способ получения ферментных препаратов мацерирующего действия

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНЫХ ПРЕПАРАТОВ МАЦЕРИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ, включающий измельчение свекловичного жома, гидролиз его содой кальцинированной или гидратом окиси калия в водной среде при повышенной температуре, отделение из щелочного гидролизата жидкой фракции, приготовление на ее основе питательной среды для выращивания штамма продуцента ферментов мацерирующего действия, содержащей фильтрат щелочного гидролизата свекловичного жома, мочевину, калий сернокислый и воду водопроводную, засев ее споровой суспензией продуцента, выращивание штамма продуцента в оптимальных условиях с последующим выделением препаратов, отличающийся тем, что, с целью расширения технологических возможностей способа за счет получения препаратов различного целевого назначения и удешевления процесса, в качестве штамма-продуцента берут Bacillus macerans ЦМПМ В-2692, культивирование ведут непрерывно в проточном режиме при скоростях протока 0,09 0,31 ч^-1, гидролиз свекловичного жома осуществляют при соотношении свекловичного жома, гидролизующего агента и водопроводной воды 5 8: 0,2 0,5 200 300, а в питательную среду дополнительно вводят дрожжевой экстракт в качестве источника ростовых веществ и витаминов при следующем соотношении входящих в нее ингредиентов, г/л:

Фильтрат щелочного гидролизата свекловичного жома 100 300

Дрожжевой экстракт 0,9 1,1

Мочевина 4 6

Калий сернокислый 0,9 1,1

Вода водопроводная До 1 л

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью получения препаратов, предназначенных для использования при получении осветленных соков из овощей и фруктов, устанавливают скорость протока 0,09 0,22 ч^-1.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что, с целью получения препаратов, предназначенных для использования при получении гомогенизированных соков из овощей и фруктов, устанавливают скорость протока 0,22 0,31 ч^-1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к микробиологической промышлености, производящей бактериальные ферментные препараты, и может быть использовано в различных отраслях народного хозяйства, где необходима мацерация растительных тканей, в легкой, пищевой, медицинской промышленности и кормопроизводстве.

Известен способ получения бактериального ферментного препарата мацерирующего действия, основанный на аэробном культивировании факультативно-аэробной культуры B.circulans 31 при 37-42^оС в течение 20-24 ч, причем рН среды перед засевом доводят до 8,0-8,4. По окончании процесса выращивания культуральную жидкость фильтруют на барабанном вакуум-фильтре, концентрируют на вакуум-выпарной установке при 37^оС до содержания сухих веществ 10-12% В конце культивирования активность ферментов достигала, ед/мл: пектат-трансэлиминаза 2,0; эндо-полигалактуроназа 2,3; экзо-полигалактуроназа 3,8 [1]

Недостатками указанного способа являются низкая активность ферментов мацерирующего комплекса, сложность технологического процесса.

Процессы получения ферментных препаратов более рентабельно проводить в проточном режиме культивирования.

Известны способы получения пектолитических ферментов в условиях непрерывного культивирования микроскопических грибов. Однако культивирование микроскопических грибов в непрерывных условиях с целью получения ферментов имеет ряд недостатков, которые заключаются в возможности пристеночного роста культуры гриба, гетерогенности биомассы, засорении трубопроводов грибной биомассой [2]

Способов получения пектолитических ферментных препаратов на основе культивирования бактериальных штаммов в непрерывных условиях в литературе не найдено.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения бактериального ферментного препарата пектат-трансэлиминазы мацерирующего действия, который включает культивирование продуцента B.circulans 31 в течение 10-12 ч при постоянном увеличении концентрации растворенного кислорода в питательной среде, температуре 36-50^оС и дозе спорового посевного материала 0,015-0,03% к объему питательной среды. В составе питательной среды в качестве индуктора биосинтеза пектат-трансэлиминазы используют продукты щелочной деградации пектина свекловичного жома в количестве 300-600 г/л или фильтрат этих продуктов в количестве 150-300 г/л. Продукты щелочной деградации пектина свекловичного жома получают при гидролизе молотого свекловичного жома при 115-135^оС в течение 0,5-1,5 ч в водной среде при использовании в качестве гидролизующего агента соды кальцинированной или гидрата окиси калия при соотношении свекловичного жома, агента и водопроводной воды как 12-15:0,5-1,5: 200-300. Фильтрат продуктов получают фильтрацией через сито с размером пор 1-2 мм. Активность ПТЭ 1300-1600 ед/мл, экзо-ПГ 7-9 ед/мл [3]

