набор для выявления хламидийной инфекции

Формула изобретения

1. НАБОР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ, содержащий антитела к поверхностным антигенам Chlamydia trachomatis, отличающийся тем, что дополнительно содержит козлиные антитела к иммуноглобулинам кур, меченные флуоресцеинизотиоцианатом, а в качестве антител содержит поликлональные антитела с титром в ИФА 1:25000, полученные из желтков яиц кур, иммунизированных штаммом Chlamydia trachomatis12 и очищенных путем экстракции полиэтиленгликолем или декстрансульфатом с последующей хроматографией на фенилсефарозе.

2. Набор по п.1, отличающийся тем, что дополнительно содержит стекла с деколированными лунками.

3. Набор по пп.1 и 2, отличающийся тем, что дополнительно содержит металлические зонды для приготовления мазков.

Описание изобретения к патенту

По частоте распространения из болезней, передающихся половым путем, наиболее серьезную проблему представляют урогенитальные хламидиозы, вызываемые Chlamydia trachomatis. Это самая распространенная венерическая болезнь нашего времени. Хламидиоз является основной причиной многочисленных заболеваний и дисфункций репродуктивной системы: уретритов, сальпингитов, простатитов, цервицитов, эпидидимитов и др. У женщин с заболеваниями урогенитального тракта хламидии выявляют в 50-60% случав, у мужчин с первичным диагнозом негонококкового уретрита от 40 до 54% Хламидии выявляются также при смешанных инфекциях у 20-40% больных трихомониазом, до 40% у больных гонореей. По последним данным, именно хламидиоз и связанные с ним патологические изменения мочеполовых путей во много раз повышают вероятность инфицирования вирусом иммунодефицита при половом контакте.

Существующие эффективные лекарственные препараты в большинстве случаев при правильно поставленном диагнозе в короткие сроки приводят к полному излечению хламидиоза. В этих условиях на первый план выходит проблема диагностики. Не только "венерический" анамнез, но и любые недиагносцированные персистирующие лихорадочные состояния являются обоснованным поводом для анализа на присутствие хламидийной инфекции. Обнаружение хламидийной инфекции гарантия успешного лечения.

Традиционным методом обнаружения C. trachomatis является выделение возбудителя путем его пассирования на перевиваемой культуре клеток млекопитающих. Метод достаточно трудоемок, занимает от 4-х до 7 суток, дорог и требует привлечения высококвалифицированного персонала. К тому же образцы, предназначенные для исследования, хранятся при 4^оС не долее 24 ч. Поэтому метод не получил широкого распространения в клинической практике.

Метод неспецифической окраски по Романовскому-Гимза, применяющийся до сих пор в отечественных лабораториях для диагностики хламидиозов, не выдерживает критики в связи с низким числом выявляемых случаев инфекции.

Метод ДНК-гибридизации, отличающийся высокой специфичностью и чувствительностью, не пользуется популярностью в клинике из-за исключительной дороговизны и сложности.

В последние годы в крупных клинических лабораториях широкое распространение получил метод иммуноферментного анализа (ИФА). К основным преимуществам ИФА следует отнести высокую производительность и возможность автоматизации проведения анализа. ИФА выгодно использовать при необходимости исследования больших партий образцов (свыше 50 в сутки). Основным недостатком метода является отсутствие контроля за специфичностью анализа и качеством образца. Доказано наличие перекрестной реакции между поликлональными антихламидийными антителами, используемыми в ИФА, и липополисахаридами видов Acinetobacter, E. coli, Klebsiellа. При этом неизбежно появление ложноположительных результатов, особенно в цервикальных пробах. Чувствительность ИФА-диагностики составляет лишь 60-70%

Известны коммерческие ИФА-диагностикумы для обнаружения хламидий: CHLAMYDIAZYME, Abbot Laboratories (обнаружение Chlamydia trachomatis); IDEIA Chlamydia Test, Novo Biolabs, Inc. (обнаружение C. psittaci).

