инактивированная вакцина против венесуэльского энцефаломиелита лошадей и способ ее получения

Формула изобретения

1. Инактивированная вакцина против венесуэльского энцефаломиелита лошадей, включающая инактивированный формальдегидом вируссодержащий материал из штамма венесуэльского энцефаломиелита лошадей, гидроокись алюминия и разбавитель, отличающаяся тем, что из штаммов вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей используют штамм Тринидад, инактивированный формальдегидом, с активностью 3,3 3,9 lg ГАЕ, а из разбавителей - забуференный физиологический раствор pH 7,3 0,1 при следующем соотношении компонентов,

Вируссодержащий материал из штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей Тринидад, инактивированный формальдегидом, с активностью 3,3 3,9 lg ГАЕ 0,009 0,011

Гидроокись алюминия 0,09 0,11

Забуференный физиологический раствор pH 7,3 0,1 Остальное

2. Способ получения инактивированной вакцины против венесуэльского энцефаломиелита лошадей, включающий размножение штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей в культуре клеток, сбор вируссодержащего материала с последующей концентрацией, очисткой в градиенте сахарозы, инактивацией формальдегидом и сорбцию на гидроокиси алюминия, отличающийся тем, что из штаммов венесуэльского энцефаломиелита лошадей используют штамм Тринидад, из культур клеток используют культуру диплоидных клеток легкого эмбриона человека Л-68, клетки заражают вирусом в дозе 0,1 0,0160 Е/клетку, культивирование проводят при 37^oС в течение 18 24 ч, перед очисткой вируссодержащий материал обрабатывают ультразвуком трехкратно по 15 с при 25 кГц и частоте 60 нм, инактивацию очищенного вируса осуществляют в течение 48 ч, а сорбцию вируса на гидроокиси алюминия проводят в соотношении 0,8 8 1,2 12 при рН 7,3 0,1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к производству вирусных вакцинных препаратов.

Известна инактивированная вакцина ВЭЛ на основе аттенуированного штамма ТС-83, названная С-84, которая индуцирует синтез вируснейтрализующих антител в организме животных и человека и обеспечивает протективный эффект у иммунизированных. В состав вакцины входят штамм ТС-83 и культуральная жидкость.

Вакцину С-84 получают путем размножения вируса ТС-83 на культуре фибробластов утиных эмбрионов в течение 20 ч при 37^оС с последующим сбором вируссодержащей культуральной жидкости, очисткой при помощи фильтрации и инактивацией 0,1% -ным раствором формалина при 37^оС в течение 3 сут. Титр вирусного материала до инактивации составляет 9,5-10,0 lg/мл.

Недостатком вакцинного препарата С-84 является невысокая иммуногенная активность, проявляющаяся, в частности, отсутствием защиты при аэрозольном способе заражения, который является одним из основных путем инфицирования сотрудников лабораторий, имеющих непосредственный контакт с вирулентными штаммами вируса ВЭЛ.

Цель изобретения повышение иммуногенной активности вакцинного препарата и создание защиты при аэрозольном способе заражения.

Вакцину готовят из вирулентного штамма Тринидад вируса ВЭЛ (получен из коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского, ГКВ N 536) путем культивирования в клетках Л-68 (ВСКК (МБЧ) N 18/9/175).

Предлагаемая вакцина против венесуэльского энцефаломиелита лошадей имеет следующий компонентный состав,