К недостаткам указанного способа относится следующее:

способ не дает возможности получать препараты с определенным соотношением компонентов пектолитического комплекса и, следовательно, различного целевого назначения;

большой расход свекловичного жома и гидролизирующего агента;

непроизводительные потери времени, связанные с затратами на разгрузку, загрузку и стерилизацию ферментера и на лаг-фазу;

накопление в культуральной жидкости нежелательных метаболитов, отрицательно влияющих на процессы препаратов.

Целью изобретения является расширение технологических возможностей способа за счет получения препаратов различного целевого назначения, удешевление способа.

Цель достигается тем, что проводят щелочной гидролиз свекловичного жома при температуре 115-135^оС в течение 0,5-1,5 ч в водной среде при использовании в качестве гидролизующего агента соды кальцинированной или гидрата окиси калия, отделяют жидкую фракцию и готовят на ее основе питательную среду для непрерывного культивирования продуцента мацерирующих ферментов B.macerans (коллекционный номер ЦМПМ В-2692); культивирование проводят при температуре 37-40^оС в непрерывном режиме при скоростях протока 0,09-0,31 ч^-1; гидролиз свекловичного жома осуществляют при соотношении свекловичного жома, гидролизующего агента и водопроводной воды как 5-8:0,2-0,5:200-300; а в питательную среду дополнительно вводят дрожжевой экстракт в качестве источника ростовых веществ и витаминов при следующем соотношении входящих в нее ингредиентов, г/л: фильтрат щелочного гидролизата свекловичного жома 100-300; дрожжевой экстракт 0,9-11; мочевина 4-6; калий сернокислый 0,9-1,1: вода водопроводная до 1 л; для получения препарата, предназначенного для использования при получении беспектиновых соков из овощей и фруктов, процесс ведут при скорости протока 0,09-0,22 ч^-1; для получения препарата, предназначенного для использования при получении гомогенизированных соков из овощей и фруктов, процесс ведут при скорости протока 0,22-0,31 ч^-1. При выходе культуральной жидкости из ферментера в нее вносят стабилизатор кальций хлористый 0,05-0,1% к объему и выделяют препарат одним из известных способов в зависимости от целевого назначения препарата. Время получения 1 объема культуральной жидкости 3,2-11 ч. При скорости протока 0,09-0,22 ч^-1 получают препараты с активностями пектат-трансэлиминазы 800-1800 ед/г и экзо-ПГ 60-100 ед/г, а при скоростях протока 0,22-0,31 ч^-1 с активностями пектат-трансэлиминазы 300-1800 ед/г, и экзо-ПГ 0-60 ед/г.

На фиг. 1 показано изменение активности ПТЭ при скорости протока 0,05 ч^-1, где 1 активность ПТЭ; 2 полиурониды; 3 биомасса; на фиг. 2 динамика роста культуры и биосинтеза ферментов при периодическом культивирования, где 1 активность ПТЭ; 2 активность экзо-ПГ; 3 биомасса; 4 полиурониды; на фиг. 3 влияние скорости протока на рост культуры и биосинтез ферментов при непрерывном культивировании, где 1 активность ПТЭ; 2 активность экзо-ПГ; 3 полиурониды; 4 биомасса; 5 редуцирующие вещества.