Для непосредственного обнаружения хламидий в образцах, полученных от пациентов, используют моноклональные или поликлональные антитела к специфическим антигенам C. trachomatis, меченные флуоресцентным красителем. При этом обнаруживаются внеклеточные возбудители (элементарные тельца) и возбудители, локализованные в цитоплазме (ретикулярные тельца).

Главным достоинством метода ИФА, кроме простоты и скорости проведения, является возможность оценить качество клинического материала, представленного для анализа, и оценка ряда цитологических аспектов, например, внутриклеточной локализации возбудителя.

Существуют несколько коммерческих ИФ-диагностических наборов для клинической практики: Syva Microtrak, Chlamydia Direst IF bioMerieux, Pathfinder, Kallestad, Chlamyset Antigen FА. Последний выбран нами в качестве прототипа для первого объекта. Набор Chlamyset Antigen FA состоит из следующих компонентов: флуоресцентного реагента, представляющего собой моноклональные антитела, меченные флуоресцентной меткой, и смешанного со специфическим красителем, растворителя (дистиллированная вода); покрывающей жидкости.

Объектом предлагаемого изобретения является иммунофлуоресцентный набор, не уступающий лучшим западным образцам. При создании набора основное внимание уделялось максимально широкому выбору специфических антигенов C. trachomatis. Были разработаны методы выделения этих антигенов и оптимальные условия иммунизации для получения высокоспецифических поликлональных антител основных компонентов набора.

Главными отличительными чертами рассматриваемого набора являются:

1. Высокая чувствительность системы из-за способности распознавать большой спектр специфических антигенов клеточной стенки C. trachomatis.

2. Стабильность и устойчивость биокомпонентов набора при длительном хранении.

3. Отсутствие ложноположительных результатов в силу ряда особенностей применяемых в наборе специфических иммуноглобулинов из куриного яичного желтка (IgY): низкая антигенная гомология IgY с антителами млекопитающих, отсутствие взаимодействия с белком A Staphylococcus aureus и т.д.

Специфические антитела распознают обе формы клеточного цикла хламидий элементарные и ретикулярные тельца. Обнаруживаются как живые, так и мертвые возбудители.

В случае обнаружения C. trachomatis в клинических образцах с помощью предлагаемого набора не требуется подтверждения результатов другими методами.

В состав диагностического набора входят:

1. антитела куриные к поверхностным антигенам C. trachomatis, лиофилизированные;

2. антитела козлиные к иммуноглобулинам курицы, меченные флуоресцеинизотиоцианатом, лиофилизированные;

(и дополнительно может содержать)

3. стекла предметные с деколированными лунками для приготовления мазков;

4. зонды металлические с тампонами для взятия мазков.

В качестве второго объекта принят способ получения моноклональных антител к Сhlamydia trachomatis (патент РСТ, 86/02355, С 07 К 15/00, 1986). Способ заключается в том, что крыс иммунизируют культурой клеток Chlamydia trachomatis, селезенку иммунизированных крыс используют для получения гибридных клеток. Из культуральной жидкости выделяют антитела к Chlamydia trachomatis путем аффинной хроматографии.

Другим объектом изобретения является способ получения поликлональных куриных антител к поверхностным антигенам C. trachomatis c использованием приемов иммунизации кур и очистки антител путем экстракции декстрансульфатом или ПЭГ 6000 с последующей хроматографией на фенил-сефарозе или другом сорбенте с аналогичной функциональной группой. Способ заключается в том, что кур иммунизируют культурой Chlamydia trachomatis L2, выращенной в желточных мешках куриных эмбрионов. После иммунизации собирают яйца кур. Желтки собранных яиц отделяют, гомогенизируют в физиологическом растворе, осаждают липидную фракцию путем добавления декстрансульфата до конечной концентрации 0,5-1% или полиэтилегликоля молекулярной массы 4-6 тыс. (ПЭГ 4000-6000), центрифугирования и хроматографии полученного супернатанта на фенил-сефарозе или другом сорбенте с аналогичной функциональной группой. При этом:

а) процент разведения желтка при гомогенизации не существенен;

б) концентрация полиэтиленгликоля и декстрансульфата общепринята;

в) методика проведения хроматографии на фенил-сефарозе общепринята.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Пример получения антител.

1. Выбор антигена.

