способ получения полипептида, способного блокировать кальциевые канальцы

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, СПОСОБНОГО БЛОКИРОВАТЬ КАЛЬЦИЕВЫЕ КАНАЛЬЦЫ, путем хроматографического разделения яда паука Agelenopsis aperta в диапазоне 220-230 нм на колонке типа Vidac^R C-18 с размером пор посредством элюирующей смеси из ацетонитрила и 0,1%-ной водной трифторуксусной кислоты при градиентном увеличении содержания ацетонитрила в трифторуксусной кислоте, отличающийся тем, что используют колонку 22 250 мм с размером частиц 10 мкм, элюирующую смесь подают при скорости потока 15 мл/мин по программе 0-30 мин при 5-20%-ном содержании ацетонитрила, 30-55 мин при 20-70% ацетонитрила в 0,1% -ной трифтоуксусной кислоте, затем собирают фракцию на 41,5 мин элюирования, подвергают ее хроматографии на колонке того же типа 10 250 мм с размером частиц 5 мкм, элюируют при скорости потока 3,5 мл/мин изократической системой растворителей из 70% 0,1%-ной водной трифторуксусной кислоты и 30% ацетонитрила в том же диапазоне, затем собирают фракцию, элюируемую на 7,5 мин, при необходимости подвергают ее лиофилизации, суспендированию в воде, лиофилизации и получают целевой продукт со следующей характеристикой:

- аминоконцевая аминокислотная последовательность содержит H₂N - Lys - Lys - Lys - Cys Jle - Ala - Lys - Asp - Tyr - Gly - Arg - Cys - Lys - Trp - Gly - Gly - Thz - Pro - Cys - Cys - Arg - Gly - Arg - Gly - Cys - Jle - Cys - Ser - Jle - Met - Gly - Tnr - Asn - Cys - Glu - Cys - Lys - Pro - Arg - Leu - Jle - Met - Glu - Gly - Leu-;

- молекулярная масса 5201;

- данные масс-спектрометрии: в 0,1 мл 5%-ной уксусной кислоты (М + 5H)⁵+ 1041, 20.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к полипептидам, обнаруженным в яде паука Agelenopsis aperta, и к полипептидам, обладающим по существу той же аминокислотной последовательностью и по существу той же активностью, что и указанный полипептид. Эти полипептиды и их приемлемые с фармацевтической точки зрения соли блокируют кальциевые каналы в клетках, включая нейронные и мышечные клетки различных организмов, включая беспозвоночных и позвоночных. Предлагаемый способ относится также к использованию этих полипептидов и их солей для блокирования кальциевых каналов в клетках, например в клетках нервной и мышечной систем организма, при лечении заболеваний и симптомов, вызванных нарушением функционирования кальциевых каналов у млекопитающих, и для борьбы с беспозвоночными паразитами. Кроме того, изобретение относится к композициям, содержащим указанные полипептиды и их соли.

Известно, что яд паука Agelenopsis aperta содержит по крайней мере два токсина, которые оказывают влияние на кальциевые потоки (Джексон Г. и др. Soс. Heu. Sci.Astr, т.12, 1987 с.1078). Токсин имеет молекулярный вес менее 1000 дальтон и замедляет кальциевые потоки в самых разнообразных тканях.

В другой работе (Джексон. Г. и др. Soc. Heu.Sci.Astr., т.12, 1986, с. 730), описан другой токсин из Agelenopsis aperta, содержащий компоненту в примерно 6000 м.в. Этот токсин осуществляет предсинаптическую блокаду передачи сигнала и блокирует кальциевые каналы, связанные с выделением нейротрансмиттера.

Некоторые полипептиды, которые содержатся в яде паука Agelenopsis aperta, известны из заявки США N 07/346181, 1989. Такие полипептиды описаны там как блокаторы кальциевых каналов в клетках и описаны следующим образом в соответствии с фракциями, в которых они обнаружены .

Фракция С. Аминоконцевая аминокислотная последовательность, содержащая H₂N-glu-lys-gly-leu-pro-glu-gly-ala-glu- -cys-asp-gly-asn-glu-ser-asp-cys-lys-cys-ala- -gly-gen-trp-ile-lys-cys-arg-cys-pro-trp-lys-trp--his-ile-thr-gly-glu-gly-pr o-cys-t -gly-leu-lys-lys-thr-cys-ile-ser-lys-leu-ser-asp- -pro-asn-arg-asn-glu-trp-leu-ser-,

мол.мас. для полного полипептида в соответствии с FAB и MS:7267.

