способ ингибиции вич-инфекции
Классы МПК: | |
Автор(ы): | Быковский А.Ф., Миллер Г.Г., Покидышева Л.Н., Титова И.В., Артюков А.А., Попов А.М., Прозоровский С.В., Лоенко Ю.Н., Хесс Джозеф[US], Еляков Г.Б., Стоник В.А., Исаков В.В. |
Патентообладатель(и): | Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи, Тихоокеанский институт биоорганической химии |
Приоритеты: |
подача заявки:
1991-02-28 публикация патента:
15.09.1994 |
Использование: в медицине, а именно для профилактики и лечения СПИДА и СПИД-ассоциированных заболеваний. Сущность: в способе используют низкомолекулярный сульфатированный полисахарид с мол. в. менее 20000 Дальтон с фукозой, сульфатированной по 4-му положению, остатки которой связаны гликозидными связями, и коррелируют с уроновами кислотами при соотношении 1 : 4 (SO3-FUC, UA=COOH) , при этом исходный продукт получают на водоросли ламинария японская. Положительный эффект: сульфатированный полисахарид низкого мол. в. не проявляет какой-либо токсичности для клеток ин витро в дозах свыше 5000 мкг/мг. 1 ил., 3 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2
Формула изобретения
СПОСОБ ИНГИБИЦИИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ путем применения сульфатированного полисахарида, отличающийся тем, что, с целью снижения токсичности, используют низкомолекулярный сульфатированный полисахарид с мол.м. менее 20000 Дальтон, с фукозой, сульфатированной по 4-му положению, остатки которой связаны гликозидными связями и коррелируют с уроновыми кислотыми при соотношении 1 : 4 (SO3 - FUC; UA - COOH), при этом исходный продукт получают из водоросли Ламинария японская (Laminaria japonica).Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицине, а именно для профилактики и лечения СПИДа и СПИД-ассоциированных заболеваний. Известен способ ингибиции ВИЧ-инфекции с помощью фукоидана. Недостатком известного способа является то, что фукоидан обладает токсичностью. Целью изобретения является снижение токсичности. Данная цель достигается использованием низкомолекулярного сульфатированного полисахарида (НСП) с мол.в. около 15000 Дальтон, содержащего фукозу, сульфатированную по 4-му положению, остатки которой связаны гликозидными связями и коррелируют с уроновыми кислотами при соотношении 1:4 (SO3-FUC; UA-COOH), при этом исходный продукт получают из водоросли ламинария японская (Laminaria japonica). НСП имеет следующие характеристики. Физическая характеристика полисахарида. Материал и методы. Хроматографический анализ был произведен на стеклянной колонке с гидрофобным сорбентом Полихром-1 и с сефакрилом S-300 (Фармациа, Швеция) с использованием детектора 1КВ UV-VIS (при 254 нм с 2 мл препаративной проточной клетки). Карбогидраты определяли фенольно-сернокислым методом. Для анализа моносахаридов использовали жидкостную газовую хроматографию на хроматографе Свет-2 со стеклянной колонкой 2,5 х 0,4 см (3% OV-225 на хроматроне N-HMDS) при 150-230о, 5о/мин. Образцы для анализа готовили гидролизом полисахаридного препарата при 90оС в течение 2 ч с 2N HCl с последующим получением перацетата альгитола обычным способом. Спектр ядерного магнитного резонанса (Н и 13С ЯМР) определяли на спектрометре Bryker WM-250. Химические сдвиги регистрировали в ppm от тетраметилксилана. Результаты. НСП (МВ около 15000 Дальтон), белый аморфный порошок; [![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019011/945.gif)
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019011/945.gif)
a) Прямой вируснейтрализующий эффект
