5-амино-1-гидроксиметилциклопентан-1,2,3,4-тетраол, 2-амино- 4-гидроксиметил-3a,5,6,6a-тетрагидро-4н-циклопент-[d]- оксазол-4,5,6-триол, их фармацевтически приемлемые соли и способы их получения

Формула изобретения

1. 5-Амино-1-гидроксиметилциклопентан-1,2,3,4-тетраол и его фармацевтически приемлемые соли.

2. 2-Амино-4-гидроксиметил-3a,5,6,6a-тетрагидро-4 H-циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триол и его фармацевтически приемлемые соли.

3. Способ получения 5-амино-1-гидроксиметилциклопентан-1,2,3,4-тетраола, отличающийся тем, что осуществляют гидролиз трехазолина сильной кислотой в течение 20 - 24 ч кипении реакционной массы.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что гидролиз ведут 4 н. водной HCl в течение 24 ч.

5. Способ получения 5-амино-1-гидроксиметилциклопентан-1,2,3,4-тетраола, отличающийся тем, что осуществляют кислотный гидролиз 2-амино-4-гидроксиметил-3a,5,6,6a-тетрагидро-4Н-циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триола.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что гидролиз ведут 6 н., водной HCl.

7. Способ получения 2-амино-4-гидроксиметил-3a,5,6,6a-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] -оксазол-4,5,6-триола, отличающийся тем, что осуществляют гидролиз трехазолина слабой кислотой в течение 5 - 6 ч при кипении реакционной массы.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что гидролиз ведут 0,2 н., водной HCl в течение 6 ч.

Приоритет по признакам и пунктам:

15.02.91 по п.1, кроме фармацевтически приемлемых солей, пп.3 и 4.

04.06.91 по п.2, кроме фармацевтически приемлемых солей, пп.7 и 8.

21.10.91 по пп.5 и 6.

Описание изобретения к патенту

Изобретение предлагает два новых полиоксициклопентановых производных, которые имеют определенные ценные биологические активности, и предлагает способы получения этих соединений, а также способы и композиции, использующие их для терапевтических и профилактических целей.

Соединениями по изобретению являются 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол и 2-амино-4-(оксиметил)- 3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] -ок-сазол-4,5,6-триол, формулы которых (I) и (II), соответственно, представляются ниже. Эти соединения могут быть получены ферментацией или расщеплением соединения, известного как трехазолин, который может быть представлен формулой (III), показанной ниже. Однако, 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триол и трехазолин подвергаются оба таутомерии, и поэтому они могут быть представлены также формулами (IIa) и (IIIa), приведенными на чертеже.

Полагается, что трехазолин может быть тем же соединением, что и названный "трехалостатин" в Международном Издании Договора о патентной кооперации (Пи-Си-Ти) N W 0 90/10010.

Соединения по изобретению обладают способностью ингибировать активность различных гидролаз сахара, и, в особенности, -глюкозидазы и -фруктофуранозидазы (сахаразы инвертазы).

Сообщали, что соединения, обладающие сильной ингибирующей активностью против -глюкозидазы, также как кастаноспермин и дезоксиноджиримицин, являются полезными в качестве противодиабетических средств и в качестве анти-СПИД-средство (Синдром Приобретенного Иммунного Дефицита) [R.A.Gruters et al, Nature, 330, 74-77 (1987); M.S.Humphiries et al Gancer Res, 46, 5215-5222 (1986)] Поэтому предполагается, что соединения, обладающие способностью ингибировать активность -глюкозидазы, будут полезными в качестве противодиабетических или анти-СПИД-ных средств.

Кроме того сообщали, что соединения обладающие сильной ингибирующей активностью против -фруктофуранозидазы, такие как АО-128 и Акарбоуз, являются полезными в качестве противодиабетических средств и в качестве средств против ожирения [Satoshi Horii et al. Journal of Medicinal Chemistry, 29, 1038-1046 (1986); T. Aida et al, Journal of Japanese Society of Food and Nutrition, 34, (2) 134-139 (1981)] Поэтому предполагается, что соединения, обладающие способностью ингибировать активность -фруктофуранозидазы, будут полезными для лечения и профилактики диабетов и ожирения.

Соединениями, имеющими определенное структурное сходство с соединениями по изобретению, являются:

манностатины, описанные, между прочим, Т.Аойаги и другими [T.Aoyagi et al, The Journal of Antibiotics, Vol. XLII N 6. 883 (1989)] которые как сказано, обладают способностью ингибировать активность -Д-маннозидазы;

(1S, 2R,3S,4R,5R)-Метил-[2,3,4-триокси-5-(оксиметил)-циклопентил] -амин, описанный, между прочим, Фарромм и другими [R.A.Farr et al, Tetrahedrom Letters, 31, 7109 (1990)] который, как сказано, также обладает способностью ингибировать активность -маннозидазы;

аллосамидин, описанный, между прочим, Сакудой и другими [S.Sakuda et al, Tetrahedron Letters, 27, 2475 (1986)] который, как сказано, обладает способностью ингибировать активность хитиназы насекомых;

и Кифуненсин, описанный, между прочим, Кайакири и другими [H.Kayakiri et al, J.Org, Chem, 54, 4015 (1989)] который, как сказано, является иммуномодулятором cо способностью ингибировать активность -маннозидазы.

Целью изобретения является предоставление новых соединений, обладающих ингибирующей активностью против определенных гидролаз сахара.

Дополнительной целью изобретения является предоставление соединений, обладающих такой активностью, которые поэтому, как предполагается, должны быть полезными при лечении и профилактике опухолей (неоплазм), СПИДа, ожирения и диабетов.

Другие цели и преимущества станут очевидными по мере описания изобретения.

Соединениями по изобретению являются 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол, который имеет формулу (I), представленную выше, и 2-амино-4-(оксиметил)-3а, 5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] -окcазол- 4,5,6-триол, который имеет формулу (II), представленную выше.

5-Амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол может быть получен гидролизом трехазолина или 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] -окса- зол- 4,5,6-триола, который описывается более подробно ниже. 2-Амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d]-ок-сазол- 4,5,6-триол может быть получен гидролизом трехазолина или ферментацией, используя микроорганизм рода Микромоноспора или Амиколатопсис.