Фракция Н₁.

Н₂N-ala-cys-val-gly-ghe-asn-gen-gem-cys- -ala-asp-trp-ala-gly-prp-his-cys-cys-asp-gly- -tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe-pro-lys-cys- -ile-cys-arg-asn.

Фракция Н₂. Аминоконцевая аминокислотная последовательность, содержащая H₂N-ala-lys-ala-leu-pro-pro-gly-ser-val-cys- -asp-gly-asn-glu-ser-asp-asp-cys-lys-cys-tyr- -gly-lys-trp-his-lys-cys-ary-cys-pro-pro-lys-gly- -his-phe-thr-, м.мас. полного полипептида в соответствии с FAB М: 5494.

Фракция 1. Н₂N-asp-cys-val-gly-glu-ser--gen-gen-cys-ala-asp-trp-ala-gly-pro-his-cys- -cys-asp-gly-tyr-tyr-cys-thr-cys-arg-tyr-phe- -pro-lys-cys-ile-cys-val-asn-asn-asn-CONH₂; FAB MS; 4158.

Фракция J. Аминоконцевая аминокислотная последовательность, содержащая H₂N-asp-glu-pro-cys-ile-pro-leu-gly-lys-ser-cys--ser-trp-lys-ile-gly-thr-pro -tyr-pro-asp-asp-ala-, м.мас. для полного полипептида в соответствии с FAB MS:5505.

Фракция К. H₂N-glu-asp-asn-cys-ile-ala- -glu-asp-tyr-gly-lys-cys-thr-trp-gly-gly-thr-lys- -cys-cys-arg-gly-arg-pro-cys-arg-cys-ser-met- -ile-gly-thr-asn-cys-glu-cys-thr-pro-arg-leu- -ile-met-glu-gly-leu-ser-phe- ala - CONH₂, FAB MS: 5274.

Фракция L₁. Аминоконцевая аминокислотная последовательность, содержащая Н₂N-ile-val-gly-gly-lys-thr-ala-lys-phe-gly- -asp-tyr-pro-trp-met-val-ser-ile-gen-gen-lys- -asn-lys-lys-gly-gly-phe-asp, приблизительный м.мас. для полного полипептида составляет примерно 20000.

Фракция L₂. Полипептид, имеющий следующие идентифицирующие характеристики:

(а) содержится во фракции из сырого яда паука Agelenopsis aperta, который элюируют на колонне ВидакС-18, 22х250 мм, размер пор 300 , размер частиц 10мкм, используется объемная скорость 15 мл/мин, система растворителей с программой линейного градиента: 5%->>20% В, 95%->>80% А [0->>30 мин], затем 20% ->>70% В, 80% ->>30% А [30->>55 мин], где А - 0,1% водной ТФК (трифторуксусной кислотой); В - ацетонитрил Н₂ примерно на 43 минуте;

b, содержится в фракции, которая описана в а, которую элюируют при помощи колонны типа Видак С-18, 10х250 мм, размер пор 300 , размер частиц 5 мкм, используется объемную скорость 3,5 мл/мин и система растворителей с программой линейного градиента: 25%->>40% В, 75%->> ->>60% А [0->>30 мин], где А - 0,1% водной ТФК; В - ацетонитрил на примерно 22,5 минуте.

Фракция М. Аминоконцевая аминокислотная последовательность, содержащая H₂N-glu-ala-thr-glu-ala-ala-lys-val-len- ser-asn-leu-asp-glu-thr-val-asp-pro-, приблизительный м.мас. для полного полипептида составляет приблизительно 80000.

Соединения, которые являются антагонистами кальция имеют самые разнообразные применения. Антагонисты кальция могут найти клиническое применение при лечении таких заболеваний, как ангина, гипертония, кардиомиопатия, надвентрикулярная аритмия, эзофагиальная ахалазия, преждевременные роды и заболевание Рейно среди других. (Найлер У.Дж. Антагонисты кальция. Нью-Йорк: Академик Пресс, Харкурт Брейс Яванович Паблишерз, 1988). Кроме того, такие соединения используют для изучения физиологии клеток таких, как нейронные и мышечные клетки, и в борьбе с беспозвоночными паразитами.