Отличительным признаком данного способа является то, что в качестве штамма-продуцента мацерирующих ферментов берут штамм бактерий Bacillus macerans (ЦМПМ-В-2692) и процесс ведут непрерывно в проточном режиме при скоростях протока 0,09-0,31 ч^-1; гидролиз свекловичного жома осуществляют при соотношении свекловичного жома, гидролизирующего агента и водопроводной воды, как 5-8: 0,2-0,5:200-300, а в питательную среду дополнительно вводят дрожжевой экстракт в качестве источника ростовых веществ и витаминов при следующем соотношении входящих в нее ингредиентов, г/л: фильтрат щелочного гидролизата свекловичного жома 100-300; дрожжевой экстракт 0,9-1,1; мочевина 4-6; калий сернокислый 0,9-1,1; вода водопроводная до 1 л, причем с целью получения препаратов, предназначенных для использования при получении осветленных соков из овощей и фруктов, устанавливают скорость протока 0,09-0,22 ч^-1, а с целью получения препаратов, предназначенных для использования при получении гомогенизированных соков из овощей и фруктов, устанавливают скорость протока 0,22-0,31 ч^-1. При скорости протока ниже 0,09 ч^-1 в условиях стационарного состояния культуры количество биомассы в течение времени 10 генераций и более остается постоянным. Однако активность ПТЭ за этот промежуток времени значительно снижается (фиг. 1). Это происходит, по-видимому, потому, что в культуральной жидкости и в клетках культур накапливаются метаболиты ингибиторы активности ПТЭ. Это же происходит в условиях периодического культивирования в конце культивирования активность ПТЭ и экзо-ПГ резко снижается (фиг. 2).

Проточное непрерывное культивирование предотвращает накопление нежелательных метаболитов в культуральной жидкости. Однако при скорости протока выше 0,31 ч^-1 (т.е. скорости, близкой к максимальной скорости роста продуцента) происходят вымывание культуры из ферментера и значительное снижение активности ПТЭ и экзо-ПГ (фиг. 3).

В условиях периодического культивирования максимальные активности ПТЭ и экзо-ПГ не совпадают по времени (фиг. 2), что обусловливает только одно определенное соотношение ферментов в культуральной жидкости после ферментации. В условиях непрерывного культивирования, изменяя скорость протока, можно менять целенаправленно соотношение активностей ферментов в культуральной жидкости. Это объясняется разной скоростью синтеза этих ферментов и разной зависимостью скорости синтеза фермента от скорости роста продуцента (в условиях стационарного состояния скорость продуцента равна скорости протока).

П р и м е р 1. Культивирование B. macerans проводят в ферментере емкостью 5 л при объеме питательной среды 1,5 л, имеющей состав, г/л: калий сернокислый 1,0; мочевина 5,0; дрожжевой экстракт 1,0; фильтрат гидролизата свекловичного жома 100 мл. Гидролиз свекловичного жома проводят при температуре 112^оС в течение 1,5 ч при соотношении свекловичного жома, соды кальцинированной и водопроводной воды как 8:0,5:300. Стерилизацию питательной среды проводят при 0,1 МПа в течение 1 ч. Засев проводят споровым посевным материалом. Регулятор рН устанавливают на значение 7,0. После лаг-фазы устанавливают скорость протока 0,15 ч^-1. Аэрацию осуществляют при постоянном потоке воздуха 4,5 л/мин и перемешивании мешалкой со скоростью 250 об/мин. Время полной смены объема культуральной жидкости составляет 6,6 ч. В полученную культуральную жидкость вносят стабилизатор кальций хлористый в количестве 0,05% к объему и лиофильно высушивают. В препарате определяют активность ПТЭ и экзо-ПГ. За единицу активности ПТЭ принимают такое количество фермента, которое за 1 ч при 40^оС вызывает образование ненасыщенных продуктов реакции, имеющих максимум поглощения при 233 нм, увеличивающих оптическую плотность на 0,1. Экзо-полигалактуроназную активность определяют титреметрически по увеличению восстанавливающих альдегидных групп по ГОСТ 20264.3-81.