Примером трехазолин-продуцирующего микроорганизма рода Микромоноспора является Микромоноспора вида SANK62390.

Примером трехазолин-продуцирующего микроорганизма рода Амиколатопсис является Амиколатопсис вида SANK60791.

Оба эти микроорганизмы являются заново изолированными штаммами.

5-Амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол, соединение (I) настоящего изобретения, и 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d]-ок-сазол -4,5,6-триол, соединение (II) по изобретению, могут быть получены гидролизом трехазолина, получаемого как указано выше, культивированием трехазолин продуцирующего микроорганизма.

Эта реакция преимущественно осуществляется в присутствии кислоты и должна быть проведена в присутствии воды. Отсутствует определенное ограничение на тип применяемой кислоты и в этом случае может быть одинаково применима любая кислота, обычно используемая для общепринятых реакций гидролиза. Примеры включают такие неорганические соли, как соляная или серная кислота, и такие органические кислоты, как уксусная и пропионовая кислота, в водном растворе. Предпочтительной кислотой является соляная кислота.

Реакция может протекать в широком пределе температур и точная температура реакции не является фактором в изобретении. Вообще, мы нашли удобным проводить реакцию при температуре примерно от комнатной температуры до 120^оС, более предпочтительно от 90 до 100^оС. Время, требуемое для реакции, также можно широко варьировать в зависимости от многих факторов, а именно температуры реакции и природы реагентов и применяемых растворителей, и, как объясняется ниже, от целевого продукта реакции.

Должны отдавать должное тому, что и 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол, и 2-амино-4-(оксиметил)-3а, 5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] -оксазол- 4,5,6-триол получаются из одного и того же исходного вещества, используя одну и ту же реакцию гидролиза. Таким образом, продукт реакции будет содержать смесь двух соединений. Однако можно способствовать продуцированию одного из этих соединений больше чем другого путем соответствующего выбора условий реакции. Так, в большинстве случаев более мягкие условия благоприятствуют продуцированию 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола, в то время как более жесткие условия способствуют продуцированию 5-амино-1-(оксиметил)-циклопент-1,2,3,4-тетраола.

Таким образом, для продуцирования 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола, мы предпочитаем применять относительно более мягкий кислотный реагент, например 0,2 н.водную соляную кислоту, и реакции преимущественно позволяют протекать в течение периода времени от 1 ч до 2 сут, более предпочтительно от 5 до 6 ч.

С другой стороны, чтобы способствовать реакции протекать всеми путями с получением 5-амино-1-(оксиметил)-циклопен- тан-1,2,3,4-тетраола предпочтительной является более сильная кислота, такая как 4 н.водная кислота, и реакции предпочтительно позволяют протекать в течение периода времени от 1 ч до 2 сут, более предпочтительно от 20 до 24 ч.

Дополнительно, 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол может быть получен путем гидролиза 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола. В этом случае, реакция гидролиза по изобретению может быть проведена в присутствии кислоты или основания. Отсутствует определенное ограничение на тип используемой кислоты или основания, и в этом случае может быть одинаково применена любая кислота или любое основание, обычно используемые в реакциях гидролиза.

Когда для реакции используется кислота, примеры подходящих кислот включают: неорганические кислоты, такие как галоидоводородные кислоты (например, соляная кислота, бромистоводородная кислота или йодистоводородная кислота), серная, хлорная, фосфорная и азотная кислоты; органические карбоновые кислоты, такие как низшие алкановые кислоты (например, муравьиная, уксусная, щавелевая или трифторуксусная кислоты); низшие алкансульфоновые кислоты (например, метансульфоновая, этансульфоновая и трифторметансульфоновая кислоты); и арилсульфоновые кислоты (например, бензолсульфоновая или пара-толуолсульфоновая кислоты и т.д.). Предпочтительными кислотами являются неорганические кислоты, в частности, соляная кислота.

Реакция преимущественно проводится в присутствии растворителя. Реакция обычно преимущественно осуществляется в присутствии растворителя. Отсутствует определенное ограничение на природу (тип) применяемого растворителя при условии, что он не имеет неблагоприятного воздействия на реакцию или на вовлеченные в реакцию реагенты и что он может растворять реагенты, по меньшей мере до некоторой степени. Примеры подходящих растворителей включают спирты, такие как метанол, этанол, пропанол или бутанол; сульфокислоты, такие как диметилсульфоксид или сульфолан; органические кислоты, особенно жирные кислоты, такие как уксусная или пропионовая кислота и воду. Предпочтительные растворители включают воду и смеси воды и органического растворителя.

Количество используемой кислоты обычно и преимущественно составляет от 1 до 20 молей, более предпочтительно от 5 до 10 молей, на моль исходного соединения.

Реакция может протекать в широком пределе температур и точная (определенная) температура реакции не является решающим фактором в изобретении. Обнаружено, что удобно проводить реакцию при температуре примерно от комнатной температуры до 150^оС, более предпочтительно от 90 до 110^оС. Время, требуемое для реакции, также может широко варьировать в зависимости от многих факторов, а именно температуры реакции и природы реагентов и применяемого растворителя. Однако при условии, что реакция осуществляется при описанных предпочтительных условиях, период времени от 1 ч до 2 сут, более предпочтительно от 20 до 30 ч, обычно будет достаточным.

Когда для реакции используется основание, примеры подходящих оснований включают: неорганические основания, такие как гидроокиси щелочных металлов (например гидроокись лития, натрия или калия); гидроокиси щелочно-земельных металлов (например, гидроокись кальция или бария); карбонаты щелочных металлов (например карбонат натрия или калия); и галогениды щелочных металлов (например йодистый натрий, бромистый натрий или йодистый калий); и органические основания, такие как аммиак, алкиламины (например триотиламин); и гетероциклические амины (например, морфолин, N-этилпиперидин или пиридин).

Реакция преимущественно проводится в присутствии растворителя. Реакция обычно и преимущественно осуществляется в присутствии растворителя. Отсутствует определенное ограничение на природу применяемого растворителя, при условии, что он не имеет неблагоприятного воздействия на реакцию или на вовлекаемые в реакцию реагенты и что он может растворять реагенты, по меньшей мере, до некоторой степени. Примеры подходящих растворителей включают: спирты, такие как метанол, этанол, пропанол или бутанол; простые эфиры, такие как тетрагидрофуран или диоксан; сульфоксиды, такие как диметилсульфоксид или сульфолан, и воду. Предпочтительные растворители включают воду и смеси воды и органического растворителя.

