трилитиевые соли (1`r,5`r)-3`-аза-1`- (2-амино-1,6-дигидро - 6-оксопуринил-9) -3`-дезокси-3`- (азидонафталин-1- сульфамидо) гексопиранозил-6`-трифосфатов в качестве специфических фотоактивируемых необратимых ингибиторов рнк- полимеразы

Формула изобретения

1. Трилитиевые соли (1" R, 5" R)-3"-аза-1"-(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-6)-3" дезокси-3"- (азидонафталин-1-сульфамидо)- гексопиранозил-6"-трифосфатов общей формулы



где R₁ N₃; R₂ H;

или R₁ H;

R₂ N₃,

в качестве специфических фотоактивируемых необратимых ингибиторов РНК-полимеразы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым химическим соединениям трилитиевым солям (1 R,5 R)-3 -аза-1 -(2-амино-1,6-дигидро-6- оксо- пуринил-9)-аза-3 дезокси-3 -(азидонафталин-1-суфамидо)гексопиранозил-6 -трифос- фатов общей формулы

HO где R₁ N₃ и R₂ Н (I) или R₁ Н и R₂ N₃ (II), как специфическим фотоактивируемым необратимым ингибиторам РНК-полимеразы.

Указанные соединения могут быть использованы в биохимии, биофизике и молекулярной биологии для изучения строения и механизма действия РНК-полимеразы.

Наиболее близким к описываемым является известное соединение (1 R,5 R) -3 -аза-1 -(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил -9)-3 -дезокси-3 -(2-гидроксибензамидо)гек- сопиранозил-6 -трифосфат, оказывающий специфическое ингибирующее действие на РНК-полимеразу и обладающий флуоресцентными свойствами (1).

Однако данный ингибитор обладает следующими недостатками:

недостаточно высокой эффективностью ингибирующего действия;

отсутствием реакционноспособной группировки в составе молекулы, что исключает возможность селективного введения в активный центр фермента флуоресцентной метки, образующей ковалентную связь с белком, с последующим отделением от избытка несвязанного модификатора, что существенно ограничивает область его применения.

Цель изобретения создание новых соединений в ряду производных 5 -гуаниловых нуклеотидов, оказывающих более выраженное ингибирующее действие на РНК-полимеразу и позволяющих более эффективно проводить изучение данного фермента с помощью спектрофлуориметрии.

Цель достигается трилитиевыми солями (1 R,5 R)3 -аза-1 -(2-амино-1,6-дигидро-6-ок- сопуринил-9)-3 дезокси-3 -(азидонафталин-1-сульфамидо)гексопиранозил-6 -три- фосфатов вышеуказанной общей формулы как специфическими фотоактивируемыми необратимыми ингибиторами РНК-полимеразы.

Соединения I и II получают способом, основанным на известной реакции циклизации продуктов периодатного окисления рибонуклеотидов с гидразидами аренсульфокислот в водноорганической среде при рН 4,5-5 [1]

Исходные 4- и 5-азидонафталин-1-сульфонилгидразины получают способом, основанным на следующих известных реакциях:

замещения диазогруппы азидной у диазониевых производных соответствующих аминонафталин-1-сульфокислот при взаимодействии с азидом натрия [2]

хлордегидроксилирования промежуточных азидонафталин-1-сульфокислот пятихлористым фосфором [2]

гидразинолиза аренсульфонилхлоридов избытков гидразина [3]

П р и м е р 1. Трилитиевая соль (1 R,5 R)-3 -аза-1 -(2-амино-1,6-дигидро-6-оксо-пури- нил-9)-3 дезокси-3 -(4-азидонафталин-1-сульфамидо)гексопиранозил-6 -трифосфата (I).

К раствору 64 мг (0,1 ммоль) натриевой соли оксо-гуанозин-5 -трифосфата, очищенной от примеси иодата натрия, в 5 мл 1 М литий-ацетатного буфера (рН 5,0) при перемешивании и красном свете добавляют раствор 34 мг (0,13 ммоль) 4-азидонафталин-1-сульфонилгидразина в 7 мл диоксана. Полученный раствор перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, защищая от света, затем упаривают при пониженном давлении до объема 0,5 мл и обрабатывают 5 мл охлажденной смеси безводный этанол безводный диэтиловый эфир (3:1, об.). Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают безводным диоксаном, затем безводным диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме в присутствии фосфорного ангидрида. По- лучают 50 мг целевого продукта (выход 63,5%).

Физико-химические свойства полученного соединения представлены в табл.1.

П р и м е р 2. Трилитиевая соль (1 R,5 R)-3 -аза-1 -(2-амино-1,6-дигидро-6-оксо-пури- нил-9)-3 -дезокси-3 -(5-азидонафталин-1-су- льфамидо)гексопиранозил-6 -трифосфата (II).