В настоящее время описано 15 сероваров C. trachomatis, каждый из которых может иметь этиологическое значение в урогенитальной патологии. Антигенные компоненты, присущие серовару L2 (Infect. Immun. 1981, v. 31, p. 1161) представлены также и в других сероварах, что делает возможным использование штаммов серовара L2 для иммунизации животных и получения антител с широкой специфичностью в пределах вида C. trachomatis.

2. Получение хламидийного антигена для иммунизации кур.

В качестве антигена использовали культуру C. trachomatis L2 (Институт вирусологии им. Ивановского), пассированную в желточном мешке куриных эмбрионов. Контроль за продукцией хламидий осуществляли с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (моноклональные антитела "Сhlamyset", Orion). Желточные мешки, содержащие большое количество хламидий, гомогенизировали, готовили 40% -ную суспензию в 0,15 М растворе хлористого натрия, забуференном 0,01 М фосфата натрия, рН 7,4 (ФСБ). Суспензию центрифугировали при 900 g, 5^оС 15 мин, удаляли слой липидов и дебрис, после чего вновь центрифугировали в том же режиме. Хламидии осаждали при 20.000 g, 5^оС в течение 45 мин, ресуспендировали в ФСБ с 0,1% азида натрия и выдерживали при 5^оС в течение 72 ч, что обеспечивало полную инактивацию хламидий.

Для удаления азида натрия повторяли центрифугирование при 20.000 g в течение 45 мин. Готовый для иммунизации хламидий антиген в виде 1%-ной суспензии в ФСБ хранили при минус 20^оС.

3. Иммунизация кур хламидийным антигеном.

Для иммунизации использовали 140-дневных кур породы белый леггорн. Предварительно всех отобранных кур проверяли на наличие хламидийной инфекции (C. psittaci и C. trachomatis) с помощью непрямого иммунофлуоресцентного теста ("Chlamydia-Spot IF-Kit", bioMeriеux). Иммунизацию проводили внутримышечно в киль по 2 мл антигена с полным адъювантом Фрейнда (Difco). Иммунизацию трижды повторяли с интервалом 7 сут. Возможно использование другой схемы иммунизации. Титр антител из желточных мешков определяли иммуноферментным методом (см. раздел 4.1)).

4. Очистка куриных антител из желточного мешка

Стадии очистки IgY-антител включали следующие этапы:

1) преципитация лецитина декстрансульфатом 150 тыс. (конечная концентрация 0,5-1%) или полиэтиленгликолем 4-6 тыс. (конечная концентрация 2,5-10%);

2) гидрофобная хроматография IgY-антител на фенил-сефарозе;

3) гель-фильтрация антител на сефакриле S-300 (эта стадия не является обязательной).

Количественное определение IgY на всех стадиях очистки проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) в 96-луночных микроплатах (PVC microplate, activated; Flow Lab. ). Тестируемые фракции разводили до концентрации белка 50-100 мкг/мл в 0,15 М растворе хлористого натрия, забуференном 0,02 М раствором Трис-HСl, рН 7,4 (ТСБ). Эти разведенные фракции вносили по 100 мкл в лунки микроплат и сорбировали при 5^oС в течение 16-18 ч, после чего платы трижды промывали ТСБ. Для блокировки неспецифических участков связывания в лунки вносили по 200 мкл 0,5%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина, приготовленного на ТСБ, платы инкубировали при 37^оС 60 мин, с последующей трехкратной промывкой ТСБ, содержащим 0,05% Твин-20. Затем платы заливали раствором IgG человека в ТСБ в концентрации 25 мкг/мл и инкубировали при 37^оС в течение 2 ч. По окончании инкубации платы трижды промывали ТСБ с твином и заливали конъюгатом антител против IgG человека с пероксидазой хрена (ИЭМ им. Гамалея), приготовленного в рабочем разведении в ТСБ с твином и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. Инкубацию с конъюгатом проводили при 37^оС в течение 2 ч. После трехкратной отмывки ТСБ с твином в лунки вносили по 100 мкл субстрата (АВТS, Sigma, 200 мкг/мл в 0,1 М натрий-цитратном буферном растворе, рН 4,0). Платы помещали на встряхиватель и выдерживали при комнатной температуре 10-15 мин до появления зеленой окраски. Учет результатов проводили путем регистрации оптической плотности на многоканальном фотометре "Мультискан МСС" при длине волны 405 нм.