Вируссодержащий материал

из штамма

Тринидад (с активностью

3,3-3,9 lg ГАЕ), инактивиро-

ванный формальдегидом 0,009-0,011

Гидроокись алюминия 0,09-0,11

Забуференный физиоло-

гический раствор,

рН 7,3 0,1 Остальное

Способ изготовления инактивированной вакцины против ВЭЛ заключается в следующем: диплоидные клетки фибробластов эмбрионов человека Л-68 (ВСКК (МБЧ) N 18/9/175) заражают штаммом Тринидад вируса ВЭЛ, ГКВ N 536, в дозе 0,1-0,01 БОЕ/клетку. Сбор вируссодержащей культуральной жидкости проводят через 18-24 ч культивирования при 37^оС, концентрируют полиэтиленгликолем с мол. м. 6000, обрабатывают ультразвуком 3 раза по 15 с при 25 кГц и частоте 60 нм, очистку вируса проводят в сахарозном градиенте. Очищенную вирусную суспензию подвергают инактивации 0,05%-ным формальдегидом в течение 48 ч и сорбируют вирусный материал на гидроокиси алюминия в соотношении 0,8-1,2/8-12 при рН 7,3 0,1. Конечная концентрация белка в вакцине составляет 100 10 мкг/мл, с активностью 3,3-3,9 lg ГАЕ.

Предложенный новый препарат вакцины против венесуэльского энцефаломиелита лошадей и способ его изготовления.

Новыми признаками способа по сравнению с прототипом являются следующие:

использование в качестве источника вируса ВЭЛ вирулентного штамма Тринидад, выращиваемого на диплоидных клетках легкого эмбриона человека Л-68;

перед концентрированием в сахарозном градиенте вирусный материал обрабатывают ультразвуком 3 раза по 15 с при 25 кГц с частотой 60 нм;

инактивацию очищенного вируса 0,05%-ным формальдегидом проводят в течение 48 ч;

сорбцию вируса на гидроокиси алюминия проводят при рН 7,3 0,1 в соотношении 0,8 1,2/8 12.

Полученная вакцина обладает более высокой иммуногенной активностью за счет полноты антигенного спектра вирулентного вируса по сравнению с аттенуированным штаммом; для наработки вируса используется аттестованная и разрешенная к использованию в СССР линия клеток Л-68; инактивации подвергают уже очищенный препарат вируса, за счет этого достигаются безопасность и ареактогенность вакцинного препарата.

Совокупность всех существенных признаков объектов изобретения экспериментально найдена, неизвестна из опубликованных источников информации, что позволяет сделать вывод о существенных отличиях предлагаемых объектов от известных.

П р и м е р 1. Монослой клеток линии Л-68 получают роллерным способом культивирования в роллерных бутылках объемом 2,0 л, посадочная концентрация 0,125-0,150 млн. клеток/мл среды. Через 72-96 ч среду культивирования сливают, монослой промывают раствором Хенкса и проводят заражение культуры штаммом Тринидад вируса ВЭЛ в дозе 0,1-0,01 БОЕ/клетку. Контакт вирус-клетка 45-60 мин при температуре 37 0,5^оС, после чего бутылки заливают поддерживающей питательной средой, состоящей из среды ДМЕМ с 1%-ной эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота, в объеме 100 мл на бутылку. Культивирование вируса проводят при температуре 37-0,5^оС в течение 18-24 ч в роллерной установке со скоростью вращения 15 об/ч. Полученную вируссодержащую культуральную жидкость обрабатывают полиэтиленгликолем, имеющим мол. м. 6000 (ПЭГ-6000), до создания конечной массовой доли 90 5 г/л и после полного растворения устанавливают в холодильник при температуре 4-6^оС на 18-20 ч. Затем вируссодержащую суспензию центрифугируют при 9000 об/мин в течение 30-40 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в забуференном растворе (ЗР) (0,02 М трис-HCl, 0,1 М хлористый натрий, водородный показатель 8,0 0,1 рН), объем которого составляет 1/10 к объему культуральной жидкости. Для полной дезагрегации вирусных конгломератов применяют ультразвуковой дезинтегратор, время озвучивания 3 раза по 15 с с промежутками, равными 10 с при 60 нм. Дезинтегрированный вирусный препарат наносят на 25%-ный раствор сахарозы и центрифугируют при 27000 об/мин в течение 2 ч при температуре 5^оС. После окончания центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 5-10 см³ ЗР. Дополнительную очистку проводят с использованием заранее приготовленного линейного градиента сахарозы (20-50% ), на который наносят вирусный препарат, полученный на предыдущем этапе. Центрифугирование осуществляют при скорости вращения, равной 27000 об/мин в течение 4 ч при температуре 5^оС. Опалесцирующую полосу на уровне 37% сахарозы, содержащую вирус, осторожно отбирают с помощью пипетки, разводят в двух объемах ЗР и наслаивают на 25%-ный раствор сахарозы. Центрифугируют при скорости вращения 35000 об/мин в течение 1 ч, удаляют надосадочную жидкость, а осадок суспендируют в забуференном физиологическом растворе, водородный показатель 7,4 0,2 рН. После определения общего белка по методу Лоури доводят концентрацию препарата до 200-300 мкг/см³ по белку и подвергают инактивации с помощью 0,05%-ного раствора формальдегида при температуре 37^оС в течение 48 ч. Конечная концентрация препарата по общему белку должна составлять 100 10 мкг/см³. Для усиления иммунного ответа к препарату инактивированной цельновирионной вакцины в качестве адъюванта добавляют гель гидроокиси алюминия в соотношении 0,8-1,2/8-12. Объем вакцины в ампуле составляет 2,0 0,1 см³, что соответствует четырем дозам для человека.