Количество добавляемого основания обычно и преимущественно составляет от 0,01 до 10 молей, более предпочтительно от 1 до 5 молей, на моль исходного соединения.

Реакция может протекать в широком пределе температур и точная (определенная) температура реакции не является решающим фактором в изобретении. Вообще, мы нашли удобным проводить реакцию при температуре от 0 до 120^оС, более предпочтительно примерно от комнатной температуры до 100^оС. Время, требуемое для реакции, может изменяться также широко в зависимости от многих факторов, а именно температуры реакции и природы реагентов и применяемого растворителя. Однако при условии, что реакция осуществляется при описанных предпочтительных условиях период времени от 0,5 ч до 2 сут, более предпочтительно от 1 до 20 ч обычно достаточен.

Целевые соединения формул (I) и (II) могут быть выделены из реакционной смеси общепринятым способом, обычно используемым для разделения и выделения органического соединения, например, различными методами хроматографии, а именно колоночной хроматографией или препаративной тонкослойной хроматографией. Разнообразные пути выбора описаны в связи с разделением и очисткой трехазолина и 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро- 4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола, когда они получаются ферментацией, и эти пути выбора могут быть применены также для разделения и очистки 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраола и 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола, полученных, как это описано выше, путем гидролиза.

Соединения настоящего изобретения, 5-амино-1-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро- 4Н-циклопент-[d] -оксазол-4,5,6-триол, каждый из них содержит по меньшей мере один основной атом азота и может таким образом образовывать соли при присоеди- нении кислот. Отсутствует определенное ограничение на природу (тип) этих солей, при условии, что когда они предназначаются для терапевтических целей, они являются фармацевтически приемлемыми. Когда они предназначаются не для терапевтических применений, например, в качестве интермедиатов при получении других, и возможно более активных, соединений, то в этом случае это ограничение не имеет места. Примеры таких солей при присоединении кислот включают: соли с неорганическими кислотами, особенно с галоидоводородными кислотами (такими как фтористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота или хлористоводородная кислота), хлорной, азотной, угольной, серной или фосфорной кислотами; соли с низшими алкилсульфоновыми кислотами, такими как метансульфоновая, трифторметансульфоновая или этансульфоновая кислоты; соли с арилсульфоновыми кислотами, такими как бензолсульфоновая или пара-толуолсульфоновая кислоты; соли с органическими карбоновыми кислотами, такими как уксусная, фумаровая, винная, щавелевая, малеиновая, яблочная, янтарная или лимонная кислоты; и соли с аминокислотами, такими как клютаминовая кислота или аспарагиновая кислота.

Соединения по изобретению обязательно содержат несколько асимметричных атомов углерода в своих молекулах и, таким образом, могут образовывать оптические изомеры. Хотя они все представляются в описании единственной молекулярной формулой, изобретение включает как отдельные, изолированные изомеры, так и смеси, включая их рацематы. Когда применяются методы стереоспецифического синтеза или применяются оптически активные соединения в качестве исходных веществ, индивидуальные изомеры могут быть получены непосредственно; с другой стороны, если смесь изомеров получается, индивидуальные изомеры могут быть получены общепринятыми методами разделения.

5-Амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол проявляет способность ингибировать активность -глюкозидазы и имеет низкую токсичность, и поэтому можно ожидать, что является полезным при лечении и профилактике опухолей и СПИДа. 2-Амино-4-(оксиметил)-3а, 5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триол обладает способностью ингибировать активность -фруктофуранозидазы и имеет низкую токсичность, и поэтому можно ожидать, что является полезным при лечении и профилактике диабетов и ожирения.

Когда эти соединения предназначаются для терапевтического применения, они могут быть введены отдельно или в подходящей фармацевтической форме, содержащей в дополнение к действующему соединению один или более общепринятых разбавителей, носителей или наполнителей. Тип лекарственной формы зависит от предлагаемого способа применения. Однако в случае перорального способа применения, соединение преимущественно включается в состав лекарственной формы в виде порошков, гранул, таблеток или капсул. Для парентерального применения оно преимущественно включается в состав в виде инъекции. Эти препараты могут быть приготовлены по известному способу путем добавления таких добавок, как наполнители, связывающие вещества, дезинтеграторы (вещества, вызывающие распад-раздробление лекарственной формы), смазывающие вещества, стабилизаторы и модификаторы лекарственных веществ. Хотя дозировка может изменяться в зависимости от симптомов и возраста пациента, характера и остроты заболевания или расстройства и способа и метода применения, в случае перорального применения взрослым пациентом-человеком, соединения настоящего изобретения могут быть обычно применены при суточной дозе 1-1000 мг. Соединения могут быть применены в разовой дозе, или в разделенных дозах, например, два или три раза в сутки.

П р и м е р 1. Получение трехазолина.

1 (А) Культивирование.

Полную петлю (100pfu1) Микромоноспоры вида SANK 62 390 используют, чтобы инокулировать (засеять) каждую из трех Колб Эрленмейера емкостью 500 мл и снабженные все отбойными перегородками (пластинами, отклоняющими поток жидкости) и каждая содержащая 80 мл Среды 1 (имеющей указанный ниже состав) и инокулированные колбы инкубируют при 28^оС в течение 216 ч на роторной трясучке, вращающейся со скоростью 220 об/мин, чтобы получить первую посевную культуру.

Среда 1, Глюкоза 1 Глицерин 1 Овсяная мука 0,5 Сахароза 1 Соевая мука 2 Кислоты касамино 0,5 Прессованные дрожжи 1 СаСО₃ 0,1 СВ 442 0,01 Вода До 100

(перед стерилизацией рН 7,0)

Проценты являются массовыми, основанными на конечном объеме среды.