1 мл суспензии ВИЧ-1, полученной после высокоскоростного центрифугирования вируссодержащей культуральной жидкости из клеток Н9/ШВ или НТН1У27 и 1 мл раствора НСП в соответствующих концентрациях (0,1 до 100 мгк/мл) помещали в пробирки и оставляли для контакта на 2 ч при 37оС или комнатной температуре. После этого равные количества клеток МТ4 предобработанных полибреном были добавлены в каждую пробирку для адсорбции вируса с множественностью инфекции (МИ), равной 100, и оставляли для контакта при 37оС на 1-1,5 ч. После контакта клетки осаждали низкоскоростным центрифугированием в течение 10 мин, супернатант удаляли, клетки ресуспендировали в среде РРМ1 1640 с 10% фетальной телячьей сыворотки до конечной концентрации 2 х 105 кл/мл. Клеточную суспензию в количестве 1 мл распределяли в 24-луночные плато и культивировали при 37оС и 5% СО2 в течение 7 дней. б) Ингибирующий эффект НСП на адсорбцию ВИЧ-1 на клетках МТ4. По 2х105 кл/мл МТ4 распределяли в каждую лунку 24-луночных плато и после короткого периода оседания клеток на дне лунок вносили соответствующие концентрации НСП и преинкубировали при 37оС в течение 1 ч, после чего вносили вирусную суспензию с МИ-100 и культивировали клетки при тех же условиях 7 суток. Процент клеток, экспрессировавших и неэкспрессировавших вирусный антиген на поверхностной мембране вычисляли как среднее арифметическое трех повторностей от каждых 100 клеток в методе непрямой иммунофлуоресценции. Соотношение Х адсорбции-ингибиции вируса, зависимое от концентрации НСП определяли по следующей формуле, %:
X = 100 -
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019186/2019186t.gif)
b - антиген положительных клеток в необработанных препаратах, %
100 - антиген положительных клеток в контрольных препаратах (см. табл. 1 и 2). Антикоагуляционный эффект НСП был более чем в 10 раз ниже, чем у гепарина. Если 50% значение для анти-ВИЧ активности на клетках МТ4 (см. табл. 1 и 2) перевести из мкг/мл в ед/мл, получим следующие значения, ед/мл: НСП 6,7х10-3; фукоидан 3,6х10-3; гепарин 1 х 10-3. Таким образом, НСП обладает анти-ВИЧ активностью при концентрациях более чем в 100 раз низких, чем его антикоагуляционная активность. Определение ин виво и ин витро острой токсичности полисахаридной фракции НСП. Определение острой токсичности ин виво проводили на белых мышах (по 10 животных в каждой группе), 4-5 недельного возраста, массой 21-24 г. НСП, разведенный в физиологическом растворе в соответствующих концентрациях, вводили животным тремя различными путями: внутривенно, внутриперитонеально, перорально. Ведущие симптомы, гибель и массу тела исследовали у каждого животного в течение 7-дневного периода наблюдения, после чего каждое животное забивали и подвергали анатомическому исследованию внутренние органы. Как показано в табл. 3, ни у одного животного, получавшего препарат одним из указанных способов, не было обнаружено никаких симптомов острой токсичности или каких-либо нарушений морфологии внутренних органов (см. табл. 4). Цитотоксичность НСП ин витро на клетках МТ4 и Н9 не проявлялась даже при концентрациях препарата выше 5000 мкг/мл в сравнении с прототипным фукоиданом, для которого 50% цитотоксическая доза, определяемая по выживанию клеток МТ4, равна 1060
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019009/177.gif)
50 мМ Трис-HCl, pH 8,2; 5
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019012/956.gif)
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019012/956.gif)
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019012/956.gif)
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019012/956.gif)
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019012/956.gif)
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019012/956.gif)
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019012/946.gif)
ИТА =
![способ ингибиции вич-инфекции, патент № 2019186](/images/patents/454/2019186/2019186-2t.gif)
Cs - радиоактивность образца после преинкубации с НСП. Уровень ингибиции ОТ активности показан на чертеже. Таким образом, сульфатированный полисахарид низкого мол.в. не проявляет какой-либо токсичности для клеток ин витро в дозах свыше 5000 мкг/мл и лабораторных животных ин виво и может быть получен с помощью дешевой безотходной технологии путем обработки морской водоросли (Laminaria japonica).