4.1. Преципитация лецитина

Были апробированы методы преципитации с применением декстрансульфата и полиэтиленгликоля 4000-6000. В первом случае желточные мешки гомогенизировали в четырех объемах ФСБ, к 10 мл эмульсии прибавляли 0,8 мл 10%-ного раствора декстрансульфата 150 тыс. (Loba Chemie) и 2 мл 1 М раствора хлористого кальция. Смесь выдерживали при комнатной температуре 15 мин, центрифугировали при 6000 об./мин 10 мин при 5^оС супернатант диализовали против ФСБ и хранили при 5^оС с добавлением 0,1% азида натрия.

В соответствии с прописью второго метода желточные мешки гомогенизировали с четырьмя объемами ФСБ, к эмульсии прибавляли 10%-ный раствор полиэтиленгликоля 4-6 тыс. (Loba Chemie) до конечной концентрации 3% Смесь помещали на магнитную мешалку и выдерживали при комнатной температуре 1 ч и далее при 5^оС в течение 16-18 ч. Преципитат удаляли центрифугированием при 10.000 об. /мин, 5^оС, в течение 45 мин, к супернатанту добавляли азид натрия до конечной концентрации 0,1% Препарат хранили при 5^оС.

В модельных экспериментах показано, что оба метода позволяют количественно отделять IgY-антитела от лецитина и не влияют на активность антител. В дальнейшей работе, однако, в силу большей экономичности предпочтение было отдано методу ПЭГ-преципитации.

4.2. Хроматография IgY-антител на фенил-сефарозе.

Препарат антител после удаления лецитина наносили на колонку с фенил-сефарозой (Pharmacia LKB), уравновешенную ФСБ.

Хроматографию проводили при 5^оС. Объем колонки подбирали из расчета 1 мл сефарозы на 2 мг белка. Скорость нанесения 25 мл/ч. После нанесения материала колонку промывали ФСБ, а затем 1/10 ФСБ. Эффективность промывки контролировали по оптической плотности элюата при 280 нм. Элюцию антител проводили дистиллированной водой. Собранный белок лиофилизировали.

4.3. Гель-фильтрация IgY-антител на сефакриле S-300.

Полученный на фенил-сефарозе белковый материал растворяли в 1 мл ФСБ и наносили на колонку с сефакрилом S-300 (Pharmacia LKB) размером 2,5 х 90 см, уравновешенную ФСБ. Хроматографию проводили при 5^оС. Скорость потока 15 мл/ч. Белковые пики регистрировали по оптической плотности при 280 нм. Было найдено, что белок, выходящий с колонки в объеме, соответствующем молекулярной массе 150-180 kD, специфически взаимодействует с IgG антителами человека в ИФА и по электрофизическим свойствам совпадает с IgY-антителами.

Приведенная трехстадийная схема очистки куриных антител позволила получить нативный препарат иммуноглобулинов желточного мешка, степень чистоты которого составляла от 90 до 95% Выход IgY составлял около 0,5 мг из одного яйца.

П р и м е р 2. Подтверждение специфичности полученных антител.

Для оценки специфичности полученных куриных антител был использован иммуноферментный анализ, позволяющий количественно охарактеризовать перекрестные реакции антител с различными группами антигенов, а также иммунофлуоресцентная микроскопия модельных препаратов культуры HeLa, зараженной определенными инфекционными агентами.