Каждая из четырех 2-литровых колб Эрленмейера, содержащих каждая по 800 мл среды 2 (имеющей указанный ниже состав), инокулируется с 40 мл культурального бульона из первых колб, и колбы встряхивают по 28^оС в течение 96 ч на роторной трясучке со скоростью 220 об/мин, чтобы получить вторую посевную культуру. 1,5 л этого второго посевного культурального бульона используют, чтобы инокулировать каждую из двух 30-литровых вибрируемых ферментерах, содержащих в каждой из них 15 л среды 2 (имеющей описанный ниже состав), которую сначала стерилизуют при 120^оС в течение 35 мин и охлаждают до 28^оС. Ферментеры перемешивают со скоростью 100 об/мин при 28^оС в течение 96 ч с аэрацией при токе воздуха 15 л/мин.

Среда 2, Глюкоза 2 Растворимый крахмал 1 Прессованные дрожжи 0,9 Мясной экстракт (Киокуто) 0,5 Полипентон 0,5 NaCl 0,5 СаСО₃ 0,3 СВ 442 0,01 Вода До 100

(перед стерилизацией рН 7,2)

Проценты являются весовыми в расчете на конечный объем среды.

(В) Выделение

3 кг Целита 545 (торговая марка для продукции фирмы Джонс Менвилл Продактс Корп.), в качестве помощника фильтрации, добавляют к 30 л всего бульона, полученного по описанному методу, и смесь фильтруют. Фильтрат (29 л) пропускают через колонку, содержащую 6 л Дауэкса SBR-P (C1^-I) (торговая марка для продукции фирмы Дау Кемикл). рН Элюата доводят затем до величины 5,0, после чего раствор пропускают через колонку, содержащую 6 л Дауэкса 50 WX 4(Н⁺) (торговая марка для продукции Дау Кемикл). Трехазолин адсорбирует и таким образом удеживается колонкой. Колонку промывают 20 л деионизированной воды, а затем элюируют 30 л 0,5 н.водного аммиака, чтобы получить 13 л фракций с действующим (активным) соединением. Весь этот элюат (13 л) концентрируют выпариванием при пониженном давлении и лиофилизируют (высушивают при температуре ниже 0^оС), чтобы получить 43,4 г неочищенного порошка, содержащего трехазолин. Неочищенный порошок растворяют в 2 л 100 мМ буферного раствора формиата аммония (рН 6,0) и раствор абсорбируют на колонке, содержащей 1,5 л Дауэкса 50 WX 4 (торговая марка), которую предварительно уравновешивают с помощью 20 мМ буферного раствора формиата аммония (рН 6,0). Колонку промывают 3 л того же буферного раствора формиата аммония (20 мМ), за которым следует промывание 2 л деионизированной воды, после чего колонку элюируют с помощью 0,2 н.водного аммиака. Элюат фракционируют по частям объемом 500 мл. Фракции 2-4, которые содержат фактически весь трехазолин, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Продукт реакции затем лиофилизируют, чтобы получить 2,55 г неочищенного порошка. Неочищенный порошок, полученный повторением стадий вплоть до этого момента, используют непосредственно, без какой-либо дополнительной очистки, в примере 3.

Этот неочищенный порошок абсорбирует на колонке, набитой 200 мл Авицела (торговая марка для продукции фирмы Асахи Кемикл Индастри Кс. Лтд), используя 80 об. водного ацетонитрила. Колонку промывают с 700 мл 80 об. водного ацетонитрила, а затем элюируют сначала с 500 мл 75 об. водного ацетонитрила, а затем с 700 мл 70 об. водного ацетонитрила. Элюат фракционируют по частям объемом 19 мл. Фракции 35-50, содержащие трехазолин, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Остаток затем лиофилизируют, чтобы получить 658 мг порошка. Весь этот порошок растворяют в 150 мл воды и рН полученного раствора доводят до величины 6,0. Затем раствор абсорбируют на колонке, набитой с 300 мл Амберлита CG-50 (Н⁺ NH₄⁺) 2:3) торговая марка. Эту колонку промывают с 500 мл деионизированной воды и элюируют с 0,1 н.водным аммиаком. Элюат фракционируют по частям в 20 мл. Фракции 92-121, содержащие трехазолин, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Полученный остаток затем лиофилизируют, чтобы получить 102,8 мг порошка. Весь этот порошок растворяют в 10 мл 2 мМ буферного раствора формиата аммония (рН 6,0) и полученный раствор абсорбируют на колонке, набитой с 400 мл Дайайона СНР 20 Р (торговое название для продукции Мицубиси Касей Ко. ), используя тот же 2 мМ буферный раствор формиата аммония. Колонку элюируют тем же 2 мМ буферным раствором формиата аммония. Элюат фракционируют по частям объемом 5 мл. Фракции 59-73, содержащие трехазолин, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Полученный остаток затем лиофилизируют, чтобы получить 18 мг порошка, который далее очищают элюированием через Дайайон СНР 20 Р, используя тот же 2 мМ буферный раствор формиата аммония в качестве элюента, чтобы получить 6,2 мг бесцветного порошка.

Этот порошок очищают с помощью препаративной тонкослойной хроматографии следующим образом. Порошок (6,2 мг) растворяют в незначительном количестве воды и наносят на 3 пластины с силикагелью (Мерк Арт 5 715, 20х20 см). Пластины проявляют с помощью смеси ацетонитрила, уксусной кислоты и воды 6: 1: 3 в объемном соотношении до высоты 15 см. Полосу между Rf 0,42 и 0,5 выскребывают из пластин и набивают в колонку. Колонку элюируют со 100 мл деионизированной воды. Элюат пропускают через колонку, содержащую 5 мл Дауэкса 50 WX4 (Н+), где абсорбируется и таким образом удерживается трехазолин. Колонку промывают с помощью деионизированной воды, а затем элюируют с 50 мл 0,5 н.водного аммиака. Элюат концентрируют выпариванием при пониженном давлении и полученный остаток лиофилизируют, чтобы получить 5,1 мг трехазолина в виде бесцветного порошка, для которого жидкостная хроматография высокого разрешения показывает единственный пик.

Продукт реакции имеет следующие свойства:

1) Основные свойства и вид: основный бесцветный порошок;

2) Растворимость: растворим в воде и метаноле, нерастворим в ацетоне и хлороформе;

3) Цветная реакция: положительная к серной кислоте;

4) Молекулярная формула: C₁₃H₂₂N₂O₁₀;

5) Молекулярная масса: 366 (определенная с помощью FAB-масс-спектрометрии "FAB" означает Быстрая Бомбардировка Атомов "ББА");

6) Удельное вращение: []_D²⁵ + 99,5^о (с0,41, Н₂О);

7) Ультрафиолетовый спектр поглощения: _макс.нм (Е_Iст^I%).