Изобретение относится также к полипептидам, обнаруженным в яде паука Agelenopsis aperta. Указанный полипептид и фракция, в которой он присутствует, в соответствии с настоящим изобретением могут быть описаны следующим образом.

Фракция Q.

а) содержится в фракции из неочищенного яда паука Agelenopsis aperta, которую элюируют на колонне Видак С-18, 22х250 мм, размер пор 300 , размер частиц 10 мкм, используется объемную скорость 15 мл/мин, система растворителей, состоящая из программы с линейным градиентом: 5%->>20% В [0->>30 мин] , затем 20%->>70% В [30->>55 мин], где А - 0,1% водной трифторуксусной кислотой (ТФК); В - ацетонитрил на примерно 41,5 минуте;

b) содержится в фракции, описанной в а, которую элюируют на колонне Видак С-18, 10х250 мм, размер пор 300 , размер частиц 5 мкм, используется объемную скорость 3,5 мл/мин, система растворителей в виде изократической системы, содержащей 70% А, 30% В, где А - 0,1% водной ТФК; В - ацетонитрил в течение 7,5 минут;

с) аминоконцевая аминокислотная последовательность, содержащая

H₂N - hys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr- -gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys- -arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr- -asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu--gly-leu-.

Полипептиды, являющиеся предметом настоящего изобретения, блокируют кальциевые каналы в клетках. Поэтому эти полипептиды используются для блокирования кальциевых каналов. Полипептид используют также для борьбы с беспозвоночными паразитами и при лечении заболеваний и симптомов у млекопитающих, связанных с функционированием кальциевых каналов в клетках. Кроме того, предлагаемые полипептиды, обладают по существу той же аминокислотной последовательностью и по существу той же блокирующей кальциевые каналы активностью, что и известный полипептид.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтическим композициям, содержащим указанные полипептиды, и способам применения полипептидов.

Яд получают из паука Agelenopsis aperta через процесс "доения" при помощи электрического стимулирования в соответствии со стандартными приемами. В предпочтительном варианте используют такой прием, который бы гарантировал отсутствие примесей в цельном яде, например частиц пищи паука или гемолимфы. Такие приемы хорошо известны. Полученный таким образом цельный яд хранят в замороженном состоянии при температуре примерно -78^оС до его использования с целью очистки.

Очистку компонент из цельного яда осуществляют при помощи обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на различных препаративных и полупрепаративных колоннах, таких как колонны типа Видак С-4 и С-18 (фирма Рейнин Инструмент Ко.Инк., Мак Роад, Уоберн Массачузетс 01801). Обнаружение пиков осуществляют монохроматически в диапазоне 220-230 нм. Последующий анализ этих фракций может быть осуществлен, например, при помощи полихроматических УФ-данных, собранных с использованием детектора с набором диодов типа Уотерз 990 (фирма Миллипор Корпорэйшн, Уортерз Хроматографи Дивижн, 34 Мэпл Стрит, Милфорд, Массачузетс 01757). Фракции из колонн собирают при помощи известных приемов, таких как применение коллектора фракций ИСКО/"ФОКСИ" и детектора пиков ИСКО 2159 (фирма ИСКО, 4700 Супериор, Линкольн, Небраска 68504). Эти фракции собирают в сосуды соответствующего размера, например стерильные полиэтиленовые лабораторные стаканы. Концентрирование фракций затем осуществляют при помощи лиофилизации из элюента с последующей лиофилизацией из воды. Чистоту полученных фракций компонентов можно определить при помощи хроматографического анализа, используя аналитическую колонну с градиентной системой, которая является более изокритической, чем система, используемая для финальной очистки фракции.

