способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов
Классы МПК: | G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого G01N33/533 с флуоресцентными метками |
Автор(ы): | Осипов А.П., Пантелеев О.А. |
Патентообладатель(и): | Институт иммунобиотехнологии |
Приоритеты: |
подача заявки:
1992-03-23 публикация патента:
20.07.1995 |
Использование: иммунобиотехнология, определение биологически активных веществ с использованием в качестве маркера флуоресцентных меток. Сущность изобретения: разработка флуоресцентного иммуноанализа, предусматривающая иммобилизацию антител и обработку их меченым антигеном в присутствии определяемого антигена, причем иммобилизацию антител и обработку ведут в проточном режиме с использованием флуориметрической кюветы с длиной оптического пути 0,005 0,1 мм. Коэффициент вариации результатов анализа составляет 10 15%
Формула изобретения
СПОСОБ КОНКУРЕНТНОГО ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ, предусматривающий иммобилизацию специфических антител на твердой фазе, обработку их известным количеством флуоресцентно-меченого определяемого антигена и регистрацию интенсивности флуоресценции на твердой фазе, отличающийся тем, что иммобилизацию антител и обработку их антигеном осуществляют в проточной системе путем пропускания антител и антигена через флуориметрическую кювету с длиной оптического пути 0,005 0,1 мм, при этом обработку иммобилизованных антител и регистрацию интенсивности флуоресценции на твердой фазе осуществляют одновременно.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для определения биологически активных веществ с использованием в качестве маркера флуоресцентных меток. Сущность конкурентного метода заключается в следующем. Используют меченый антиген, идентичный тому, который определяют в исследуемом препарате, и антисыворотку против данного антигена. В раствор, содержащий известное количество меченого антигена и недостаток по отношению к этому количеству специфических антител, добавляют раствор определяемого антигена. В результате конкуренции за связанные с находящимися в недостатке антителами доля меченых антигенов в составе иммунных комплексов понижается при увеличении содержания в растворе определяемого антигена. После установления в системе равновесия образовавшиеся иммунные комплекcы отделяют от cвободных компонентов одним из стандартных методов и измеряют флуоресценцию раствора или осадка. Количество исследуемого антигена определяют по калибровочной кривой. Наиболее близким к предлагаемому методу является конкурентный твердофазный способ проведения иммунофлуоресцентного анализа (ИФА), согласно которому антитела против определяемого антигена адсорбционно иммобилизуют на поверхности водонерастворимого полимерного носителя (например, из полистирола, поливинилхлорида и т.д.) путем инкубации носителя в течение 2 ч в растворе антител с последующей отмывкой несвязавшихся антител. Полученный носитель обрабатывают раствором, содержащим некоторое избыточное по отношению к антителам фиксированное количество определяемого антигена, меченного флуоресцентной меткой, например флуоресцеинизотиоцианатом, и неизвестное количество определяемого антигена, инкубируют в течение 1-24 ч (время установления равновесия в системе, которое зависит от природы антигена, концентрации компонентов, температуры, перемешивания и т.п.). Образующийся иммунный комплекс отделяют от растворимых компонентов реакции и многократно промывают водой для удаления несвязывающихся с носителем меченых и немеченых антигенов. Регистрируют флуоресцентный сигнал меченого соединения непосредственно с твердой поверхностью или предварительно переводя меченый компонент в раствор, десорбируя метку с поверхности носителя и определяя интенсивность флуоресценции раствора. В результате конкуренции между меченым и немеченым антигеном за связывание с активными центрами антител на полимерном носителе увеличение содержания немеченого антигена в образце приводит к уменьшению интенсивности флуоресценции. Основными недостатками метода являются его многостадийность и длительность. Проведение анализа в несколько стадий, включающих разделение иммуносорбента и жидкой фазы, промывку и последующий перевод метки в раствор, приводит к методическому усложнению способа и увеличению продолжительности анализа, снижает его точность из-за вероятности случайных ошибок и возможной десорбции меченого компонента с иммуносорбента, делает чрезвычайно трудной возможность полной автоматизации анализа. Для обеспечения максимальной чувствительности и воспроизводимости анализ следует проводить в равновесном режиме. Для определения времени достижения равновесия в системе, которое зависит прежде всего от природы антигена, необходимо в каждом конкретном случае провести серию дополнительных экспериментов с различными периодами инкубации реагентов, что приводит как к увеличению продолжительности анализа, так и непроизводительному расходу реагентов. Кроме того, так как анализ является гетерогенным, то ввиду наличия диффузионных затруднений при взаимодействии антигена с иммобилизованными на твердом носителе антителами, время установления равновесия в системе составляет обычно несколько часов. Поэтому сам анализ является длительным и занимает несколько часов. Предлагаетcя способ проведения флуоресцентного иммуноанализа, предусматривающий иммобилизацию антител и обработку их меченым антигеном в присутствии определяемого антигена, иммобилизацию и обработку ведут в проточном режиме с использованием проточной флуориметрической кюветы с длиной оптического пути (толщиной) 0,005-0,1 мм. Анализ осуществляют следующим образом. Через проточную флуориметрическую кварцевую кювету с длиной оптического пути 0,005-0,1 мм последовательно пропускают раствор специфических антител против определяемого антигена, буферный раствор и раствор, содержащий меченный флуоресцентной меткой определяемый антиген и свободный антиген, со скоростью