азидонафталин-1-сульфонилгидразины в качестве полупродуктов для получения трилитиевых солей (1`r, 5`r) -3`-аза-1` -(2- амино -1,6-дигидро-6-оксопуринил-9) -3`-дезокси-3`- (азидонафталин-1-сульфамидо) -гексопиранозил -6`- трифосфатов - специфических фотоактивируемых необратимых ингибиторов рнк-полимеразы

Формула изобретения

Азидонафталин-1-сульфонилгидразины общей формулы



где R₁ N₃; R₂ H

или R₁ H и R₂ N₃,

в качестве полупродуктов для получения трилитиевых солей (1"R, 5"R)-3"- аза- 1"-(2-амино- 1,6- дигидро-6- оксопуринил-9)-3"- дезокси-3"- (азидонафталин-1- сульфамидо)-гексопиранозил- 6"-трифосфатов специфических фотоактивируемых необратимых ингибиторов РНК-полимеразы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым химическим соединениям азидонафталин-1-сульфонилгидразинам общей формулы I

где R₁ N₃ и R₂ H (I) или R₁ H и R₂ N₃ (II), как полупродуктам для получения трилитиевых солей (1"R,5"R)-3"-аза-1"-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3"-дезокси-3"-(ази до- нафталин-1-сульфамидо)гексопиранозил-6"- трифосфатов общей формулы Il где R₁ N₃ и R₂ H (III) или R₁ H и R₂ N₃ (IV), как специфических фотоактивируемых необратимых ингибиторов РНК-полимеразы.

Соединения III и IV могут быть использованы в биохимии, биофизике и молекулярной биологии для специфического необратимого ингибирования РНК-полимеразы и изучения строения и механизма действия данного фермента.

Известны различные фотоактивируемые азидопроизводные аренсульфокислот (напр. 4-азидонафталин-1-сульфокислота, 2-азидонафталин-1,5-дисульфокислота), применяемые в области физико-химической биологии [1]

Однако данные соединения не были использованы для синтеза специфических фотоактивируемых ингибиторов РНК-полимеразы.

Наиболее близким к описываемым является известное соединение 2-гидроксибензоилгидразин, который применялся как полупродукт для получения трилитиевой соли (1"R,5"R)-3"-аза-1"-(2-амино-1,6- дигидро-6-оксопуринил-9)-3"-дезокси-3"-(2-гидрокси- бензамидо) гексопиранозил-6"-трифосфата, оказывающей специфическое ингибирующее действие на РНК-полимеразу и обладающей флуоресцентными свойствами [2]

Однако указанный известный полупродукт не позволяет получать ингибитор, оказывающий специфическое необратимое действие на РНК-полимеразу. Обратимый характер ингибирующего действия указанного известного производного гуанозин-5"-трифосфата исключает возможность селективного введения в активный центр фермента флуоресцентной метки, образующей ковалентную связь с белком, с последующим отделением от избытка несвязанного модификатора, что существенно ограничивает область его применения.

Цель изобретения создание новых соединений в ряду гидразидов ароматических кислот, которые позволяют получать новые специфические необратимые ингибиторы РНК-полимеразы на основе производных гуанозин-5"-трифосфата.

Цель достигается азидонафталин-1-сульфонилгидразинами указанной общей формулы (1) как полупродуктами для получения трилитиевых солей (1"R,5"R)-3"-аза-1"-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3"-де- зокси- 3"-(азидонафталин-1-сульфамидо)гек- сопиранозил-6"- трифосфатов специфических фотоактивируемых необратимых ингибиторов РНК-полимеразы.

Соединения I и II получают способом, основанным на известной реакции аренсульфонилхлоридов с избытком гидразина в среде инертного органического растворителя при охлаждении реакционной смеси.

Исходные 4- и 5-азидонафталин-1-сульфонилхлориды получают способом, основанным на следующих известных реакциях:

замещения диазогруппы азидной у диазониевых производных соответствующих аминонафталин-1-сульфокислот при взаимодействии с азидом натрия;

хлордегидроксилирования промежуточных азидонафталин-1-сульфокислот пятихлористым фосфором.

Соединения общей формулы (II) получают способом, основанным на известной реакции циклизации продуктов периодатного окисления рибонуклеотидов с гидразидами аренсульфокислот в водноорганической среде при рН 4,5-5 [2]

П р и м е р 1. 4-Азидонафталин-1-сульфонилгидразин (I).

Раствор 0,4 г (1,5 ммоль) 4-азидонафталин-1-сульфонилхлорида в 10 мл безводного диоксана при красном свете прибавляют по каплям к интенсивно перемешиваемому раствору 0,4 г (0,4 мл, 8 ммоль) гидразин-гидрата в 10 мл безводного диоксана при охлаждении реакционной смеси на водяной бане. После этого реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение получаса, отделяют органическую фазу, упаривают ее при пониженном давлении и температуре не выше 30^оС до объема 1 мл и добавляют 5 мл охлажденного этанола. Выпавший осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси диоксан-этанол. Получают 0,33 г целевого продукта (выход 82%).

Физико-химические свойства полученного соединения 1 представлены в табл. 1.

П р и м е р 2. 5-Азидонафталин-1-сульфонилгидразин (II).

В условиях примера 1, заменив 4-азидонафталин-1-сульфонилхлорид на соответствующее количество 5"-азидонафталин-1-сульфонилхлорида, получают 0,31 г целевого продукта (выход 77%).

Физико-химические свойства полученного соединения II представлены в табл.1.

П р и м е р 3. Трилитиевая соль (1"R,5"R)-3"-аза-1"-(2-амино-1,6- дигидро-6-оксопуринил-9)-3"-дезокси-3"-(4-азидонафталин-1- сульфамидо)гексопиранозил-6"-трифосфата (III).

