способ трансформации микроорганизмов

Формула изобретения

1. СПОСОБ ТРАНСФОРМАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ, включающий приготовление смеси бактериальных клеток с плазмидной ДНК, электропорацию их в тонком слое раствора, подращивание клеток в жидкой питательной среде и отбор трансформантов на селективных средах, отличающийся тем, что для трансформации используют клетки 12 - 18-часовых культур, смытые с поверхности плотной питательной среды раствором для электропорации, в качестве которого применяют водный раствор полимера, а электропорацию проводят при напряженности импульса 18 - 20 тыс. В/см.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве раствора для электропорации используют водный раствор полиэтиленгликоля с мол.м. 6 - 40 тыс. Дальтон и концентрацией 30 - 60% (вес/объем).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве раствора для электропорации используют водный раствор декстрана с мол.м. 20 - 500 тыс. Дальтон и концентрацией 20 - 60% (вес/объем).

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве раствора для электропорации используют водный раствор фикола с мол.м. 400 тыс. Дальтон и концентрацией 10 - 30% (вес/объем).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к генной инженерии, в частности к способам трансформации микроорганизмов, и может быть использовано для получения штаммов-продуцентов.

Известен способ трансформации, заключающийся в индуцировании компетентности путем предварительной обработки микробных клеток ионами кальция. Способ выполняется следующим образом: 18-часовую бульонную культуру бактерий засевают в свежую питательную среду и подращивают в течение 2-4 ч до середины фазы логарифмического роста при активной аэрации культуры с помощью шуттель-аппарата, затем клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в охлажденном растворе следующего состава: 50 ммоль CaCl₂, 10 ммоль Трис ОН, рН 8,0. Полученную смесь инкубируют при температуре 4 2^оС в течение 15 мин и осаждают бактериальные клетки центрифугированием. Надосадочную жидкость сливают, полученный осадок ресуспендируют в описанном буфере (конечный объем 1/15 от исходного объема раствора, из которого проводилось осаждение) и инкубируют не менее 12 ч при температуре 4 2^оС. Затем по 50-200 мкл суспензии смешивают с раствором плазмидной ДНК (0,1-1,0 мкг), инкубируют при температуре 4 2^оС в течение 20 мин и 2 мин при температуре 42 0,5^оС, после чего добавляют 1,0 мл питательного бульона и подращивают в течение 1 ч при температуре 36 1^оС. Полученную культуру рассеивают на селективные среды. Выход трансформантов кишечной палочки в пределах 1,0 10⁴ 1,0 10⁶ колоний на 1 мкг плазмидной ДНК. Общим с заявленным способом является этап подращивания трансформантов в жидком питательном бульоне в течение 1 ч перед рассевом на селективную среду. Этап необходим для экспрессии генов антибиотикоустойчивости плазмидного вектора, переданного в реципиентные клетки.

Основные недостатки способа: длительность и сложность выполнения, а также его биологическая опасность при работе с рекомбинантными микроорганизмами.

Длительность способа обусловлена двумя факторами.

1. Необходимостью использования молодых, активно делящихся клеток реципиентного штамма. Клетки, собранные в стационарной фазе развития культуры, либо вообще не трансформируются по данному способу, либо трансформируются с низкой частотой. Для получения клеток, находящихся в средине логарифмической фазы роста, необходимо не менее 2-4 ч подращивать культуру, контролируя ее оптическую плотность.

2. Необходимостью продолжительного инкубирования клеток в растворе, содержащем двухвалентные ионы кальция. Для выполнения этого этапа клетки дважды отмывают центрифугированием и при последнем промывании концентрируют в 15 раз. Если инкубирование в растворе хлористого кальция длится менее 12 ч, то выполнить трансформацию с достаточной эффективностью не удается. Таким образом, способ нельзя выполнить за период меньший, чем 17 20 ч.

Сложность способа обусловлена необходимостью контроля оптической плотности культуры с помощью спектрофотометра или фотоэлектрокалориметра, а также использованием центрифугирования для отмывания и концентрирования клеток. Использование шуттелирования для аэрации культуры и центрифугирования для отмывания и концентрирования клеток может привести к распространению по лаборатории бактериального аэрозоля. Следовательно, способ, включающий также операции, может использоваться только для специальных штаммов кишечной палочки, обеспечивающих безопасность работ с рекомбинантной ДНК.

