штамм бактерии alteromonas haloplanktis - продуцент полиуридил-эндорибонуклеазы

Формула изобретения

ШТАММ БАКТЕРИИ ALTEROMONAS HALOPLANKTIS - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИУРИДИЛ-ЭНДОРИБОНУКЛЕАЗЫ.

Штамм бактерии Alteromonas haloplanktis ВКПМ В-3906 - продуцент полиуридил-эндорибонуклеазы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии и представляет собой штамм, продуцирующий эндорибонуклеазу, специфически расщепляющую полиуридиловую кислоту. Данная эндорибонуклеаза может быть использована в качестве инструмента исследования структурно-функциональной организации рибонуклеиновых кислот.

Описаны эндорибонуклеазы эукариотического и микробного происхождения, проявляющие специфичность к полиуридиловой кислоте, выделенные из личинок средиземноморской плодовой мухи Ceratitis capitata [1], из тимуса теленка [2] , а также из культуральной жидкости миксомицета Physarum polycephalum [3]. Из высокоспецифичных нуклеаз описаны пиримидинспецифичные эндорибонуклеазы, выделенные из личинок ракообразных Artemia salina [4] и из крови больных системной красной волчанкой [5].

Большую группу эндонуклеаз составляют эндонуклеазы микроорганизмов. Микроорганизмы из различных таксономических групп могут образовывать эндонуклеазы, аналогичные по биохимическим свойствам. Большое число эндорибонуклеаз, продуцируемых микроорганизмами, не имеет определенной специфичности. Среди них найден только один тип рибонуклеаз, обладающих высокой специфичностью, это гуанилрибонуклеазы. Ферменты такого типа выделены из разных источников, например бактерии Bacillus pumilus, некоторых видов актиномицетов.

Не обнаружено микроорганизмов, в частности штаммов бактерий, продуцирующих пиримидинспецифичные эндорибонуклеазы.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, сводилась к поиску штамма, продуцирующего эндорибонуклеазу, расщепляющую полиуридиловую кислоту.

Известно, что микроорганизмы, выделенные из морской среды (свободноживущие и ассоциированные с животными), способны синтезировать различные ферменты, в том числе нуклеазы. В процессе исследования нуклеазной активности глубоководных морских микроорганизмов выделен штамм бактерии Alteromonas haloplanktis, продуцирующий эндорибонуклеазу, специфически расщепляющую полиуридиловую кислоту.

Штамм изолирован из морской воды путем прямого посева на среду Горбенко 0,1 мл морской воды. Пробы отбирали на глубине 1950 м в северо-западной части Тихого океана.

Штамм Alteromonas haloplanktis депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером В-3906. Хранится в Тихоокеанском институте биоорганической химии под номером КММ 223.

Штамм выбран по признаку наибольшей удельной активности по отношению к полиуридиловой кислоте и идентифицирован как штамм бактерии вида Alteromonas haloplanktis.

Культуру хранят в пробирках на агаризованной среде следующего состава, г/л: глюкоза 1,0; пептон 5,0; дрожжевой экстракт 2,5; К₂НРО₄ 0,2; MgSO₄ 0,05; агар-агар 2,0, морская вода 750 мл; вода дистиллированная 250 мл; рН 7,2-7,8 под вазелиновым маслом, а также в лиофилизированном состоянии на обезжиренном молоке при 4^оС.

Культурально-морфологические признаки. Клетки палочковидные, прямые, одиночные, размеры клеток 0,6-0,8 в диаметре и 1,5-1,7 мкм в длину. Спор и капсул не образуют. Подвижные с помощью одного полярного жгутика. На плотных питательных средах образуют круглые, выпуклые, блестящие, полупрозрачные колонии слизистой консистенции. Пигмента не образуют. При росте в жидкой среде образуют однородное, постоянное и умеренное помутнение.