Спектр ультрафиолетового поглощения, измеренный в воде, не показывает никакого характерного максимума поглощения выше 220 нм;

8) Инфракрасный спектр поглощения: _макс см^-1 (в BKr), 3367, 2938, 1663, 1552, 1384 и 1056;

9) Спектр ¹Н-Ядерного магнитного резонанса: м.д.

Спектр ¹Н-Ядерного магнитного резонанса (400 МГц) измеряют в окиси дейтерия (дейтерированной воде), используя ТМС (тетраметилсилан) в качестве внешнего стандарта, и показывает следующие сигналы:

3,22 (1Н, дублет дублетов, J 8,98 и 10,31 Гц),

3,38 (1Н, мультиплет, J 2,44, 5,26 и 10,31 Гц),

3,46 (1Н, дублет дублетов, J 8,98 и 9,99 Гц),

3,53 (1Н, дублет, J 11,96 Гц),

3,55 (1Н, дублет дублетов, J 5,26 и 12,21 Гц),

3,57 (1Н, дублет дублетов, J 5,38 и 9,99 Гц),

3,62 (1Н, дублет дублетов, J 12,44 и 12,21 Гц),

3,63 (1Н, дублет, J 11,96 Гц),

3,77 (1Н, дублет, J 4,89 Гц),

4,02 (1Н, дублет, дублетов, J 2,08 и 4,89 Гц),

4,17 (1Н, дублет, J 8,55 Гц),

4,77 (1Н, дублет дублетов, J 2,08 и 8,55 Гц),

5,15 (1Н, дублет, J 5,38 Гц).

10) Спектр ¹³С-Ядерного магнитного резонанса: м.д.

Спектр ¹³С-Ядерного магнитного резонанса (100 МГц) измеряют в окиси дейтерия, используя тетраметилсилан в качестве внешнего стандарта, и показывают следующие сигналы: 60,7, 61,9, 69,6, 69,9, 72,0, 73,0, 73,0, 80,1, 80,3, 80,6, 82,8, 87,3 и 161,1.

11) Жидкостная хроматография высокого разрешения:

Колонка для разделения: Сеншу Пак ОД5-Н-2151 (Сеншу Сайентифик Ко.), 6ф х 150 мм (5 мк),

Подвижная фаза 10 об. ацетонитрила воды, содержащей 0,5% РIС В8 (продукция фирмы Уотерс Инк.),

Скорость течения: 1,5 мл/мин,

Контрольная длина волны: Ультрафиолетовая 210 нм,

Пик, имеющий время удерживания 6,9 мин, наблюдают при температуре 25^оС, и

12) Тонкослойная хроматография: Rf величина: 0,44,

Адсорбент: силикагель на стеклянной пластине (Мерк Арт 5715)

Проявляющий растворитель: смесь ацетонитрила, уксусной кислоты и воды в объемном соотношении 6:1:3.

П р и м е р 2. Получение 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраола.

Раствор 19,3 мг трехазолина (полученного по описанному в примере 1 методу), растворенного в 1 мл 4 н.водной соляной кислоты, помещают в ампулу и гидролизуют нагреванием ее (ампулы) при 100^оС в течение 24 ч. К концу этого времени реакционную смесь смешивают с водой, а затем концентрируют досуха путем выпаривания при пониженном давлении. Остаток снова смешивают с водой и концентрируют досуха выпариванием при пониженном давлении, чтобы отогнать соляную кислоту. Остаток от этой перегонки растворяют в 20 мл воды и рН раствора доводят до величины 6,0. Полученный раствор пропускают через колонку с 20 мл Амберлита CG-50 (NH₄⁺)-торговая марка и колонку промывают с 60 мл деионизированной воды, а затем элюируют с 0,2 н.водным аммиаком. Элюат концентрируют выпариванием при пониженном давлении, а остаток лиофилизируют, чтобы получить 5,1 мг неочищенного 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраола в виде бесцветного порошка.

Весь неочищенный порошкообразный 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4- тетраол (5,1 мг), полученный как описано выше, растворяют в незначительном количестве воды и очищают с помощью препаративной тонкослойной хроматографии следующим образом. Раствор наносят на две силикагелевые пластины (Мерк Арт 5715, 20х20 см) и проявляют, используя смесь ацетонитрила, уксусной кислоты и воды в объемном соотношении 6:1:3 вплоть до высоты 15 см. Полосу между Rf 0,36 и 0,47 выскребывают от пластины и набивают в колонку, которую затем элюируют с 50 мл деионизированной воды. Элюат пропускают через 10 мл Амберлита CG-50 (NH₄⁺), при этом на колонке адсорбируется 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол. Колонку затем промывают с 50 мл деионизированной воды и элюируют с 50 мл 0,2 н.водного аммиака. Элюат концентрируют выпариванием при пониженном давлении и лиофилизируют, чтобы получить 3 мг целевого 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраола в виде бесцветного порошка, имеющего следующие свойства:

1) цвет и вид: основный бесцветный порошок,

2) растворимость: растворим в воде, нерастворим в ацетоне и хлороформе,

3) цветная реакция: положительная к нингидриновой реакции,

4) молекулярная формула: C₆H₁₃NO₅,

5) молекулярная масса: 179 (определяемая с помощью FAB-масс-спектрометрии),

6) удельное вращение []_D²⁵ -3,7^о (с0,51, Н₂О),

7) ультрафиолетовый спектр поглощения: _макс нм (Е_I^I% см):

Ультрафиолетовый спектр поглощения, измеренный в воде, не показывает никакого характерного максимума поглощения выше 210 нм.

8) Инфракрасный спектр поглощения: _макс см^-1 (вКBr), 3384, 1582, 1474, 1380 и 1040.

9) Спектр ¹Н-Ядерного магнитного резонанса: м.д.

Спектр ¹Н-Ядерного магнитного резонанса (400 МГц) определяют в окиси дейтерия, используя тетраметилсилан в качестве внешнего стандарта, и показывает следующие сигналы:

3,12 (1Н, дублет, J 7,1 Гц),

3,56 (1Н, дублет, J 11,98 Гц),

3,62 (1Н, дублет, J 12,2 Гц),

3,62 (1Н, дублет, J 6,8 Гц),

3,78 (1Н, дублет дублетов, J 5,5 и 6,8 Гц),

3,90 (1Н, дублет, дублетов, J 5,5 и 7,1 Гц),

10) Спектр ¹³С-Ядерного магнитного резонанса: , м.д.