Структуры, содержащиеся в соответствующих фракциях, определяют в соответствии с известными аналитическими приемами такими, как масс-спектроскопия и ядерный магнитный резонанс. Последовательность полипептида фракции Q определяют при помощи известных приемов. Например, S-пиридилэтилирование остатков цистина полипептида может быть осуществлено в растворе с последующим анализом аминокислотной последовательности полипептида. Одна такая процедура для S-пиридилэтилирования заключается в следующем. Примерно 1-10 мг полипептида растворяют или разбавляют в примерно 50 мл буфера, полученного при помощи смешения части 1М трисНСl, рН 8,5, содержащего 4 мм ЭДТК, и 3 частей 8М гуанидина, НСl. Затем добавляют 2,5 мл 10%-ного водного раствора 2-меркаптоэтанола и смесь инкубируют при комнатной температуре в темноте в атмосфере аргона в течение 2 ч. После инкубирования добавляют 2 мл 4-винилпиридина (свежего реагента, хранящегося в атмосфере аргона при -20^оС) и смесь инкубируют еще в течение 2 ч при комнатной температуре в темноте в аргоне. Здесь смесь обессоливают, в предпочтительном варианте при помощи короткой колонны для обращенно-фазовой хроматографии. Последовательность выделенного алкилированного полипептида затем анализируют при помощи известных приемов.

При осуществлении предлагаемого способа было установлено, что соответствующей колонной для первоначального фракционирования яда является колонна типа Видак С-18, 22х250 мм, размер пор 300 , размер частиц 10 мкм. Эту колонну элюируют с объемной скоростью 15 мл/мин, используя программу с линейным градиентом: 95%->>80% А, 5%->>20% В (0->>30 мин), затем 80%->>30% А, 20%->>70% В (30->>55 мин), где А - 0,1% водной трифторуксусной кислотой (ТФК); В - ацетонитрил. Эти фракции собирают. Полученную таким образом фракцию, отбирают для дальнейшей очистки. Время элюирования фракции составляет примерно 41,5 мин.

Фракцию Q¹ подвергают дальнейшей очистке, используя колонну типа Видак С-18, 10х250 мм, размер пор 300 , размер частиц 5 мкм, с объемной скоростью 3,5 мл/мин, используя isocratic систему 70% 0,1%-й водной ТФК, 30% ацетонитрила. Эти фракции собирают.

Фракцию Q элюируют из колонны в течение примерно 7,5 мин. Установлено, что фракция, которую элюировали на примерно 8,3 минуте, содержит полипептид, который известен как фракция К. Фракция Q содержит полипептид, включающий аминоконцевую аминокислотную последовательность, содержащую

H₂N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tyr- -gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys- -arg-gly-arg-gly-cys-ile- cys-ser-ile-met-gly- -thr-asn-cys-glu-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met- -glu-gly-leu-.

После того как дано описание соединения, содержащегося в фракции Q яда паука Agelenopsis aperta, имеется возможность получить указанное соединение при помощи процедур, отличных от изоляции/очистки из цельного яда. Полипептид может быть получен с использованием приемов рекомбинатной ДНК через клонирование кодирующей последовательности для полипептида или ее частей. Например, зонды для гибридизации, которые обладают преимуществом для аминокислотных последовательностей указанного полипептида, могут быть использованы в соответствии с хорошо известными приемами для клонирования кодирующей последовательности для полного полипептида. Комбинация приемов рекомбинантной ДНК и синтеза протеина "ин витро" может быть также использована, чтобы получить полипептиды. Такие приемы синтеза протеина "ин витро" включают использование синтезатора пептидов в твердой фазе АВ1 430А (фирма Апплайед Биосистемэ, Инк., Линкольн Cентер Драйв 850, Фостер Сити, Калифорния 94404), используя стандартную химию Меррифилда или другие химии в твердой фазе.

Известно, что некоторые аминокислотные замещения могут быть осуществлены в полипептидах, которые не нарушают или по существу не нарушают функции полипептидов. Конкретные возможные замещения, изменяются от полипептида к полипептиду. Определение допустимых замещений осуществляют в соответствии с известными процедурами. Таким образом, полипептиды, содержащие по существу ту же аминокислотную последовательность и обладающие той же активностью по блокаде кальциевых каналов, содержатся в области, охватываемой настоящим изобретением.

Полипептиды необратимо блокируют кальциевые каналы, содержащиеся в различных клетках, таких как нервные и мышечные клетки беспозвоночных и позвоночных.

