способ определения о-толуидина в крови

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ О-ТОЛУИДИНА В КРОВИ, включающий центрифугирование и хроматографический анализ центрифугата, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности определения, предварительно из анализируемой пробы экстрагируют 0-толуидин хлороформом, экстракт кипятят в течение 15 с и подвергают центрифугированию.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинским токсикологическим исследованиям, в частности санитарной токсикологии, и может быть использовано для количественного определения о-толуидина в крови.

Известен способ определения изомерных толуидинов методом тонкослойной хроматографии, который осуществляется путем нанесения исследуемой пробы пластинки с силикагелем с последующим элюированием в хроматографической системе бензол-метанол в объемном соотношении 80:20. Количественное определение осуществляется путем экстрагирования вещества из окрашенных пятен на хроматограмме с помощью растворителя и колориметрированием полученных экстрактов.

Недостатком способа является его невысокая чувствительность 4 мг/дм³.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемым результатам является газохроматографический способ определения аминосоединений бензольного ряда в биологических средах.

Определение аминосоединений бензольного ряда в крови осуществляется путем отбора проб крови 1-5 см³ предварительно затравленных животных. Кровь вносят в коническую пробирку центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин для полного осаждения макрочастиц крови. В полученную сыворотку (надосадочную жидкость) для осаждения белков добавляют 10% раствор СН₃СООН. Исследуемые пробы хроматографируют на хроматографе ЛХМ-80 с детектором ионизации в пламени. Анализ осуществляется на колонке 2м х 3 мм, заполненной сорбентом 3% OV-1 на хроматоне-супер. Температура колонки 120^оС, температура испарителя 180^оС, скорость газа-носителя (гелия) 60 см³/мин, скорость водорода 33 см ³/мин, скорость воздуха 300 см³/мин. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

Недостатком способа является невысокая чувствительность 0,6 мг/дм³, невысокая точность определения о-толуидина. Погрешность определения составляет 8,2%.

Цель изобретения - повышение чувствительности и точности способа.

Цель достигается тем, что способ определения о-толуидина в крови осуществляется путем экстракции пробы крови хлороформом, кипячением ее в течение 15 с, центрифугированием 15 мин при 7000 об/мин с последующим хроматографированием и количественном определении методом абсолютной калибровки.

Способ определения осуществляется следующим образом: пробы, содержащие 1 мл крови затравленных крыс о-толуидином, экстрагируют 2 мл хлороформа с последующим кипячением в течение 15 с. После удаления белков центрифугированием при 7000 об/мин в течение 15 мин, проводят количественное определение о-толуидина в подготовленных пробах газохроматографическим методом по калибровочному графику.

Калибровочный график строится следующим образом. Пробы крови контрольных животных объемом 1 мл экстрагируют 2 мл хлороформа, содержащего различные концентрации (заранее известные) о-толуидина с последующим кипячением в течение 15 с. Белок удаляют центрифугированием при 7000 об/мин. Полученные стандартные растворы хроматографируют на хроматографе ЛХМ-80 с детектором ионизации в пламени. Анализ осуществляют на стеклянной колонке 3 м х 3 мм, заполненной неподвижной жидкой фазой 3% ОV-1 на хроматоне N-Супер. Режим работы прибора: температура испарителя 180^оС, температура термостата колонок 110^о C, скорость газа-носителя (гелия) - 33 см³/мин, скорость водорода 33 см³/мин, скорость воздуха 300 см³/мин.

На чертеже показан график зависимости площади полученных пиков (мм²) от абсолютной массы о-толуидина (мкг).

Обнаружено, что применение в качестве экстрагента хлороформа более полно позволяет выделить о-толуидин из крови, что повышает чувствительность способа (табл.1 и 3).

В табл. 1 приведены значения степени экстракции о-толуидина крови различными растворителями.

Оптимальный эффект наблюдается при использовании в качестве экстрагента хлороформа, так как в силу своих физико-химических свойств о-толуидин не растворяется в других перечисленных растворителях, и кипячении в течение 15 с. Это обусловлено тем, что кипячение в течение меньшего диапазона времени недостаточно для полной денатурации белка в пробах крови, а кипячение более 15 с ведет к деструкции о-толуидина и уменьшению его конструкции в пробах (табл.2).

Пример конкретного выполнения способа. Анализируют пробы крови, полученные методом добавок с различным содержанием в них о-толуидина.

Проба 1. О-толуидин 0,04 мг/дм³;

Проба 2. О-толуидин 0,08 мг/дм³;

Проба 3. О-толуидин 0,12 мг/дм³;

Проба 4. О-толуидин 0,208 мг/дм³;

Проба 5. О-толуидин 4,165 мг/дм³.

К пробам крови добавляют по 2 мл хлороформа, содержащего заданные концентрации о-толуидина. Пробы кипятят в течение 15 с и центрифугируют при 7000 об/мин в течение 15 мин. Затем анализируемые пробы хроматографируют не менее 5 раз на хроматографе ЛХМ-80 с детектором ионизации в пламени. Анализ осуществляют на стеклянной колонке 3 м х 3 мм, заполненной неподвижной жидкой фазой 3% ОV-1 на хроматоне N-Супер. Режим работы прибора: температура испарителя 180^оС, температура термостата колонок 110^оС, скорость газа-носителя (гелия) 33 см³/мин, скорость водорода 33 см³/мин, скорость воздуха 300 см³/мин.

По калибровочному графику, представленному на чертеже, определяют концентрацию вещества в пробах 1-5. Полученные результаты приведены в табл. 4.

В результате экспериментов установлено, что наибольшее извлечение о-толуидина из крови при экстракции хлороформом с последующим кипячением 15 с. Чувствительность способа 0,04 мг/дм³. Погрешность определения 2,2%. Возможно определение 0,0001 мкг о-толуидина в анализируемом объеме пробы.

Таким образом, данным способом можно с высокой степенью точности и чувствительности определять о-толуидин в крови.

Применение предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения о-толуидина в 10 раз.