Мацерирующее действие препаратов исследуют на тканях моркови, яблока, сливы с содержанием пектина 2,5% 1,2% 1% соответственно. Качество мацерации определяли визуально и микроскопированием. Для количественной мацерации используют измельченные в гомогенизаторе ткани указанных овощей и фруктов. Для этого навески по 5 г измельченных растительных тканей помещают в центрифужные стаканчики, вносят по 25 мл ферментного раствора, после перемешливания помещают в термостат на 4^оС на 12 ч.

По окончании времени мацерации в стаканчики добавляют по 25 мл воды, перемешивают и отделяют остатки неразрушенных клеточных стенок центрифугированием при 200 g, промывают дважды спиртом и один раз ацетоном по 50 мл каждый раз. Осадок высушивают до постоянного веса при 105^оС. Уменьшение веса за счет действия фермента измеряют в к контрольным образцам.

Определение содержания пектина проводят кальцийпектитным методом по ГОСТ 20264.3-81.

В результате получают препарат с активностью ПТЭ 1700 ед/г и экзо-ПГ 100 ед/г. Результаты мацерации растительных тканей представлены в табл. 1 (концентрация препарата 0,1-0,2%).

При визуальном исследовании полученных в результате мацерации взвесей наблюдалось значительное расслоение жидкой и твердой фракции. Микроскопирование показало, что полученный препарат мацерировал ткани до отдельных клеток.

П р и м е р 2. Культивирование B.macerans проводят согласно примеру 1 при содержании в питательной среде 200 мл фильтрата гидролизата свекловичного жома на 1 л среды. Гидролиз проводят при 121^оС в течение 0,5 ч при соотношении свекловичного жома, гидроокиси калия и воды как 6,6:0,35:250. После стерилизации и охлаждения питательной среды до 40^оС устанавливают рН на уровень 7,5, который автоматически поддерживают в течение всего процесса. В начале экспоненциальной фазы роста устанавливают скорость протока 0,09 ч^-1. Время полной смены объема культуральной жидкости 11 ч.

Получают препарат по известной схеме согласно примеру 1. В препарате определяют активность ПТЭ и экзо-ПГ и используют его для мацерации растительных тканей. Получен препарат с активностями ПТЭ 800 ед/ч и экзо-ПГ 90 ед/г. Результаты мацерации представлены в табл. 2.

При визуальном исследовании полученных мацератов наблюдалось расслоение жидкостей и твердой фракции.

При микроскопировании установлено большое число изолированных клеток.

П р и м е р 3. Культивирование продуцента проводят на питательной среде следующего состава, г/л: калий сернокислый 0,9; мочевина 4,0; дрожжевой экстракт 0,9; фильтрат гидролизата 300 мл. Гидролиз свекловичного жома проводят при 115^оС в течение 1 ч при соотношении свекловичного жома, соды кальцинированной и водопроводной воды как 8:0,5:300. рН во время культивирования поддерживают на уровне 7,6, скорость протока 0,22 ч^-1. Время полной смены объема культуральной жидкости 4,5 ч. Получен препарат с активностями ПТЭ 1800 ед/г и экзо-ПГ 60 ед/г. Результаты количественной мацерации приведены в табл. 3.

При визуальном исследовании полученных мацератов наблюдалось расслоение твердой и жидкой фракции.

П р и м е р 4. Культивирование продуцента проводят на питательной среде следующего состава, г/л: калий сернокислый 1,1; мочевина 6; дрожжевой экстракт 1,1; фильтрат гидролизата 300 мл. Гидролиз свекловичного жома проводят при температуре 112^оС в течение 0,5 ч при соотношении свекловичного жома, соды кальцинированной и водопроводной воды как 5:0,2:200. Культивирование проводят при скорости протока 0,25 ч^-1. Время полной смены 1 объема культуральной жидкости 4 ч. Получен препарат с активностью ПТЭ 730 ед/г и отсутствием экзо-ПГ. Результаты количественной мацерации приведены в табл. 4.

При визуальном исследовании получаемых мацератов расслоения не наблюдалось. При микроскопировании обнаружено, что выход изолированных клеток был значительно ниже, но наблюдались группы клеток.