В условиях, описанных в примере 1, используя 34 мг (0,13 ммоль) 5-азидонафталин-1-сульфонилгидразина, получают 46 мг целевого продукта (выход 58% ).

Физико-химические свойства полученного соединения представлены в табл.1.

Изучение ингибирования РНК-полимеразы описываемыми соединениями проводили следующим образом.

ДНК-зависимую РНК-полимеразу фага Т7 выделяли из штамма-продуцента Е.coli. Активность фермента определяли по образованию /³²Р/-РНК из /³²Р/-нуклеозидтрифосфатов.

Инкубационная смесь для определения активности содержит 50 мМ Трис-НСl, рН 7,8; 10 мМ МgСl₂; 5 мМ LiCl; 10 мМ -меркаптоэтанол, раствор плазмиды рGЕМ-2 ("Рromega Biochem.", США) 20-40 мкг/мл; аденозин-5 -трифосфат (АТФ), уридин-5 -трифосфат (УТФ), цитидин-5 -трифосфат (ЦТФ) и гуанозин-5 -трифосфат (ГТФ) по 0,4 мкмоль/мл; / -³²P/-АТФ или / -³²Р/-УТФ (200000 имп./мин на пробу); фермент 0,2-0,5 мкг в пробе. При определении ингибирующего действия в среду инкубации при красном свете вносят изучаемое соединение для получения раствора требуемой концентрации. Общий объем пробы 25 мкл. Реакцию проводят при 37^оС в течение 20 мин. Определение количества образовавшейся РНК (кислотонерастворимого материала) проводят известным способом.

Значение I₅₀ определяют из графика зависимости активности фермента от концентрации ингибитора.

Используемый препарат ДНК-зависимой РНК-полимеразы фага Т7 имеет активность 130000-160000 ед. и характеризуется следующими значениями К_м для нуклеозид-5 -трифосфатов: К_{м ГТФ} 0,16 мМ; К_{м АТФ} 0,04 мМ; К_{м ЦТФ} 0,08 мМ; К_{м УТФ} 0,06 мМ. Инициирующим реакцию нуклеозидтрифосфатом является ГТФ.

В указанных условиях (при красном свете) значение I₅₀ для соединений I и II составляло 0,35 и 0,18 мМ соответственно. Ингибирование носило обратимый характер.

Под действием света (32010 нм) происходит необратимое связывание ингибиторов с ферментом в результате генерации высокореакционноспособного нитренового радикала. Свободнорадикальный механизм реакции делает возможным ковалентное взаимодействие ингибиторов практически с любыми аминокислотными остатками в связывающем участке белка.

Эффект ингибирования РНК-полимеразы описываемыми соединениями в условиях фотолиза увеличивается с течением времени и не уменьшается после их удаления из среды преинкубации (гель-фильтрация), что указывает на необратимое связывание ингибиторов с ферментом. Препарат фермента, модифицированного соединениями I и II, после гель-фильтрации обладал выраженными флуоресцентными свойствами ( _{mах возб.}=350 и 360 нм, _{mах флуор}.425 и 450 нм, соотв.), что также свидетельствует о необратимом связывании ингибиторов I и II с РНК-полимеразой.

При совместной преинкубации РНК-полимеразы с соединениями I и II и 5 мМ (субстрат РНК-полимеразы) наблюдается защитный эффект от действия ингибиторов, что указывает на их специфическое взаимодействие с активным центром фермента.

Ингибирование РНК-полимеразы соединениями I и II (в условиях фотолиза), а также наиболее близким структурным аналогом (1 R, 5 R)-3 -аза-1 -(2-амино-1,6-дигидро-6-оксопуринил-9)-3 -дезокси-3 -(2-гид- роксибензамидо)гексопиранозил-6 -трифо- сфатом (III), охарактеризовано данными, приведенными в табл. 2. Ингибирующее действие соединений I,II и III на РНК-по- лимеразу.

При изучении изменения интенсивности флуоресценции ковалентных фермент-ингибиторных комплексов в результате осуществленного щелочного гидролиза (рН 12, 0^оС, 48 ч) морфолинового фрагмента остатков ингибиторов I и II было обнаружено увеличение интенсивности флуоресценции в 1,5 раза.

Как вытекает из сравнения указанных данных, описываемые соединения I и II оказывают значительно более выраженное необратимое ингибирующее действие на РНК-полимеразу по сравнению с известным соединением III и расширяют арсенал специфических необратимых ингибиторов фермента, позволяющих проводить его изучение с помощью спектрофлуориметрии. Описываемые соединения I и II могут быть использованы для локализации ГТФ-связывающих центров в белках.