1. Иммуноферментный анализ специфичности IgY-антител

В качестве антигенов использовали как суспензии микроорганизмов, так и фракционированные компоненты микробных клеток. Применявшиеся в работе штаммы и их характеристики представлены в табл. 1. Свежие культуры смывали с агаровой среды холодным ТСБ, содержащим 0,1% азида натрия. Культуры центрифугировали при 10.000 об./мин 5^оС в течение 30 мин, трижды промывали в холодном ТСБ и ресуспендировали в том же буферном растворе. Бульонные культуры микоплазм и уреаплазм центрифугировали при 12.000 об./мин 5^оС в течение 60 мин, после чего промывали, как описано выше. Препараты клеток S. aureus, содержащих белок А (Стафилококковый реагент, НИИЭМ им. Пастера, Ленинград; Пансорбин, Sigma), суспендировали в дистиллированной воде, центрифугировали, как предыдущие бактериальные культуры, трижды промывали в ТСБ, содержащем 2 мМ ЭДТА, бактериальные культуры, трижды промывали в ТСБ, содержащем 2 мМ ЭДТА, 0,5% дезоксихолата натрия и 0,1% NP-40, после чего дважды промывали в ТСБ, содержащем 1,5 мМ хлористого натрия, и суспендировали в этом же буферном растворе. Оптическую плотность суспензий микрооорганизмов доводили с помощью стеклянного стандарта мутности (ГИСК им. Тарасевича) до концентрации, соответствующей 10 млн. микробных тел в 1 мл.

В качестве фракцинированных антигенных компонентов микробных клеток использовались липополисахариды энтеробактерий и других грамотрицательных микроорганизмов/ а также преператы белков/ входящих в состав наружной мембраны (outer membrain proteins, OMP).

Положительным контролем во всех экспериментах служил хламидийный антиген/ полученный из культуры C. trachomatis L2, пассированный в желточном мешке куриного эмбриона (Ismunit), а также культура C. trachomatis L2, полученная пассированием на мышиных фибробластах L929 и инактивированная в 0/1 -ном растворе азида натрия. Коммерческий антиген использовался в концентрации по белку 10 мкг/мл/ суспензия C. trachomatis L2 в концентрации/ аналогичной для описанных выше бактериальных культур.

Анализ кривых титрования хламидийных IgY в ИФА позволяет сделать следующие выводы:

1) хламидийнае антитела с равной эффективностью взаимодействуют с антигеном L2 производства Ismunit/ так и с убитой культурой C. trachomatis L2, полученной пассированием на мышиных фибробластах; титр антител составляет в среднем 1:25000;

2) IgY-антитела не взаимодействуют с клетками S.aureus, что обусловлено отсутствием белок А-специфического рецептора в молекуле IgY;

3) перекрестные реакции IgY-антител с клетками E.coli, нейсерий (N.gonorrhoeae и B. catarrhalis)/ G.vaginalis, C.albicans, а также с микоплазмами (M.hominis и U.urealyticum) практически отсутствуют;

4) не обнаружено значимых иммунологических перекрестов между IgY-антигенами и LPS-антигеном E. coli и A.calcoaceticus, а также OMP-антигеном N. gonorrhoeae и В. catarrhalis.

2. Изучение специфичности хламидийных IgY-антител в реакции непрямой иммунофлуоресценции.

Для постановки РНИФ с хламидийными IgY-антителами готовили серию препаратов из культуры клеток HeLa, зараженной штаммами N. gonorrhoeae, G. vaginalis, M. hominis и U. uruealyticum. С этой целью клетки HeLa культивировали в среде N 199 с 10%-ной эмбриональной телячьей сывороткой на покровных стеклах в чашках Петри в течение 2 суток до получения субконфлюентного монослоя, после чего к клеткам добавляли свежую культуру одного из перечисленных выше микроорганизмов, суспендированных в среде N 199. Посевная доза каждого из штаммов составляла 10 млн. клеток в 1 мл среды. Культивирование продолжали в течение 2 сут. затем препараты фиксировали 96%-ным этиловым спиртом. В качестве положительного контроля использовали клетки HeLa, зараженные штаммом С. trachomatis L2. Для получения контаминированной культуры трипсинизированную суспензию клеток HeLa (50 тыс. клеток в мл) в свежей среде N 199 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки смешивали с 20%-ной взвесью инфицированных штаммом L2 желточных мешков куриных эмбрионов (на 10 мл клеточной суспензии брали 0,5 мл взвеси желточных мешков), центрифугировали при 3.000 g в течение 45 мин при комнатной температуре, клетки ресуспендировали в исходном объеме свежей среды и помещали в чашки Петри с покровными стеклами. Культивирование проводили при 37^оС в течение 3 сут, после чего препараты фиксировали в 96%-ном этиловом спирте.