Известен способ трансформации микроорганизмов, основанный на кратковременном повышении проницаемости клеточных стенок в результате пропускания через них электрического импульса [2] Для осуществления способа 18-часовую бульонную культуру бактерий засеивают в жидкую питательную среду и подращивают в течение 2-4 ч до оптической плотности 1,0 (при 650 нм), затем клетки осаждают центрифугированием и дважды промывают буфером, содержащим 10% глицерина, 0,2 ммоль К₂НРО₄ (рН 7,5). От 10 до 200 мкл суспензии смешивают с плазмидной ДНК, смесь помещают в кювету для электропорации фирмы Bio-Rad и пропускают электрический разряд с напряженностью 12000-14000 В/см (расстояние между электродами 4,0 мм). Для предотвращения образования электрической дуги на поверхность клеточной cуcпензии наcлаивают от 7 до 600 мкл (в завиcимоcти от объема пробы) дважды дистиллированной воды. После прохождения электрического импульса бактериальные клетки переносят в питательный бульон, в течение 10 мин инкубируют при температуре 24 2^оС и рассеивают на селективные среды. Максимальная частота трансформации, достигнутая авторами описанного способа у кишечной палочки, соответствует 1,8 10⁷ трансформантов на 1 мкг ковалентнозамкнутой кольцевой (КЗК) ДНК плазмиды pUC19. Общим с заявленным способом признаком является этап подращивания трансформантов в жидком питательном бульоне в течение 1 ч перед рассевом на селективную среду. Этап необходим для экспрессии генов антибиотикоустойчивости плазмидного вектора, переданного в реципиентные клетки. Другим общим с изобретением признаком является использование электрического импульса для повышения проницаемости клеточных стенок бактерий (электропорации).

К недостаткам данного способа можно отнести длительность и сложность его выполнения, а также его биологическую опасность при работе с рекомбинантными микроорганизмами.

Перечисленные недостатки обусловлены теми же причинами, что описаны для способа, использующего кальцинирование бактериальных клеток: необходимостью подращивания клеток до определенной стадии роста культуры и центрифугирования для их отмывки. Однако продолжительность данного способа на 12 ч меньше, так как этап кальцинирования клеток исключен.

В качестве прототипа выбран способ трансформации микроорганизмов, основанный на электропорации клеток в "тонком слое" буфера [1] Способ выполняется следующим образом: 18-часовую бульонную культуру засеивают в жидкую питательную среду и подращивают до середины логарифмической фазы роста, осаждают центрифугированием, пятикратно промывают 20%-ным раствором глицерина и суспендируют в этом же растворе. 25 мкл смеси клеток и плазмидной ДНК помещают в камеру для электропорации (расстояние между электродами 0,24 мм) и подвергают действию одиночного импульса с напряженностью 13000 В/см. Затем смесь переносят в питательный бульон и после одночасового культивирования при температуре 36 1^оС без аэрации рассеивают на селективные среды. Максимальная достигнутая авторами способа частота трансформации у кишечной палочки 1,0 10⁹ колоний трансформантов на 1 мкг КЗК ДНК pUC19. Общим с изобретением признаком является приготовление смеси бактериальных клеток и плазмидной ДНК в растворе для электропорации и использование электрического импульса для повышения проницаемости клеточных стенок бактерий в отношении плазмидной ДНК, выполняемого в "тонком слое" такого буфера. Другим общим с изобретением признаком является этап подращивания трансформантов перед рассевом на селективную среду в жидком питательном бульоне в течение 1 ч. Этап необходим для экспрессии генов антибиотикорезистентности плазмиды, переданной в реципиентные клетки.

К недостаткам данного способа относятся длительность и сложность выполнения, а также его биологическая опасность при работе с рекомбинантными микроорганизмами. Продолжительность и сложность способа обусловлены теми же причинами, что описаны для аналогов: подращиванием клеток в жидкой питательной среде до середины логарифмической фазы роста и пятикратным промыванием клеток буфером для электропорации. Использование центрифугирования для сбора клеток и их отмывки значительно повышает биологическую опасность проводимых работ из-за возможности образования бактериального аэрозоля при выполнении этой операции. Следовательно, применимость способа сужается только для специальных штаммов кишечной палочки.

Задачей изобретения является упрощение способа, сокращение его продолжительности и снижение биологической опасности для персонала лабораторий и окружающей среды.

Поставленная задача решается благодаря тому, что в способе трансформации микроорганимов, включающем приготовление смеси бактериальных клеток и плазмидной ДНК в растворе для электропорации, электропорацию бактериальных клеток в "тонком слое" буфера, подращивание в жидкой питательной среде микроорганизмов после воздействия на них электрического импульса и плазмидной ДНК и отбор трансформантов на селективных средах, предусмотрены следующие отличия:

а) для трансформации используют клетки 12-18-часовых культур, смытых с поверхности плотной питательной среды раствором для электропорации;

б) в качестве раствора для электропорации используют водные растворы полимеров, в частности растворы полиэтиленгликолей, декстранов, фикола;

в) напряженность электрического импульса значительно увеличена и составляет 18000-21000 В/см.