Спектр ¹³С-ядерного магнитного резонанса (100 МГц) определяют в окиси дейтерия, используя метраметилсилан в качестве внешнего стандарта, и показывает следующие сигналы:

57,8, 61,0, 73,6, 79,4, 81,5 и 81,7 и

11) Тонкослойная хроматография:

Rf величина: 0,39,

Адсорбент: силикагель на стеклянной пластине (Мерк Арт 5 715),

Проявляющий растворитель: смесь ацетонитрила, уксусной кислоты и воды в объемном соотношении 6:1:3.

П р и м е р 3. Получение 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопе- нт-[d]-оксазол- 4,5,6-триола.

100 г неочищенного порошка, полученного по описанному в примере 1 методу и содержащего установленное количество (225 мг) трехазолина, растворяют в смеси 100 мл воды и 150 мл 4 н.водной соляной кислоты, и рН полученного раствора доводят до величины 2,5 добавлением 4 н.водной соляной кислоты. Затем к раствору добавляют 8 мл концентрированной соляной кислоты и 72 мл воды, чтобы довести общий объем до 480 мл и чтобы получить концентрацию соляной кислоты, равную 0,2 н. Полученный раствор помещают в круглодонную колбу, а затем гидролизуют на масляной бане, поддерживаемую при 100^оС в течение 6 ч. К концу этого времени реакционную смесь смешивают с водой, а затем концентрируют досуха выпариванием при пониженном давлении. Последовательность смешивания с водой и выпаривания досуха повторяют, чтобы отогнать соляную кислоту. Остаток растворяют в 400 мл воды и рН раствора доводят до 6,0 добавлением 1 н.водного раствора гидроокиси натрия. Затем раствор разбавляют с водой до объема 8 л. Полученный раствор пропускают через колонку, набитую с 600 мл Амберлита СG-50 (NH₄⁺), и колонку промывают с 6 л деионизированной воды, а затем элюируют с помощью 0,5 н.водного аммиака. Элюат концентрируют выпариванием при пониженном давлении до объема 200 мл и концентрат пропускают через колонку, набитую с 800 мл Дауэкса 1Х2 (ОН^-). Затем колонку элюируют деионизированной водой. После удаления первых 1,5 л элюата, последующий элюат фракционируют по частям объемом 20 мл. Каждую фракцию оценивают количественным анализом, описанным ниже, для определения содержит ли она целевое соединение. Фракции 70-110, которые содержат это соединение, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Остаток лиофилизируют, чтобы получить 30 мг 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола в виде бесцветного порошка, имеющего следующие свойства:

1) цвет и вид: основный бесцветный порошок,

2) растворимость: растворим в воде, нерастворим в ацетоне и хлороформе,

3) молекулярная формула: C₇H₁₂N₂O₅,

4) молекулярная масса: 204 (определенная с помощью FAB-масс-спектрометрии);

5) удельное вращение: []_D²⁵ +10^о (С0,51, Н₂О),

6) ультрафиолетовый спектр поглощения: _макс нм (Е_I^I% см),

Ультрафиолетовый спектр поглощения определяют в воде, и он не показывает никакого характерного максимума поглощения выше 210 нм,

7) инфракрасный спектр поглощения: _макс см^-1 (в КВr), 3358, 1668, 1528, 1398 и 1066;

8) спектр ¹Н-Ядерного магнитного резонанса: , м.д.

Спектр ¹Н-Ядерного магнитного резонанса (500 МГц) определяют в окиси дейтерия, используя ТСП (триметилсилил- пропионат натрия) в качестве внутреннего стандарта, и показывает следующие сигналы:

3,73 (1Н, дублет, J 11,72 Гц),

3,82 (1Н, дублет, J 12,21 Гц),

3,97 (1Н, дублет, J 4,4 Гц),

4,23 (1Н, дублет дублетов, J 4,4 и 2,44 Гц),

4,37 (1Н, дублет, J 8,79 Гц),

5,03 (1Н, дублет дублетов, J 8,79 и 2,44 Гц),

9) жидкостная хроматография высокого разрешения:

Колонка для разделения: Асахи Пак Е5-502С (Асахи Кемикл Индастри Ко. Лтд.),

Подвижная фаза: 20 мМ ацетат аммония (рН 8,5) + 50 мМ водный хлористый натрий,

Скорость течения: 1 мл/мин,

Контрольная длина волны: Ультрафиолетовая 210 нм,

Температура: 25^оС,

Время удерживания: 8,39 мин.

Количественный анализ 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопе- нт-[d] оксазол-4,5,6-триола, используя газовую хроматография/масс-спектрометрию.

Количественный анализ, на который ссылаются выше, проводят следующим образом.

Образец растворяют в растворителе (воде) известного объема жидкости. В ампулу помещают 10 мкл полученного раствора и выпаривают досуха для ацетилирования. К остатку добавляют 30 мкл уксусного ангидрида и 50 мкл пиридина и полученную смесь нагревают при 60^оС в течение 40 мин. Любой избыток реагентов удаляют продуванием тока газообразного азота через реакционную смесь. Остаток смешивают с известным количеством внутреннего стандарта (пентаацетил-1-амино-1-дезокси--Д-глюкозы), и смесь растворяют в 100 мкл этилацетата, чтобы получить опытный образец для газо-хроматографического/масс-спектрометрического анализа. Анализ проводят, используя капиллярную колонку с плавленным кремнеземом (продукция Джи энд Ви Сайентифик Ко. ДВ-5, 15 м) в качестве колонки для газовой хроматографии. Опытный образец (2 мкл) инъекцируют и температуру колонки повышают от 60 до 280^оС со скоростью 25^оС/мин. Отрицательные ионы определяют методом химической ионизации, используя газообразный метан вместе с квадрупольным масс-спектрометром Трио-1 (продукция фирмы УС). Пики отрицательных ионов при м/z 388 (соответствующий внутреннему стандарту пентаацетильному соединению) и при м/z 413 (соответствующий пентаацетату 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола) используют для количественного анализа. Содержание 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола вычисляют с помощью метода внутреннего стандарта.