Физиолого-биохимические признаки. Грамотрицателен, аэроб. Реакции на оксидазу и каталазу положительны. Имеет дыхательный тип метаболизма. Гемоорганотроф. Утилизирует глюкозу, маннозу, сахарозу, ацетат натрия в качестве единственного источника углерода. Гидролизует твин-80. Амилазу и хитиназу не образует. Не растет на средах, не содержащих хлористый натрий. Хорошо растет на средах с добавлением морской воды в интервале рН 7,2-7,8. Температурный оптимум роста 20-25^оС.

Генотаксономические признаки. Молярный процент содержания Г + Ц пар в ДНК составляет 42,1.

Штамм A. haloplanktis КММ 223 непатогенен и нетоксичен для человека и животных. Штамм A.haloplanktis культивируют на модифицированной среде Youshimizu-Kimura следующего состава г/л; пептон 5,0; дрожжевой экстракт 2,5; глюкоза 1,0; К₂НРО₄ 0,2; MgSO₄ 0,05; морская вода 750 мл, дистиллированная вода 250 мл, рН 7,2-7,5. Выращивают при качании 120 об/мин в течение 48 ч. Бактериальные клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием при 5000 об/мин. Выход сырой клеточной биомассы составляет 5 г/л.

Штамм A.haloplantkis КММ 223 продуцирует эндорибонуклеазу, расщепляющую полиуридиловую кислоту. Выход фермента составляет 0,1 мг на 1 г сырой биомассы, активность фермента 3000 ед/мг.

Способ выделения эндорибонуклеазы, специфически расщепляющую полиуридиловую кислоту, иллюстрируется примером.

120 г полученной биомассы клеток бактерии A.haloplanktis суспендируют в 3,6 л буфера А (0,01 М трис HCl, 0,005 M MgCl₂ 0,02% NaN₃; рН 8,0), обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе при 22 кГц в течение 36 с пятикратно порциями по 80 мл, охлаждая во льду. Полученный гомогенат центрифугируют при 5000 об/мин и температуре 0^оС в течение 30 мин. Супернатант фракционируют сульфатом аммония. Фракцию, осажденную между 35,0 и 65,0% насыщения, разбавляют буфером Б (0,01 М трис HCl, 0,005 М MgCl₂; 0,02% NaN₃; 1,5 MGA; рН 8,0) до концентрации белка 4-5 мг/мл и экстракт наносят на колонку с гидрофобным сорбентом (бензоиламиногептиламиносефароза - 4 В), уравновешенную тем же буфером. Колонку промывают буфером Б и элюируют буфером А. Активную фракцию диализуют против буфера А и наносят на уравновешенную тем же буфером колонку с анионообменником (TSK-gel DEAE-Toyopearl). Колонку промывают буфером А и проводят элюцию градиентом NaCl (0-0,5 М) в буфере А. Активную фракцию, элюируемую при 0,3 М NaCl, концентрируют методом ультрафильтрации.

Схема очистки фермента представлена в таблице.

Свойства эндорибонуклеазы. Фермент представляет собой белок субъединичного строения с мол.м. 52 кДа, состоящей из двух идентичных полипептидных цепей с мол.м. 26 кДа каждая. Оптимум рН 8,2-8,5. Активность стимулируется катионами Mg⁺⁺ и высокой концентрацией NaCl (0,2-0,5 М).

В результате исследования специфичности по отношению к синтетическим полирибонуклеотидам и РНК показано, что РНКаза штамма КММ 223 A.haloplanktis с высокой скоростью гидролизует полиуридиловую кислоту. Гидролиз осуществляется по эндонуклеазному механизму с образованием конечных продуктов - пентануклеотидов с 5"-фосфатными концевыми группами. Фермент также гидролизует альтернирующие гомополирибонуклеотиды - поли (АУ) 4:6 и поли (АУ) 9: 1. Относительная скорость ферментного гидролиза этих субстратов уменьшается в следующем порядке:

поли У > поли (АУ) 4:6 > поли (АУ) 9:1. Другие синтетические гомополирибонуклеотиды и природные РНК до кислоторастворимых продуктов выделенный фермент не расщепляет.