Способность полипептидов блокировать кальциевые каналы подтверждается при помощи следующей процедуры. Мозжечковые лаброциты получают из мозжечка край в возрасте 8 дней. Квадраты (1 см²) из Аклара покрывают поли-L-лизином и помещают в чашки с 12 углублениями, которые содержат 1 мл базисной среды Иглза. Клетки диссоциируют и порции, содержащие 6,25х10⁶ кл. добавляют в каждое углубление, содержащее квадраты из Аклара. После этой процедуры 24 ч добавляли цитозин-бета-D-арабино фуранозид (финальная концентрация 10 мМ). Клетки используют для фура2-анализа на 6, 7 и 8 день культивирования. Клетки, прилипшие к квадратам из Аклара, переносят в чашки с 12 углублениями, содержащими 1 мл 2 мМ фура2/АМ (фирма Молекулар Пробз Инк., Эугек, ОР, 97402) в буфере НЕРЕS, содержащем 0,01% альбумина бычьей сыворотки, 0,01% декстрозы, рН 7,4; магния нет. Клетки инкубируют в течение 40 мин при 37^оС; буфер, содержащий фура2/АМ, удаляют и заменяют 1 мл того же буфера, но без фура2/АМ. В кварцевую кювету добавляют 2 мл предварительно нагретого (37^оС) буфера. Клетки на Акларе помещают в кювету и ее вставляют в термостатированный (37^оС) держатель, снабженный магнитной мешалкой; флуоресценцию измеряли спектрофотометром флуоресценции. Сигналу флуоресценции дают возможность стабилизироваться в течение примерно 2 мин. Далее в кювету добавляют 5-20 мл сырьевого раствора изучаемого соединения в буферированном фосфатом соляном растворе (БФСР, рН 7,4) в соответствующих концентрациях. Калибровку флуоресцентного сигнала и коррекцию связи фура2/АМ осуществляют с использованием известных процедур Немета и др. (J.Biol.Chem, т.262, 1987, с.5188), по завершении каждого испытания максимальное значение флуоресценции (F_макс) определяют при помощи добавления иономицина (35 мМ), а минимальное значение флуоресценции (F_мин) определяют при помощи последующего добавления ЭГТК (12 мМ) в хелаткальций. Используя указанную процедуру, блокаду кальциевого канала предлагаемым соединением устанавливают снижением флуоресценции при добавлении исследуемого соединения.

Полипептид данного изобретения используют в качестве блокаторов кальциевых каналов в клетках. Предлагаемые соединения можно также использовать для борьбы с беспозвоночными паразитами и при лечении заболеваний и симптомов, вызванных нарушением функционирования кальциевых каналов в клетках млекопитающих, таких как ангина, гипертония, кардиомиопатия, надвентрикулярная аритмия, преждевременные роды и заболевание Рейно. Кроме того, предлагаемые соединения используют при изучении физиологии клеток, включающих клетки нервной и мышечной систем.

Кроме того, в области, охватываемой настоящим изобретением, находятся приемлемые с фармацевтической точки зрения соли полипептидов. Такие соли получают при помощи процедуры, хорошо известной каждому специалисту. Например, щелочные соли полипептидов могут быть получены в соответствии с известными приемами.

Если полипептид предназначен для млекопитающего, то его можно применять отдельно или в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем в фармацевтической композиции в соответствии с фармацевтической практикой. Полипептиды могут быть применены стоматически или парентерально, причем парентеральный способ предпочтителен для этих полипептидов. Парентеральное применение включает внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный, подкожный и местный способы.

При стоматическом использовании полипептида соединение может быть применено, например, в форме таблеток, или капсул, или в форме водного раствора или суспензии. В случае таблеток для стоматического использования носители, которые используют, включают лактозу, кукурузный крахмал и смазочные агенты, такие как стеарат магния. Для стоматического применения в форме капсул полезными разбавителями являются лактоза и высушенный кукурузный крахмал. Если для стоматического применения необходимы водные суспензии, то активный ингредиент соединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. Если это необходимо, можно добавить вкусовые и/или ароматизирующие агенты.

Для внутримышечного, внутрибрюшинного, подкожного и внутривенного использования в общем случае получают стерильные растворы активного ингредиента и рН растворов должно быть соответствующим образом отрегулировано и буферировано. Для внутривенного использования общую концентрацию растворенных веществ необходимо регулировать, чтобы получить изотонную препарацию.

Если полипептид или его соль, являющиеся предметом настоящего изобретения, используют для человека, то ежедневная доза может быть в общем случае определена лечащим врачом. Кроме того, доза может варьироваться в зависимости от возраста и веса, а также от индивидуальной реакции и серьезности симптомов пациента; доза также зависит от активности конкретного соединения.