Для проведения РНИФ использовали хламидийные IgY, полученные методом ПЭГ-преципитации, с титром 1:25.600 (определен в ИФА). Антитела разводили в ФСБ, содержащем 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, и наносили в объеме 50 мкл на фиксированные препараты культуры HeLa на покровных стеклах. Стекла помещали во влажную камеру и выдерживали при комнатной температуре 15 мин. Затем препараты промывали в проточной водопроводной воде, ополаскивали дистиллированной водой и высушивали на воздухе. Анти-IgY-ФИТЦ-конъюгат с титром 1: 204.800 (определен в ИФА) разводили 1:100 в ФСБ, содержащем 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и 5 мкг/мл бромистого этидия (Serva). Обработку препаратов конъюгатом проводили в тех же условиях, что и первичными антителами. Готовые препараты анализировали с помощью люминесцентного микроскопа Laboval 2a-fl (Carl Zeiss Jena) при увеличении 600 х 1350х. Для контроля контаминации культуры HeLa исследуемыми микроорганизмами препараты обрабатывали специфическими антителами гонококковыми, гарднереллезными и микоплаз- менными с последующим проявлением вторичными антителами. Результаты РНИФ представлены в табл. 2. Положительная реакция с хламидийными IgY-антителами наблюдалась только в препаратах HeLa, содержащих хламидии.

Суммируя данные по изучению специфичности хламидийных IgY-антител в ИФА и РНИФ, следует заключить, что в исследованных модельных системах IgY-антитела проявляют высокую избирательность; перекрестные иммунологические реакции, которые могли бы стать причиной ложно-положительных результатов, не выявлены.

П р и м е р 3. Иллюстрация использования набора.

Во флаконы с хламидийными антителами и ФИТЦ-мечеными козлиными антителами добавляют по 1,0 мл дистиллированной воды и растворяют содержимое, тщательно перемешивая при комнатной температуре в течение 2 мин. Растворенные препараты хранят при температуре 4^оС не более 10 суток.

Стандартный образец хламидийной культуры (СОП) растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды.

На деколированную лунку предметного стекла для приготовления мазков, входящего в набор, наносят 30 мкл СОП, равномерно распределяют по поверхности лунки, подсушивают на воздухе и фиксируют в 96%-ном спирте этиловом ректификованном в течение 5 мин.

Для приготовления препаратов из зараженной хламидиями клеточной культуры используют линию HeLa, пассируемую в среде N 199 с добавлением сыворотки крупного рогатого скота в концентрации 10% Клинический материал от больных забирают, используя зонды металлические с тампонами для приготовления мазков, входящие в состав набора.

Клетки выращивали на покровных стеклах в чашках Петри в СО-инкубаторе при 37^оС содержании СО в инкубаторе, равном 5% и влажности, равной 90% в течение 2 суток до формирования субконфлюентного монослоя. Для заражения клеток HeLa хламидиями готовят 10%-ную взвесь на среде N 199 желточных мешков куриных эмбрионов, в которых пассировали штамм С. trachomatis L2. Титр хламидий в суспензии должен составлять не менее 10 LD50/0,03 мл. Перед заражением клеток 10%-ную взвесь желточных мешков выдерживают при 4^оС в течение 2 ч для осаждения грубодисперсных частиц. В чашках Петри с культурой НеLa удаляют половину объема питательной среды и заменяют ее на равный объем 10% -ной взвеси желточных мешков. Чашки Петри помещают в СО-инкубатор на 2 ч. Среду удаляют, клетки промывают один раз стерильным фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) и заливают свежей питательной средой с сывороткой крупного рогатого скота в концентрации 10% Чашки Петри с культурой клеток помещают в СО-инкубатор на 2 суток. Среду удаляют, клетки на покровных стеклах фиксируют в 96%-ном спирте этиловом ректификованном в течение 5 мин. Препараты не зараженных хламидиями клеток HeLa на покровных стеклах готовят в аналогичных условиях.