Сущность предложенного способа заключается в следующем. 12-18-часовую культуру реципиентного штамма микроорганизма смывают с поверхности плотной питательной среды минимально возможным количеством охлажденного буфера для электропорации. По 20-30 мкл тщательно суспендированной пипетированием культуры смешивают с раствором плазмидной ДНК, подвергают воздействию электрического импульса с напряженностью 18-21 тыс.В/см и засеивают в жидкую питательную среду. После одночасового подращивания в статических условиях при температуре 36 1^оС культуру рассеивают на чашки с селективной средой. Смесь бактериальных клеток и плазмидной ДНК, взятых в тех же соотношениях компонентов, но не обработанную электрическим разрядом, используют как контроль.

По заявляемому способу можно выполнить до 30 трансформаций в течение 2-2,5 ч (от этапа суспендирования клеток в электропорационном буфере до рассева на селективные среды). Частота трансформации для КЗК ДНК плазмиды pUC19 достигала 2,3 10⁹ колоний трансформантов кишечной палочки на 1 мкг, т.е. по этому показателю способ не уступает прототипу (кроме кишечной палочки по данному способу были трансформированы представители следующих видов: B. subtilis, B. cereus, S. typhimurium, S. dysenteriae, P. aeruginosa. Hаличие плазмидной ДНК в штаммах-трансформантах подтверждено электрофоретическим исследованием.

П р и м е р 1. Изготавливают камеру для электропорации конструкции Speyer J. F. [1] Электропорационное пространство камеры образуется наложением друг на друга отполированных пластинчатых электродов, выполненных из нержавеющей стали, которые разделяются прокладками из поливинилхлоридной изоляционной ленты. Для осуществления электрического контакта нижний из электродов располагают на неполированной стальной пластинке, соединенной с генератором импульсов, верхний прижимается к прокладке цилиндром из латуни, также соединенным с генератором. Размер электропорационного пространства находится в зависимости от толщины используемой ленты и количества ее слоев. В опытах расстояние между электродами было постоянным 0,24 мм.

П р и м е р 2. Влияние на частоту трансформации напряженности электрического импульса и состава раствора для электропорации изучали следующим образом.

1. 18-часовые культуры, выращенные на поверхности 2,5%-ного агара, приготовленного на основе перевара Хоттингера, смывали одним из следующих растворов (1 мл на чашку Петри): 20%-ный глицерин, 45%-ный полиэтиленгликоль 6000 (ПЭГ 6000), 45-ный полиэтиленгликоль 40000 (ПЭГ 40000), 60%-ный декстран 20000 (декстран 20), 20% -ный фикол 400000 (фикол 400). Все растворы готовили на бидистиллированной воде, концентрация масса/объем.

2. 54 мкл полученной суспензии смешивали с 6 мкл раствора плазмидной ДНК (340 мкг/мл, концентрацию определяли спектрофотометрически /Фрайфельдер Д. Физическая биохимия /Пер. с англ. Е.С. Громовой и С.В. Яроцкого; Под ред. З. А. Шабаровой. М. 1980/). 30 мкл смеси вносили в электропорационное пространство камеры для электропорации и выполняли электрический разряд. Оставшаяся часть смеси использовалась как контроль. Электропорационную камеру предварительно охлаждали в испарителе бытового холодильника в течение 10 мин. Перед каждым опытом ее поверхности, соприкасающиеся с бактериальной культурой, обрабатывали смесью этанола и эфира (соотношение компонентов 4:1).

3. После воздействия электрического импульса по 10 мкл смеси бактериальных клеток и плазмидной ДНК переносили в пробирку с 1,0 мл питательного бульона на основе перевара Хоттингера, предварительно подогретого до температуры 36 1^оС, и в пробирку с 1,0 мл физиологического раствора. Культуру, засеянную в питательный бульон, подращивали в течение 1 ч при температуре 36 1^оС, готовили серии разведений и высевали на чашки с 2,5%-ным агаром на основе перевара Хоттингера, содержащего 50 мкг/мл натриевой соли ампициллина, и на этот же агар, но без антибиотика. Из культуры, суспендированной в физиологическом растворе, готовили серийные разведения и определяли число живых клеток высевом на плотную питательную среду. Такие же высевы делали и из контрольной пробы.

4. Результаты трансформации учитывали после 24 ч инкубирования чашек при температуре 36 1^оС. Устойчивых к ампициллину спонтанных мутантов не обнаружено ни в одном из контрольных опытов. Рассчитанные по результатам высевов частота трансформации и процент погибших под воздействием электрических импульсов различной напряженности клеток приведены в табл.1. Под частотой трансформации понимается количество трансформантов на 1 мкг КЗК плазмидной ДНК.

П р и м е р 3. Влияние молекулярных масс плазмид на частоту трансформации в различных растворах для электропорации определяли по условиям примера 2.

Результаты, приведенные в табл.2, показывают, что с увеличением молекулярной массы плазмиды частота трансформации снижается. Однако даже для самой крупной из исследованных плазмид (RР4) она достаточна для практических целей.

П р и м е р 4. Возможность эффективного использования заявляемого способа для трансформации микроорганизмов других видов, подтверждается данными, приведенными в табл.3.