К раствору 64 мг (0,1 ммоль) натриевой соли оксо-гуанозин-5"- трифосфата, очищенной от примеси иодата натрия, в 5 мл 1 М литийацетатного буфера (рН 5,0) при перемешивании и красном свете добавляют раствор 34 мг (0,13 ммоль) 4-азидонафталин-1- сульфонилгидразина в 7 мл диоксана. Полученный раствор перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, защищая от света, затем упаривают при пониженном давлении до объема 0,5 мл и обрабатывают 5 мл охлажденной смеси безводный этанол безводный диэтиловый эфир (3: 1, об. ). Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают безводным диоксаном, затем безводным диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме в присутствии фосфорного ангидрида. Получают 50 мг целевого продукта (выход 63,5% ).

Физико-химические свойства полученного соединения представлены в табл.2.

П р и м е р 4. Трилитиевая соль (1"R,5"R)-3"-аза-1"-(2-амино-1,6- дигидро-6-оксопуринил-9)-3"-дезокси-3"-(5-азидонафталин-1- сульфамидо)гексопиранозил-6"-трифосфата (IV).

В условиях, описанных в примере 1, используя 34 мг (0,13 ммоль) 5-азидонафталин-1-сульфонилгидразина, получают 46 мг целевого продукта (выход 58% ).

Физико-химические свойства полученного соединения представлены в табл.2.

Изучение ингибирования РНК-полимеразы соединениями III и IV, полученными на основе описываемых 4- и 5-азидонафталин-1- сульфонилгидразинов, проводили следующим образом.

ДНК-зависимую РНК-полимеразу фага Т7 выделяли из штамма-продуцента E.coli. Активность фермента определяли по образованию (³²Р)-РНК из (³²Р)-нуклеозидтрифосфатов.

Инкубационная смесь для определения активности содержит 50 мМ Трис-HCl, рН 7,8; 10 мМ MgCl₂; 5 мМ LiCl; 10 мМ -меркаптоэтанол, раствор плазмиды pGEM-2 ("Promega Biochem", США) 20-40 мкг/мл; аденозин-5"-трифосфат (АТФ), уридин-5"-трифосфат (УТФ), цитидин-5"-трифосфат (ЦТФ) и гуанозин-5"-трифосфат (ГТФ) по 0,4 мкмоль/мл; (-³²Р)-АТФ или (-³²Р)-УТФ (200000 имп./мин на пробу); фермент 0,2-0,5 мкг в пробе. При определении ингибирующего действия в среду инкубации при красном свете вносят изучаемое соединение для получения раствора требуемой концентрации. Общий объем пробы 25 мкл. Реакцию проводят при 37^оС в течение 20 мин. Определение количества образовавшейся РНК (кислотонерастворимого материала) проводят известным способом.

Значение I₅₀ определяют из графика зависимости активности фермента от концентрации ингибитора.

Используемый препарат ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 имеет активность 130000-160000 ед. и характеризуется следующими значениями К_м для нуклеозид-5"-трифосфатов: К_{м ГТФ} 0,16 мМ; К_{м АТФ} 0,04 мМ; К_{м ЦТФ} 0,08 мМ; К_{м УТФ} 0,06 мМ. Инициирующим реакцию нуклеозидтрифосфатом является ГТФ.

В указанных условиях (при красном свете) значение I₅₀ для соединений III и IV, а также для их наиболее близкого известного структурного аналога трилитиевой соли (1"R,5"R)-3"-аза-1"-(2- амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3"-дезокси-3"-(2- гидроксибензамидо)гексопиранозил-6"-трифосфата, составило 0,35, 0,18 и 0,9 мМ, соответственно. Ингибирование носило обратимый характер.

Под действием света ( = 32010 нм) происходит необратимое связывание ингибиторов III и IV с ферментом в результате генерации высокореакционноспособного нитренового радикала. Свободнорадикальный механизм реакции делает возможным ковалентное взаимодействие ингибиторов практически с любыми аминокислотными остатками в связывающем участке белка.

Эффект ингибирования РНК-полимеразы соединениями III и IV в условиях фотолиза увеличивается с течением времени и не уменьшается после их удаления из среды преинкубации (гель-фильтрация), что указывает на необратимое связывание ингибиторов с ферментом. Препарат фермента, модифицированного соединениями III и IV, после гель-фильтрации обладал выраженными флуоресцентными свойствами, ( _{max возб.} 350 и 360 нм, _{max флуор}. 425 и 450 нм, соотв. ), что также свидетельствует о необратимом связывании ингибиторов III и IV с РНК-полимеразой.

При совместной преинкубации РНК-полимеразы с соединениями III и IV и 5 мМ ГТФ (субстрат РНК-полимеразы) наблюдается защитный эффект от действия ингибиторов, что указывает на их специфическое взаимодействие с активным центром фермента.

Ингибирование РНК-полимеразы соединениями III и IV (в условиях фотолиза) охарактеризовано данными, приведенные в табл.3.

Как вытекает из сравнения указанных данных, соединения III и IV в качестве зондов оказывают значительно более выраженное ингибирующее действие на РНК-полимеразу по сравнению с указанным известным соединением. Кроме того, данные соединения расширяют арсенал специфических необратимых ингибиторов фермента, что позволяет более эффективно проводить его изучение с помощью спектрофлуориметрии. Таким образом, описываемые 4- и 5-азидонафталин-1-сульфонилгидразины позволяют получить новые фотоактивируемые модификаторы III и IV для локализации ГТФ-связывающих центров в белках.