нередуцирующего конца молекулярных цепей полисахарида. Единственным продуктом реакции при действии ферментного препарата гриба Geotrichum candidum ЦМПМ F-220 является глюкоза- по количеству которой судят о количестве 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюканов. Большое преимущество предлагаемого способа заключается в том, что определение ламинарана в водорослях можно осуществлять без предварительной экстракции и осаждения полисахарида. П р и м е р 1. Определение содержания ламинарана в водорослях. Сухие водоросли измельчают в ступке до порошкообразного состояния. В пробирку вносят 100 мг измельченных водорослей, добавляют 2 мл раствора целлокандина в 0,1 М ацетатном буфере pH 4,5 с активностью 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюканазы 10 МЕ/мл (1 МЕ - 1 -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017060/956.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">М глюкозы/мин). Для контроля за содержанием сахаров в субстрате в другую пробирку вносят 100 мг измельченных водорослей и 2 мл ацетатного буфера без ферментного препарата. Для контроля за содержанием сахаров в ферментном препарате в третью пробирку вносят 2 мл раствора целлокандина в ацетатном буфере. Содержимое пробирок перемешивают, пробирку закрывают ватными пробками и помещают для ферментативного гидролиза в термостат с температурой 40о и перемешиванием. Через 24 ч из пробирок, не взмучивая осадок, отбирают пробу для определения содержания глюкозы. Глюкозу определяют методом Шомодьи-Нельсона. Содержание глюкозы в исследуемой реакционной смеси определяют по формуле Г=[E1-(E2+E3)] -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017060/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> K -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017060/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> n -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017060/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> V, где Е1 - оптическая плотность раствора пробы; Е2 - оптическая плотность раствора "контроль субстрата"; Е3 - оптическая плотность раствора "контроль ферментного препарата"; К - коэффициент пересчета содержания глюкозы по данным калибровочного графика; n - принятое разведение пробы; V - объем реакционной смеси в мл. При определении содержания ламинарана в бурой водоросли Laminaria saccharina (Белое море) Е1, Е2 и Е3 равны 0,310, 0,01, 0,02 соответственно, К= 0,6, n=100, V=2. Таким образом, количество глюкозы в 2 мл реакционной смеси составляет 32,4 мг. Расчет содержания ламинарана (в %) от веса сухой водоросли ведут по формуле Л = -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017819/2017819t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> , где Г - количество глюкозы в мг, которое было найдено в 2 мл ферментативного гидролизата водоросли; 0,9 - коэффициент пересчета количества глюкозы в соответствующее количество ламинарана, состоящего из ангидроглюкозных остатков, имеющих молекулярную массу 162, а не 180, как глюкоза; В - сухая навеска водоросли в мг. Содержание ламинарана в водорослях было найдено равным 29,16%. П р и м е р 2. Определение 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюкана из дрожжей. Используют препарат дрожжевого глюкана, выделенный из клеточных стенок дрожжей. К 2 мл 0,1 М ацетатного буфера pH 4,5 добавляют 2 мг препарата дрожжевого глюкана и 1 мл раствора целломикса в том же буфере с активностью 3 МЕ/мл. Для контроля за содержанием сахаров в субстрате в другую пробирку вносят 3 мл ацетатного буфера pH 4,5, 0,1 М и 2 мг препарата дрожжевого глюкана. Для контроля за содержанием сахаров в ферментном препарате в третью пробирку к 2 мл ацетатного буфера добавляют 1 мл раствора целломикса в том же буфере. Во все реакционные смеси добавляют антисептик азид Na или мертиолат в количестве 1-2 мг. Содержимое пробирок перемешивают, закрывают резиновыми пробками и помещают для ферментативного гидролиза в термостат с температурой 40о. Через 72 ч из пробирок отбирают пробы для определения содержания глюкозы методом Шомодьи-Нельсона. Содержание глюкозы в исследуемой реакционной смеси рассчитывают так же, как в примере 1. В данном случае при определении содержания дрожжевого глюкана в препарате из клеточных стенок дрожжей Е1, Е2 и Е3 равны 0,501, 0,063, 0,0 соответственно, К=0,6; n=2,5; V=3. Таким образом, количество глюкозы в 3 мл реакционной смеси составляет 1,97 мг. Расчет содержания дрожжевого глюкана от веса исследуемого препарата проводят как в примере 1. Содержание глюкана в исследуемом препарате дрожжевого глюкана составляет 88,65%. Таким образом, описанный способ позволяет упростить процесс определения 1,3- -глюканов, патент № 2017819" SRC="/images/patents/456/2017038/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -глюканов, при этом также увеличивается точность анализа.
-глюканов