П р и м е р 4. Получение 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраола.

Раствор 16 мг порошкообразного 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола, растворенного в 2 мл 6 н.водной соляной кислоты, запаивают в ампуле, а затем гидролизуют нагреванием при 100^оС в течение 24 ч. К концу этого времени к гидролизату добавляют воду и полученную смесь концентрируют досуха выпариванием при пониженном давлении. Остаток снова растворяют в воде и полученный раствор снова концентрируют досуха, чтобы удалить соляную кислоту, а затем полученный остаток растворяют в 20 мл воды и рН раствора доводят до величины 6,0 добавлением 1 н.водного раствора гидроокиси натрия. Раствор пропускают через 20 мл Амберлита CG-50 (NH₄⁺), чтобы удержать 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол путем адсорбции, и колонку промывают с 60 мл деионизированной воды, а затем элюируют 0,2 н. водным раствором аммиака. Элюат концентрируют выпариванием при пониженном давлении, чтобы получить 5 мл концентрата. Этот концентрат помещают в колонку, набитую с 50 мл Дауэкса 1Х2 (ОН^-), и колонку промывают с 200 мл деионизированной воды, а затем элюируют с помощью 20 об. водного метанола. Элюат фракционируют по частям объемом 5 мл. Фракции 5-23, которые проявляют ингибирующую активность против -глюкозидазы, объединяют и концентрируют выпариванием при пониженном давлении. Концентрат лиофилизируют, чтобы получить 6,2 мг 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраола в виде бесцветного порошка, имеющего описанные выше свойства.

П р и м е р 5. 5-Амино-1-(гидроксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол гидрохлорид.

8,76 мг 5-амино-1-(гидроксиметил) циклопентан-1,2,3,4-тетраола растворяли в 10 мл воды и значение рКа раствора измерялось титрованием с использованием 0,1 н. стандартного раствора хлористоводородной кислоты. Значение рКа соответствовало 6,93. Поэтому далее, 80 мг 5-амино-1-(гидроксиметил)циклопентан-1,2,3,4-тетраола растворяли в 10 мл воды и добавляли 1 н. хлористоводородную кислоту, затем значение рН приводили до 4,93, что было меньше, чем значение рКа 6,93 но 2,0. Полученный раствор концентрировали упариванием при пониженном давлении. Остаток подвергали лиофилизации с получением 101 мг озаглавленного соединения.

Спектр ¹Н-Ядерного магнитного резонанса: мил.д.

Измерение спектра ¹Н-ядерного магнитного резонанса (400 мГц) производилось в окиси дейтерия с использованием НТСП (натрий триметилсилилпропионата) в качестве внутреннего стандарта и выявило следующие сигналы:

3,68 (1Н, д. J 7,9 Гц),

3,85 (1Н, д. J 12,23 Гц),

3,86 (1Н, д. J 7,7 Гц),

3,89 (1Н, д. J 12,1 Гц),

3,97 (1Н, дд. J 7,6 и 7,7 Гц),

4,21 (1Н, дд. J 7,6 и 7,9 Гц).

П р и м е р 6. 5-Амино-1-(гидроксиметил)циклопентан-1,2,3,4-тетраолсульфат.

Следуя методике, аналогичной описанной в примере 5, но используя 81 мг 5-амино-1-(гидроксиметил)циклопентан-1,2,3,4-тетраола, было получено 102 мг озаглавленного соединения.

Спектр ¹Н-Ядерного магнитного резонанса: мил.д.

Измерение спектра ¹Н-Ядерного магнитного резонанса (400 МГц) производилось в окиси дейтерия с использованием НТСП (натрий триметилсилилпропионата) в качестве внутреннего стандарта и выявило следующие сигналы:

3,68 (1Н, д. J 7,9 Гц),

3,85 (1Н, д. J 12714 Гц),

3,86 (1Н, д. J 7,7 Гц),

3,89 (1Н, д. J 12,04 Гц),

3,97 (1Н, дд. J 7,5 и 7,7 Гц),

4,21 (1Н, дд. J 7,5 и 7,9 Гц).

П р и м е р 7. 2-Амино-4-(гидроксиметил)-3а,5,6,6а-тетрадидро-4Н-циклопент- [d] оксазол-4,5,6-триол гидрохлорид.

10,22 мг 2-амино-4-(гидроксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола растворяли в 10 мл воды и значение рКа раствора измеряли титрованием с использованием 0,1 н.стандартного раствора хлористоводородной кислоты.

Значение рКа соответствовало 7,18. Поэтому далее 80 мг 2-амино-4-(гидроксиметил)-3а, 5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола растворялось в 10 мл воды и добавлялась 1 н.хлористоводородная кислота, затем значение рН доводили до 5,18, что было на 2,0 меньше, чем значение рКа 7,18. Полученный раствор концентрировали упариванием при пониженном давлении. Осадок подвергался лиофилизации с получением 102 мг озаглавленного соединения.

Спектр ¹Н-ядерного магнитного резонанса: мил.д.

Измерение спектра ¹Н-Ядерного магнитного резонанса (400 МГц) производилось в окиси дейтерия с использованием НТСП (натрий триметилсилилпропионата) в качестве внутреннего стандарта и показало следующие сигналы:

3,83 (2Н, д. J 1,0 Гц),

4,06 (1Н, д. J 3,6 Гц),

4,39 (1Н, дд. J 3,6 и 1,9 Гц),

4,56 (1Н, д. J 8,5 Гц),

5,41 (1Н, дд. J 8,5 и 1,9 Гц).

П р и м е р 8. 2-Амино-4-(гидроксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триол сульфат

Следуя методике, аналогичной описанной в примере 7, но используя 83 мг 2-амино-4-гидроксиметил)-3а, 5,6,6а-тетрагидро-4Н-циклопент-[d] оксазол-4,5,6-триола, было получено 105 мг соединения, указанного в заглавии.

Спектр ¹Н-Ядерного магнитного резонанса: мил.д.

