питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы (ее варианты)
Классы МПК: | C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них |
Автор(ы): | Хагивара Хидеаки[JP], Наито Масафуми[JP], Юаса Хидео[JP] |
Патентообладатель(и): | Есихиде Хагивара, Хидеаки Хагивара (JP) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1988-08-19 публикация патента:
30.08.1994 |
Использование: биотехнология, иммунология, медицина. Сущность изобретения: разработана бессывороточная питательная среда для культивирования человек/человеческий гибридомы, позволяющая увеличить продукцию моноклональных антител. Новая бессывороточная среда содержит основную питательную среду RDF, инсулин, трансферрин, этаноламин,
-меркаптоэтанол, селенит натрия, человеческий альбумин или L-аргинин и дополнительно ретиноевую кислоту в концентрации 10-12 - 10-6 М. 2 с.п. ф-лы, 2 табл., 3 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5

Формула изобретения
1. Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы, содержащая основную питательную среду RDF, трансферрин, инсулин, натрий-селенит, бетамеркаптоэтанол, этаноламин, человеческий альбумин, воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ретиноевую кислоту при следующем соотношении компонентов:Ретиноевая кислота 10-6 - 10-12 моль;
Основная питательная среда RDF 13,433 мг;
Трансферрин 10 мг;
Инсулин 10 мкг;
Натрий-селенит 1 нмоль;
Бетамеркаптоэтанол 1 мкмоль;
Этаноламин 1 мкмоль;
Человеческий альбумин 100 мкг;
Вода До 1 мл
2. Питательная среда для культивирования человек/человеческой гибридомы, содержащая основную питательную среду RDF, трансферрин, инсулин, натрий-селенит, бетамаркаптоэтанол, L-аргинин, воду, отличающаяся тем, что дополнительно содержит ретиноевую кислоту при следующем соотношении компонентов:
Ретиноевая кислота 10-6 - 10-2 моль;
Основная питательная среда RDF 13,433 мг;
Трансферрин 10 мкг;
Инсулин 10 мкг;
Натрий-селенит 1 нмоль;
Бетамеркаптоэтанол 1 мкмоль;
L-аргинин 1 мг;
Вода До 1 мл.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для культивирования человек/человеческой гибридомы. Для культивирования животных клеток обычно используют питательные среды, содержащие 5-10% сыворотки. Однако сыворотка содержит гетерогенные факторы, например высокоплотные и низкоплотные липолипиды, присутствие которых в питательных средах может вызвать нежелательные осложнения при изучении биохимических процессов культивируемых клеток. В таких случаях целесообразно использование бессыворотных питательных сред, в состав которых включаются факторы роста и другие добавки. Примером такой бессывороточной среды, используемой при культивировании человеческой гибридомы, может служить питательная среда, не содержащая сыворотку, но включающая значительные концентрации аминокислот и особенно L-аргинина. Недостатком данных сред является низкая продуцирующая способность культивируемых клеток. Цель изобретения - получение бессывороточной среды для культивирования человек/человеческой гибридомы, продуцирующей человеческое моноклеточное антитело. Указанная цель достигается включением в бессывороточную среду ретиноевой кислоты, известной как витамин А-кислота. Включение ретиноевой кислоты в концентрации 10-12-10-16 М заметно усиливает способность к продуцированию данного антитела человек/человеческой гибридомой (фиг. 1). Наибольшее увеличение продукции антитела происходит при концентрации 10-10-10-9 М и достигает максимума при 10-8 М, при дальнейшем увеличении концентрации ретиноевой кислоты продукция антитела идет на спад. Предлагаемые бессывороточные среды, содержащие ретиноевую кислоту готовят на основе питательной среды RDF (смесь RPМ1 1640, ДМЕ и F12 в соотношении 2: 1:1) с включением соответствующих количеств инсулина, трансферрина, селена, этаноламина,


RDF - основная среда 13,433 кг на мл среды Трансферрин 10 мкг на мл среды Инсулин 10 мкг на мл среды Селенит натрия 1 нМ Этаноламин 1 мкМ

Альбумин человека 100 мкг на мл среды Вода До 1 мл
Бессывороточную среду готовят путем добавки ретиноевой кислоты в указанную бессывороточную наполненную среду в каждой концентрации, из приведенных в табл. 1. Человек/человеческую гибридому SLNF10 дважды промывают бессывороточной наполненной средой путем центрифугирования при небольшой скорости и затем инокулируют в каждую из бессывороточных наполненных (контрольных) сред (примеры 1-5) со скоростью 105 кл./мл и культивируют в инкубаторе при 37оС в присутствии 5% СО2. Шесть дней спустя после начала культивирования число клеток измеряют гемоцитометром, а количество антител измеряют следующим способом. Антитело к человеческому иммуноглобулину (100




RDF основная среда 12,433 мг/мл среды Трансферрин 10 мкг/мл среды Инсулин 10 мкг/мл среды Селенит натрия 1 нМ

Ретиноевая кислота 10-7 М
Человек/человеческую гибридому SLF10 инокулируют в бессывороточной среде со скоростью 105 кл./мл и ее культивирование начинают при 37оС в присутствии 5% СО2. Через 6 дней первое поколение клеток отделяют от культуральной жидкости и инокулируют в свежей бессывороточной среде в том же составе со скоростью 105 кл./мл и культивируют при тех же условиях. Через 6 дней после начала второй культивации второе поколение клеток отделяют от жидкой среды, инокулируют в свежую бессывороточную среду в том же составе со скоростью 105 кл./мл и культивируют при тех же условиях культивации. Таким образом, субкультивирование и результаты, представленные на фиг. 2, показывают, что человек/человеческая гибридома, продуцирующая человеческое моноклональное антитело IgG, может культивироваться до нескольких поколений в течение долгого периода времени без заметного уменьшения ее способности к пролиферации клеток и продуцированию антитела. П р и м е р ы 7-9. Способом по примеру 4 готовят среду, не содержащую ретиноевую кислоту (контрольная), и среду, содержащую 10-7 М ретиноевой кислоты (бессывороточная среда, описанная в настоящем изобретении. Гибридому SLNF10, используемую в примере 4, и гибридому TOS/H и CoLN E10 культивируют в среде, описанной в примере 4. Через 6 дней после начала культивирования измеряют количество антител. Результаты представлены в табл. 2 и на фиг. 3. Из этих результатов видно, что бессывороточная среда, содержащая ретиноевую кислоту, может быть использована для культивирования различных человек/человеческих гибридом, способных продуцировать человеческие моноклональные антитела, при этом можно достичь заметного увеличения количества продуцируемых антител по сравнению с тем количеством, которое получается при использовании среды, не содержащей ретиноевую кислоту.
Класс C12N5/02 размножение одиночных клеток или клеток в суспензии; сохранение их; питательные среды для них