Получают сыворотку от кроликов, иммунизированных СОП. Титр хламидийных антител, определенный с СОП иммуноферметным анализом, должен быть не ниже 1: 25600.

На фиксированные препараты клеток HeLa, зараженных штаммом Chlamydia trachomatis L2, микропипеткой наносят 30 мкл иммунной кроличьей сыворотки в разведении 1:100 в ФСБ. Стекла помещают во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре 15 мин.

Стекла промывают в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

Контрольные препараты зараженных хламидиями клеток HeLa обрабатывают неимунной кроличьей сывороткой (см. выше),

Готовят разведение антител, начиная с разведения 1:2 до 1:32 в объеме 0,5 мл на ФСБ.

На фиксированные препараты микропипеткой наносят 30 мкл раствора антител, стекла помещают во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре 15 мин.

Стекла промывают в проточной водопроводной воде 2 мин, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе.

На препараты микропипеткой наносят 30 мкл раствора ФИТЦ-меченых козлиных антител, стекла помещают во влажную камеру и выдерживают при комнатной температуре 15 мин.

Стекла промывают.

На высушенные препараты наносят каплю водно-глицериновой смеси (к 1,0 мл дистиллированной воды добавляют 2,0 мл глицерина и перемешивают до получения однородного раствора), препараты накрывают покровными стеклами и микроскопируют в люминесцентном микроскопе типа ЛЮМАМ (ЛОМО) с водно-эммерсионым объективом (900х) и светофильтром типа ФСl-2 или ФСl-4.

* ФСБ: натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 0,36 г;

натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,15 г;

натрий хлористый 0,85 г;

Растворяют в 100,00 мл дистиллированной воды при перемешивании, рН 7,2 + 0,1. Коррекцию рН проводят раствором едкого натрия в концентрации 0,1 моль/л или соляной кислотой в концентрации 1 моль/л.

Реакция непрямой иммунофлуоресценции считается положительной, если в мазке наблюдается ярко-зеленое свечение хламидий. Титр антител, определенный с СОП, должен быть не менее 1:16. В препаратах культуры HeLa, зараженной хламидиями, должно наблюдаться ярко-зеленое свечение элементарных и ретикулярных телец, расположенных отдельно, на поверхности клеток или внутриклеточно. Клетки должны светиться оранжевым цветом. В препаратах культуры HeLa, не зараженной хламидиями, а также в культуре НеLa, зараженной хламидиями и обработанной кроличьей хламидийной сывороткой, зеленое свечение должно отсутствовать. Результат реакции иммунофлуоресценции с зараженной хламидиями культурой HeLa, обработанной неиммунной кроличьей сывороткой, должен быть положительным.

Клинические образцы были испытаны одновременно методом культуры клеток и предлагаемым набором. Чувствительность анализа составила около 90% специфичность 97% При сравнении с двумя коммерческими ИФ препаратами Orion Chlamyset и Chlamydia Direct IF bioMerieux получены идентичные результаты. Производилась проверка антител, входящих в состав набора, на наличие перекреста с антигенами возбудителей основных урогенитальных заболеваний. Перекрест не обнаружен ни с одним из данных видов микроорганизмов.

Испытания эффективности набора проводились на базе ряда клинических лабораторий. Для сравнения использовались моноклональные люминесцирующие антитела Chlamyset фирмы Orion, Финляндия. Хламидийная этиология заболеваний была установлена у 81% обследованных больных, из них в 94% с помощью предлагаемого набора и в 89% случаев с помощью финского набора Chlamyset. Причем у 5 из 102 больных хламидийная инфекция диагностирована только при помощи диагностикума Chlamyset, в то время, как у 9 пациентов положительный результат получен только с рассматриваемым набором.

Набор может быть использован не только для клинической диагностики, но и для определения антибиотикоустойчивости возбудителя путем обнаружения хламидийных телец в клеточной культуре, инфицированной клинической пробой и инкубированной с соответствующим антибиотиком.

Полученные клинико-лабораторные данные свидетельствуют о высокой диагностической эффективности рассматриваемого набора.