Измерение спектра ¹Н-Ядерного магнитного резонанса (400 МГц) осуществлялось в окиси дейтерия с использованием НТСП (натрий триметилсилилпропионата) в качестве внутреннего стандарта и выявило следующие сигналы:

3,83 (2Н, д. J 1,1 Гц),

4,05 (1Н, д. J 3,6 Гц),

4,39 (1Н, дд. J 3,6 и 1,8 Гц),

4,56 (1Н, д. J 8,6 Гц),

5,41 (1Н, дд. J 8,6 и 1,8 Гц).

П р и м е р и с п ы т а н и й 1. Биоло- гическая активность.

Ингибирующая активность 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраола против -глюкозидазы.

Образцы -глюкозидаза (отделенной от миндалей), пара-нитрофенил--Д-глюкопиранозида, дезоксинойджиримицина и кастаноспермина, используемые в этом опыте, приобретены все из Сигма Кемиклс Ко.

Использованными испытуемыми соединениями были 5-амино-1-(оксиметил)-циклопентан-1,2,3,4-тетраол [соединение (I)] и дезоксинойджиримицин или кастаноспермин, оба из которых являются известными соединениями, имеющими этот тип активности.

Смесь 0,01 единиц/мл -глюкозидазы и 100 мкл буферного раствора (рН 5,6), включающего 20 мМ лимонной кислоты, 40 мМ динатрий-фосфата и испытуемого соединения оставляют стоять при 37^оС в течение 15 мин. К концу этого времени к смеси добавляют 50 мкл буферного раствора, содержащего 3 мг/мл пара-нитрофенил--Д-глюкопиранозида, затем этой смеси позволяют реагировать при 37^оС в течение 20 мин. К реакционной смеси добавляют 20 мкл 1 м буферного раствора глицина/гидроокиси натрия (рН 10,4) и количество выделяемого пара-нитрофенола контролируют по поглощению при 405 нм. В таблице перечислены концентрации каждого испытуемого соединения, обязанного ингибировать активность -глюкозидазы на 50% (IC₅₀).

П р и м е р и с п ы т а н и й 2.

Ингибирующая активность 2-амино-4-(оксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4Н-цикло- пент-[d] -оксазол- 4,5,6-триола [соединение (II)] против крысиной -фруктофуранозидазы.

Согласно методу Кесслера и др. [M.Kessler et al, Biochimica et Biophisica Acta, 506, 136-154 (1978)] ферментный раствор базальной граничной пластинки тонкой кишки крыс получают из тонких кишок трех крыс-самцов штамма Вистар и суспендируют в 3 мл физиологического солевого раствора.

Образец 4-аминоантипирина (А 4 382) приобретают из Сигма Кемиклс Ко. а образцы пероксидазы (Сорт I) и глюкозооксидазы (Сорт I) приобретают из Бехрингер Маннгейм Ко. Буферный раствор (рН 6,2), включающий 20 мМ лимонной кислоты и 40 мМ динатрий-фосфата, используют в качестве разбавителя в следующем эксперименте.

Каждая ячейка панели микротитратора с 96-ю ячейками (продукция фирмы Фалкон Ко.) заполняется 130 мкл (во все ячейки) смеси, которая содержит 0,2 мг бычьего сывороточного альбумина (Сигма, А 7 906), 3 единиц глюкооксидазы, 0,132 единиц пероксидазы, 20 мкг 4-аминоактипирина, 40 мкг фенола, 3 микромоля сахарозы и испытуемое соединение. В ячейку добавляют 20 мкл 100-кратно разбавленного раствора ферментного раствора базальной граничной пластинки (оболочки Бруха) из тонкой кишки крыс. Смеси дают реагировать при 37^оС в течение 2 мин и количество выделяющейся глюкозы контролируют по поглощению при 492 нм.

Когда ферментативные реакции проводят без добавления испытуемого соединения и без добавления ферментного раствора, концентрации глюкозы принимают равными 0 и 100% ингибирование, соответственно. Концентрация соединения (II), требуемая для ингибирования активности -фруктофуранозидазы крыс на 50% (IC₅₀), найдена равной 18 мкг/мл.

П р и м е р и с п ы т а н и й 3.

Ингибиpующая активность трехазолина против трегалазы тутового шелкопряда.

Десять личинок тутового шелкопряда пятой возрастной стадии (общая масса 44 г) гомогенизируют, используя политрон (торговая марка) гомогенизатор в 120 мл буферного раствора (рН 5,6), полученного с использованием 20 мМ лимонной кислоты и 40 мМ динатрий-фосфата в течение 2 мин, охлаждая при этом льдом (подобный буферный раствор используют также в будущем). Затем гомогенизированную смесь центрифугируют со скоростью 6000 об/мин в течение 10 мин и надосадочную жидкость отделяют. К 120 мл надосадочной жидкости добавляют 240 мл ацетона, охлаждая льдом и перемешивая при этом, и полученную смесь центрифугируют со скоростью 9000 об/мин в течение 20 мин. Осадок отделяют и растворяют в воде, а полученный раствор лиофилизируют, чтобы получить 2,0 г неочищенного фермента.

В пробирку для испытаний помещают 130 мкл указанного буферного раствора, 50 мкл раствора образца, содержащего трехазолин при различных концентрациях, и 50 мкл раствора фермента из тутового шелкопряда, полученного по описанной выше методике и содержащего 4 мг/мл фермента, и смесь встряхивают на водяной бане, поддерживаемой при 37^оС в течение 15 мин. К концу этого времени добавляют 20 мкл 250 мМ раствора треголазы и смесь оставляют реагировать в течение 15 мин. Реакционную смесь затем нагревают на кипящей водяной бане в течение 3 мин, после чего ее охлаждают смесью льда и воды. Ее затем центрифугируют со скоростью 3000 об/мин в течение 10 мин, и полученный раствор, свободный от осадка, используют для определения концентрации глюкозы.

Реакцию проводят, используя С-пробу Вако на глюкозу (продукция фирмы Wako Pure Chemical Industries Ltd) и 10-кратные количества раствора образца по сравнению с количеством этого раствора по стандартной методике. Процент ингибирования вычисляют из концентраций глюкозы, достигаемых при использовании буферного раствора вместо раствора образца и при использовании буферного раствора взамен субстратного раствора в виде 0 и 100% ингибирования, соответственно, чтобы вычислить концентрацию, требуемую для ингибирования ферментативной активности на 50% (IC₅₀), которая найдена равной 2,0 н. на мл (2,0 нг/мл).