способ получения полипептида со свойствами лимфотоксина человека
Классы МПК: | C12P21/00 Получение пептидов или протеинов C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона C12N15/28 факторы некроза опухоли C07K1/00 Общие способы получения пептидов |
Автор(ы): | Пустошилова Н.М., Лебедев Л.Р., Гилева И.П., Коробко В.Г., Давыдов И.В., Петренко В.А. |
Патентообладатель(и): | Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ, Институт биоорганической химии им.Шемякина РАН |
Приоритеты: |
подача заявки:
1992-05-25 публикация патента:
20.11.1995 |
Использование: медицина, иммунология. Сущность изобретения: в качестве источника целевого продукта используют штамм E.coli ВКПМ В-5279 с высоким уровнем синтеза полипептида, обладающего свойствами лифтотоксина человека; после культивирования штамма-продуцента, разрушения клеток и отделения клеточного остатка проводят двухэтапную хроматографическую очистку экстракта (на ДЕАЕ-целлюлозе при рН 8,7 - 9,2 и на гидроксилапатите при pH 6,6 6,8). Способ обеспечивает высокий выход гомогенного препарата лимфотоксина человека. 5 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3
Формула изобретения
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ЛИМФОТОКСИНА ЧЕЛОВЕКА, включающий культивирование штамма-продуцента, разрушение клеток ультразвуком, удаление клеточного остатка и хроматографию на колонках с сорбентом, отличающийся тем, что в качестве источника лимфотоксина используют штамм Escherichia coli ВКПМ В-5279, а хроматографическую очистку продукта проводят последовательно на ДЕАЕ-целлюлозе при значениях рН от 8,7 до 9,2 и на гидроксилапатите при значениях рН от 6,6 до 6,8.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к биохимии и биотехнологии и представляет собой способ выделения и очистки физиологически активного вещества из штамма-продуцента, содержащего рекомбинантную плазмидную ДНК, кодирующую полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и может быть использовано для производства полипептида с целью детального исследования его свойств и применения в медицинской практике. В организме человека лимфотоксин (ЛТ, он же фактор некроза опухолей -бета, ФНО-









Наиболее близким (прототипом) к заявляемому способу является способ очистки рекомбинантного фактора некроза опухоли человека. Способ основан на использовании штамма Е. coli М15, трансформированного плазмидой рDS 78/RBS11, кодирующей ФНО-





использование недостаточно эффективных способов очистки элюирование ЛТ длительной промывкой буфером с низкой ионной силой, при рН 8,5, практически без сорбции на ДЕАЕ-сефарозе, приводящее к трудности отделения целевого продукта от балластных белков;
использование S-сефарозы, не позволяющее получить достаточно гомогенный продукт;
использование фракционирования сульфатом аммония, приводящее к потере и снижению выхода продукта. Целью изобретения является упрощение способа очистки лимфотоксина и повышение выхода целевого продукта. Это достигается использованием в способе штамма Е. coli ВКПМ В-5279, трансформированного плазмидой, кодирующей полипептид со свойствами лимфотоксина человека, в совокупности с очисткой лимфотоксина путем дезинтеграции клеток ультразвуком, отделения клеточного дебриса центрифугированием и последующих хроматографий клеточного экстракта на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-52 при значениях рН 8,7-9,2 и гидроксилапатите при значениях рН 6,6-6,8. Сущность способа заключается в следующем. Биомассу клеток Е. coli ВКПМ В-5279, выращенную стандартным способом в L-бульоне и собранную центрифугированием, суспендируют в буфере А (10 мМ трис-НСl 1 мМ ЭДТА, рН 8,7-9,2) в соотношении 4-5 мл буфера на 1 г клеток, добавляют фенилметилсульфонилфлуорид до 0,1 мМ. Суспензию подвергают обработке ультразвуком до снижения оптической плотности при длине волны 550 нм до 50-55% от исходной. Клеточный дебрис удаляют центрифугированием и супернатант наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой ДЕ-52 (из расчета 1 г клеток 4-4,5 мл сорбента). Колонку промывают буфером А до снижения оптической плотности в вытекающем растворе при длине волны 280 нм до исходного значения и белки элюируют линейным градиентом концентрации NаСl в буфере А. Элюированный с колонки раствор лимфотоксина при концентрации NaCl 0,07-0,12 М разбавляют в 1,5 раза буфером Б (10 мМ НЕPES, рН 6,6-6,8) трехкратной концентрации, подтитровывают раствор до конечного значения рН 6,6 и наносят на колонку с гидроксилапатитом. Колонку промывают буфером Б и элюируют белки линейным градиентом NaCl. Препарат лимфотоксина, элюированный с колонки при концентрировании NaCl 0,15-0,3 М, имеет чистоту около 95%
Выход электрофоретически гомогенного ЛТ составляет 25-35% от содержания в исходном клеточном экстракте. При содержании ЛТ в продуценте в количестве 10% от суммы клеточных белков это составляет 1,8 мг из 1 г биомассы (10 м/л клеточной культуры), что в 10 раз превышает выход продукта по способу-прототипу. Специфическая активность получаемого препарата не менее 3 107 ед/мг белка (по цитолитическому действию на клетках мышиных фибробластов L 929 в присутствии актиномицина Д). Новым по сравнению со способом-прототипом признаком является использование штамма Е.coli ВКПМВ-5279 в совокупности с хроматографической очисткой целевого продукта на ДЕАЕ-целлюлозе при значениях рН 8,7-9,2 и на гидроксилапатите при рН 6,6-6,8. Именно эта совокупность отличительных признаков обеспечивает получение высокоочищенного препарата лимфотоксина, необходимого для нужд медицины. Использование в способе штамма Е.coli ВКПМ В-5279 с меньшим количеством протеаз, чем в прототипе, позволяет не применять такие дефицитные реактивы, как ингибиторы протеаз бензамидинхлорид, ортофенантролин, трасилол. Применение же плазмиды, несущей ген полипептида со свойствами лимфотоксина человека, обеспечивающей конститутивный синтез ЛТ, не требует индукции для экспрессии. Хроматографию клеточного экстракта проводят на ДЕАЕ-целлюлозе в буфере с концентрацией, в 5 раз меньшей, чем в прототипе, и значениях рН 8,7-9,2, что приводит к сорбции целевого продукта на сорбенте, а элюцию осуществляют градиентом натрия хлористого. Это позволяет наиболее эффективно очистить целевой продукт от балластных белков без значительных его потерь. При значениях рН ниже 8,7 и выше 9,2 значительная часть ЛТ начинает элюироваться в буфере нанесения вместе с основной массой балластных белков, что приводит к снижению эффективности очистки и потере целевого продукта. Проведение второй хроматографической очистки ЛТ на гидроксилапатите в буфере со значениями рН 6,6-6,8 также позволяет сорбировать основную часть продукта на колонке, освободиться от несорбирующихся балластных белков и элюировать высокоочищенный ЛТ в концентрации соли 0,15-0,3 М с высоким выходом (табл.1,2). Предлагаемый способ очистки позволяет получить электрофоретически гомогенный продукт с выходом 25% из клеток, в которых содержание ЛТ всего лишь 0,5% (табл.3), что указывает на его эффективность. Способ легко масштабируется. П р и м е р 1. Получение высокоочищенного препарата лимфотоксина 10 клеток (Е.coli ВКПМ В-5279) суспендируют в 40 мл буфера А (10 мМ трис-НСl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,8) с добавлением фенилметилсульфонилфторида до 0,1 мМ, до гомогенного состояния. Затем суспензию подвергают обработке ультразвуком (УЗДН-2Т; А-24; t