П р и м е р 5. Культивирование продуцента проводят на питательной среде следующего состава, г/л: калий сернокислый 0,8; мочевина 3; дрожжевой экстракт 0,8; фильтрат гидролизата 90 мл. Гидролиз свекловичного жома проводят при температуре 112^оС в течение 0,5 ч при соотношении свекловичного жома, калия гидроокиси и водопроводной воды как 4:0,1:100. Культивирование проводят при скорости протока 0,31 ч^-1. Время полной смены 1 объема культуральной жидкости 3,2 ч. Препарат, полученный в данных условиях, содержит ПТЭ 300 ед/г и не содержит экзо-ПГ. Результаты количественной мацерации приведены в табл. 5.

Расслоения жидкой и твердой фракции после мацерации не наблюдалось. При микроскопировании наблюдали большой процент групп клеток и значительно меньше изолированных клеток.

П р и м е р 6. Состав среды, условия культивирования и условия гидролиза жома те же, что в примере N 1. Скорость протока 0,33 ч^-1.

Препарат, полученный при данной скорости протока, содержит ПТЭ 20 ед/г и не содержит экзо-ПГ.

Результаты мацерации приведены в табл. 6.

Мацерации не наблюдалось.

П р и м е р 7. Состав питательной среды тот же, что в примере 1. Гидролиз свекловичного жома проводят при температуре 112^оС в течение 1 ч. Культивирование проводят при скорости протока 0,06 ч^-1.

Полученный препарат содержит ПТЭ 26 ед/г и экзо-ПГ 6 ед/г.

Результаты мацерации приведены в табл. 7.

Мацерации не наблюдалось.

Таким образом, препараты, полученные на основе непрерывного культивирования продуцента при различных скоростях протока, характеризуются различным ферментным комплексом и могут быть использованы для различных целей. Так, например, особым требованием к препаратам, предназначенным для производства гомогенизированных плодово-ягодных соков и напитков, получаемых на их основе, является недопустимость содержания в них экзо- и эндо-полигалактуроназ (Микеладзе Г.Г. Производство плодово-ягодных соков с применением ферментных препаратов. М. 1968, 51). При получении беспектиновых соков ведущая роль принадлежит экзо-полигалактуроназе (Гребешкова Р.Н. Использование микробных препаратов в СССР. Обзор. М. ОНТИТЭИмикробиология, 1982, с. 43). Препараты с высокой активностью пектат-трансэлиминазы показали высокую эффективность при профилактике и лечении ацидоза рубца крупного рогатого скота (авт. св. N 1257894, 1986). Препараты с преобладанием активности ПТЭ и отсутствием целлюлаз применяются при промышленной мочке льна и конопли (авт. св. N 923244, 1981; N 1175197, 1985). Кроме того, применение непрерывного способа культивирования позволяет исключить некоторые репрессирующие биосинтез ферментов механизмы, такие как катаболитная репрессия по типу отрицательной обратной; использование в составе питательной среды продуктов щелочной деградации пиктиновых веществ свекловичного жома индукторов синтеза ПТЭ и экзо-ПГ, входящих в комплекс препаратов мацерирующего действия, а также изменение скоростей протока позволяет проводить направленное культивирование продуцента, усиливать или уменьшать синтез ферментов мацерирующего комплекса и менять их соотношение в культуральной жидкости.

Использование предлагаемого способа получения бактериальных препаратов мацерирующего действия имеет по сравнению с прототипом следующие преимущества:

расширение технологических возможностей способа за счет получения препаратов различного целевого назначения;

достигается снижение расходов свекловичного жома и гидролизующего агента не менее чем в 2 раза, тем самым удешевление среды культивирования;

исключение непроизводительных затрат времени на загрузку, разгрузку, стерилизацию ферментера, лаг-фазу, имеющих место в каждом цикле периодической ферментации;

данный способ позволяет вести регулируемый процесс ферментации, исключающий накопление продуктов метаболизма в культуральной жидкости, отрицательно влияющих на биосинтез ферментов, а также на последующие этапы выделения ферментных препаратов.

Способ прошел испытания на опытной биотехнологической установке ИНМИ АН СССР.