не менее 0,3 мл/мин. Измеряют максимальную величину интенсивности флуоресценции, по величине которой по стандартной кривой рассчитывают искомую концентрацию определяемого антигена в растворе. На первой стадии при прокачивании раствора антител через кювету происходит их адсорбционная иммобилизация на внутренних стенках кюветы. В качестве материала стенок кюветы могут быть использованы кварц, полистирол, поливинилтолуол или другие полимерные материалы. При прокачивании через кювету раствора с анализируемым и меченым образцом происходит сорбция меченого антигена на стенках кюветы, сопровождающаяся увеличением сигнала флуоресценции с поверхности кюветы. Так как толщина кюветы относительно мала (0,005-0,1 мм), а в объем проточной кюветы непрерывно вводятся новые порции меченого антигена с постоянной концентрацией, то сигнал, обусловленный меткой в растворе, будет постоянен и относительно мал (интенсивность флуоресценции пропорцио- нальна толщине слоя, через который проходит возбуждающий свет, а ее можно сделать относительно малой). С другой стороны, благодаря взаимодействию меченого антигена с антителами на поверхности стенок кюветы происходит постоянное накопление меченого антигена на стенках кюветы, приводящее к возрастанию интенсивности флуоресценции во времени. При толщине кюветы не больше 0,1 мм фоновый сигнал (соответствующий интенсивности флуоресценции в начальный момент времени и обусловленный меченым антигеном, находящимся в объеме кюветы) будет значительно меньше сигнала, обусловленного меченым антигеном, связанным на поверхности кюветы с антигеном. Выбор интервала толщины кюветы 0,005-0,1 мм обусловлен следующими причинами. При работе кюветы общий сигнал флуоресценции складывается из двух составляющих сигнала флуоресценции от адсорбированного на стенках кюветы меченого препарата и сигнала от меченого препарата, находящегося в растворе, причем последний сигнал тем меньше, чем меньше толщина кюветы. Так, например, в случае анализа белков расчет показывает, что при размерах кюветы 10 мм х 10 мм х 0,01 мм объем кюветы составляет 1 мкл, поэтому при концентрации анализируемого белкового препарата 1-10 мкг/мл в объеме кюветы постоянно находится 1-10 нг вещества, что значительно меньше максимальной удельной адсорбционной емкости поверхности кюветы (которая, например, в случае кварца или полистирола составляет![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039011/8776.gif)
![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039012/729.gif)
![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039012/729.gif)
П р и м е р 3. Определение концентрации тироксина в растворе. На стенках проточной кюветы толщиной 0,01 мм иммобилизуют антитела кролика против тироксина согласно примеру 1. Через кювету пропускают 1 мл ФБС, содержащего меченный флуоресцеином тироксин в концентрации 10-8 М и стандартную концентрацию тироксина. Строят стандартную кривую зависимости наблюдаемой максимальной интенсивности флуоресценции от концентрации тироксина в образце. Для определения содержания тироксина в неизвестном образце сыворотки крови 0,2 мл образца добавляют к 0,8 мл фосфатного буфера, содержащего меченый тироксин в концентрации 10-8 (0,06 М, рН 7,2, 0,18 М NaCl) и 1 мл полученного раствора пропускают через проточную кювету. Измеряют максимальную интенсивность флуоресценции (через интервал времени
![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039011/8776.gif)
![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039011/8776.gif)
П р и м е р 4. Определение концентрации инсулина. На стенках проточной кюветы толщиной 0,02 мм иммобилизуют антитела кролика против инсулина согласно примеру 1. Через кювету пропускают 1 мл раствора, содержащего меченный флуоресцеином инсулин в концентрации 2
![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039012/729.gif)
![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039012/729.gif)
![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039011/8776.gif)
![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039011/8776.gif)
П р и м е р 5. Определение IgG человека с использованием меченного родамином В антигена. На стенках проточной флуориметрической кюветы толщиной 0,01 мм иммобилизуют согласно примеру 1 антитела кролика против IgG человека. Через кювету пропускают раствор 1 мл ФБС, содержащего меченный родамином В IgG человека (концентрация 3
![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039012/729.gif)
П р и м е р 6. Определение IgG с использованием дансильной метки. На стенках проточной флуориметрической кюветы толщиной 0,01 мм иммобилизуют согласно примеру 1 антитела кролика против IgG человека. Через кювету пропускают раствор 1 мл ФБС, содержащего меченный диметиламинонафталин-5-сульфо- нилхлоридом (ДАНС) IgG человека (концентрация 5
![способ конкурентного иммунофлуоресцентного определения антигенов, патент № 2039986](/images/patents/434/2039012/729.gif)
Таким образом, предлагаемый метод может быть использован для количественного определения как низкомолекулярных соединений (гаптенов), так и высокомолекулярных, в том числе белков, гормонов, стероидов и т.д. Предложенный метод приводит к существенному упрощению иммунофлуоресцентного анализа, сокращению числа его стадий, времени проведения. Метод может быть использован и в научном эксперименте для наблюдения за ходом протекания реакции антиген-антитело без какого-либо возмущающего воздействия на компоненты иммунохимической системы с целью изучения кинетических и термодинамических параметров, характеризующих лиганд-рецеп- торные взаимодействия. На основе предложенного метода могут быть созданы коммерческие наборы реагентов, позволяющие осуществлять иммунофлуоресцентный анализ в автоматическом режиме, что приведет к значительному удешевлению стоимости проведения единичного анализа.
Класс G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого
Класс G01N33/533 с флуоресцентными метками