П р и м е р 2. Хроматографическая очистка лимфотоксина из экстракта клеток ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-52 при различных значениях рН. Очистку препарата лимфотоксина проводят, как в примере 1, кроме того, что элюцию белков проводят при значениях рН от 7,6 до 9,6. Результаты очистки представлены в табл.4. Из данных табл.4 видно, что при хроматографической очистке ЛТ на ДЕАЕ-целлюлозе при рН выше 9,2 и ниже 8,8 увеличивается доля продукта, элюированного при нанесении на колонку, при этом снижается его количество в целевой фракции, элюируемой хлористым натрием, и фактoр очистки в ходе хроматографии с 2 до 1,8 при рН 9,6 и 1,6 при рН 8,4. П р и м е р 3. Хроматографическая очистка лимфотоксина на гидроксилапатите при различных значениях рН. Очистку препарата лимфотоксина на гидроксилапатите проводят, как в примере 1, кроме того, что элюцию продукта проводят соответствующим буфером при значениях рН от 6,3 до 7,4. Результаты очистки представлены в табл.5. В опыте 8 элюцию проводят градиентом калий-фосфата. Из данных таблицы видно, что при хроматографической очистке ЛТ на гидроксилапатите при рН выше 6,8 и ниже 6,6 увеличивается доля продукта, не сорбируемого на колонку и элюируемого вместе с балластными белками. При этом снижается количество продукта в целевой фракции, элюируемой хлористым натрием, и снижается фактор очистки. Таким образом, использование предлагаемого способа по сравнению с прототипом позволяет исключить из процесса дефицитные реактивы ингибиторы протеазбензамидинхлорид, ортофенантролин, трисилол; индуктор лактозного оперона изопропил-1-тио-

упростить процесс культивирования клеток штамма-продуцента за счет исключения стадии индукции синтеза целевого продукта;
увеличить выход целевого продукта в 10 раз (выход ЛТ из 1 г биомассы 1,8о мг, в прототипе 0,17 мг из 1 г биомассы);
применить способ очистки для производства ЛТ из биомассы с содержанием целевого продукта от 0,5 до 10% о клеточных белков. Эти преимущества достигнуты использованием в способе штамма-продуцента Е. coli ВКПМ В-5279 в совокупности с очисткой лимфотоксина хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-52 при значениях рН 8,7-9,2 и хроматографией на гидроксилапатите при значениях рН 6,6-6,8.
Класс C12P21/00 Получение пептидов или протеинов
Класс C12P21/02 с известной последовательностью из двух или более аминокислотных остатков, например глутатиона
Класс C12N15/28 факторы некроза опухоли
Класс C07K1/00 Общие способы получения пептидов