Если полипептид или его соль используют для борьбы с беспозвоночными паразитами, то полипептид применяют непосредственно или в среде, окружающей это беспозвоночное. Например, соединение можно разбрызгивать в виде раствора на беспозвоночное. Количество соединения, необходимое для борьбы с беспозвоночным, варьируется в зависимости от вида беспозвоночного и окружающих условий и может быть определено специалистом, применяющим такое соединение.

Если полипептид или его соль используют для физиологического изучения клеток, то полипептид применяют в соответствии с приемами, хорошо известными каждому специалисту. Например, полипептид может быть применен для клеток в соответствующем физиологическом буфере. Концентрация соединений, для использования в таких исследованиях равна 100 мМ. Однако концентрация такого полипептида может быть выше или намного ниже чем 100 мМ. Количество применяемого соединения может быть определено любым специалистом при помощи хорошо известных приемов.

П р и м е р 1. Начальное фракционирование цельного яда из Agelenopsis aperta.

Цельный яд паука Agelenopsis aperta, полученного от фирмы Нэйчерэл Продакт Сайенс Инк. , Солт Лейк Сити, Юта 841008, и который хранили в замороженном состоянии при температуре примерно -78^оС, оттаивали и порции его в 10-60 мл, разбавленные до 200 мл, загружали на колонну типа Видак С-18 (22х250 мм, размер пор 300 , размер частиц 10 мкм) и элюировали, используя объемную скорость 15 мл/мин и систему растворителей с линейным градиентом: 5% ->>20% В, 95% ->>80% А [0->>30 мин], затем 20%->>70% В, 80% ->>30% А [30->>55 мин], где А - 0,1% водной ТФК; В - ацетонитрил. Обнаружение пиков осуществляли монохроматически в диапазоне 220-230 нм, фракции собирали при помощи коллектора фракций ИСКО/"ФОКСИ" и детектора пиков ИСКО 2159. Фракции собирали с 20 по 60 минуту. Фракцию Q¹ собирали на примерно 41,5 минуте.

П р и м е р 2. Субфракционирование фракции Q¹ и определение в ней структур.

Фракцию Q¹, полученную по примеру 1, загружали на колонну типа Видак С-18 (10х250 мм, размер пор 300 , размер частиц 5 мкм) и элюировали из нее, используя объемную скорость 3,5 мл/мин и изократическую систему растворителей из 70% А, 30% В, где А - 0,1% водной ТФК; В - ацетонитрил. Обнаружение пиков осуществляли, используя детектор с серией диодов Уотерз 990, фракции собирали по примеру 1. Две фракции получали следующим образом: Фракция Время элюирования Q примерно 7,5 минута К примерно 8,3 минута

Фракции Q и К, которые содержали полипептиды, затем подготавливали для анализа последовательности при помощи лиофилизации из элюента с последующей лиофилизацией из воды в соответствии с известными приемами.

Анализ аминокислот алкилированного полипептида из фракции Q и К осуществляли при помощи Пико-Таг-процедуры Уотерз в соответствии с инструкциями производителя. Данные относительно последовательности собирали при помощи анализатора последовательностей протеина-пептида фирмы Апплайед Биосистемз модели 4705 с превращением водной ТФК. Анализ полученных в результате фенилтиохидантоин аминокислот осуществляли в режиме "он лайн" при помощи анализатора РТН фирмы Апплайед Биосистемз модели 120А или в режиме "офф лайн" на колонне РТН фирмы Дюпон Зорбакс.

В результате анализа аминокислот определяли аминоконцевую аминокислотную последовательность части полипептида, содержащегося в фракции Q, которая имеет следующий вид:

Н₂N-lys-lys-lys-cys-ile-ala-lys-asp-tgr- -gly-arg-cys-lys-trp-gly-gly-thr-pro-cys-cys- -arg-gly-arg-gly-cys-ile-cys-ser-ile-met-gly-thr- -asn-cys-gly-cys-lys-pro-arg-leu-ile-met-glu- -gly-leu-.

В результате аминокислотного анализа было установлено, что фракция К содержит полипептид фракции К, описанный выше и предложенный в патентной заявке США N 07/346 181.