П р и м е р 2. Изучение безвредности, безопасности и иммуногенности инактивированной вакцины вируса ВЭЛ проводят на белых мышах, морских свинках и кроликах. Стерильность проверяют на тиогликолевой среде по ВФС-42-18-44-88.

Остаточную инфекционность определяют путем двукратного пассажа через мозг белых мышей при интрацеребральном инфицировании с последующим подкожным введением 10% мозговой суспензии белым мышам. Наблюдение осуществляют в течение 10 сут. Гибели животных не наблюдалось, вакцина лишена остаточной инфекционности.

Токсичность определяют на белых мышах и морских свинках. Для этого животным вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл готового препарата вакцины и наблюдают в течение 7 сут. Гибели, повышения температуры или падения массы животных не отмечалось, вакцина нетоксична.

Пирогенность проверяют на кроликах массой 2,5-3,0 кг, которым в наружную ушную вену вводят по 50 5 мкг вакцины без адъюванта с последующим измерение температурной реакции в течение 3 ч. Температурной реакции не наблюдали, т.е. препарат непирогенен.

Стерильность определяют при высеве проб на тиогликолевую среду, делят на две группы и устанавливают одну при 22^оС, другую при 37^оС. Наблюдение в течение 14 сут. Пророста не наблюдалось, вакцина стерильна.

Титр вируснейтрализующих антител в крови иммунизированных кроликов после однократного введения на 0 и 14 день 25 мкг достигал 2,2-2,5 lg, после двукратного 2,5-3,5 lg. Максимальное значение титра антител отмечается при однократной вакцинации на 21-28 день, при двукратной на 28-35 день после иммунизации и сохраняется до 9 месяцев (срок наблюдения).

П р и м е р 3. Протективную активность инактивированной вакцины определяют в экспериментах на белых мышах и кроликах породы "Шиншилла". Доза иммунизации для мышей составляют 2, 5, 8 и 10 мкг, для кроликов 10, 30, 50, 100 мкг. Инокуляцию препарата проводят однократно и двукратно с интервалом 14 дней подкожно. Срок наблюдения до заражения составляет 21-28 дней со дня последней иммунизации. В качестве вируса используют высоковирулентный штамм Тринидад вируса ВЭЛ. Заражение животных осуществляют как подкожно, так и аэрозольно, lg титра вируса составляет 9,5 0,5 ЛД₅₀ для данных животных при подкожном способе заражения.

Результаты экспериментов (табл.1 и 2) демонстрируют высокую протективную активность инактивированной вакцины, приготовленной на основе штамма Тринидад вируса ВЭЛ.

П р и м е р 4. Определение иммунологической характеристики инактивированной вакцины вируса ВЭЛ проводили на ограниченной группе волонтеров. Доза вакцинации составляла 50 10 мкг, через 14 дней инъекцию повторили той же дозой. Взятие крови и приготовление сыворотки осуществляли каждые 7 дней. Уровень вирусспецифических антител определяли в реакции радиоиммунного анализа (РИА). Результаты проверки представлены в табл.3.