рекомбинантная плазмидная днк pif16, кодирующая зрелый лейкоцитарный интерферон ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pIF16, кодирующая зрелый лейкоцитарный интерферон ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 человека, размером 4,311 т.п.о. и мол.м. 2,84 Мд, содержащая:

EcoRI - фрагмент ДНК плазмиды pmDs280 размером 3,170 т.п.о.;

два EcoRI/Pst - фрагмента плазмиды pIF6/8 размером 513 п.о.;

синтетический дезоксиолигонуклеотидный дуплекс:

ATCTCTGCGTTCTAAAGAATAAGGATT (I)

ACGTTAGAGACGCAAGATTTCTTATTCCTAATTAA (II)

- синтетический цистрон orf: ATCTCTGCGTTCTAAAGAATAAGGATTAATTC GATGACATATGGCGGCCTTCCTCCGTCGTATTCGCCCTAA ACTGAAGTAAGGATC (88п.о.);

- уникальный сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазой EcoRI;

- уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами NcoI и PstI, расположенные на расстояние 1437 и 3285 п.н. по часовой стрелке от EcoRI-сайта соответственно;

- генетический маркер: ген ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054002/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE"> -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pIFI6 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам;

- тандем мутантных промоторов триптофанового оперона E.coli;

- терминатор транскрипции фага l.

2. Штамм Escherichia coli ВКПМ В-5809 - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 человека.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой конструирование in vitro рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие синтетические гены лейкоцитарного интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 человека, тандем мутантных промоторов (P_tгрх2) триптофанового оперона E.coli и синтетические участки инициации трансляции, обусловливающие эффективный биосинтез полипептида с биологической активностью интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 человека, а также штамм Escherichia coli продуцент этого полипептида.

Интерферон белок с молекулярной массой около 18000 Да, продуцируемый в организме человека активированными лейкоцитами, обладает ярковыраженной противовирусной активностью по отношению к ряду ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Проведены клинические исследования природного лейкоцитарного интерферона и ряда рекомбинантных интерферонов. Показана высокая эффективность лейкоцитарного интерферона при ряде вирусных инфекций (вирусные гепатиты, вирус гриппа, как профилактическое средство, вирус герпеса и др.), а также при некоторых видах опухолевых заболеваний (волосатоклеточный лейкоз и др.). Показано также, что весьма перспективно использование в медицинских целях лейкоцитарного интерферона в комбинации с другими лимфокинами, такими как имунный интерферон, интерлейкины-1 и -2, факторы некроза опухолей человека и др.

Известен способ получения лейкоцитарного интерферона человека, основанный на использовании лейкоцитов донорской крови, которые при индукции вирусами или соответствующими индукторами (диссипол, двухцепочечная РНК и др.) секретируют интерферон во внеклеточную среду.

Недостатком этого метода является чрезвычайно низкий выход целевого продукта, трудности крупномасштабной индукции лейкоцитов донорской крови и как следствие высокая стоимость препаратов интерферона. Кроме того, упомянутый способ получения интерферона не гарантирует получения препаратов, свободных от загрязнения вирусами (такими как вирус гепатита В, вирусы иммунодефицита человека и др. ). Поэтому значительно более перспективным является способ лейкоцитарного интерферона микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого исходного сырья. Использование при этом химического подхода позволяет создать оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

Известны рекомбинантные плазмиды pLeIF(plac) и pLeIF-B1, содержащие полностью синтетический ген, кодирующий полипептид со свойствами лейкоцитарного интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 человека и экспрессирующийся под контролем лактознового оперона E. coli и промотора А1 ранней области фага Т7. Клетки E.coli ВМН 7118, содержащие плазмиду pLeIF(plac) при индукции изопропил-тио- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054002/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-D-галактопиранозидом (IPTG) или клетки E.coli ВМН 7118, содержащие плазмиду pLeIF-B1, обеспечивали уровень биосинтеза интерферона около 10⁸ ед.акт./л бактериальной культуры при плотности 2,5 OD₅₅₀, что соответствует продукции интерферона (IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2) 0,5 мг/л.

Известна рекомбинантная плазмида p280/2IFN, кодирующая полипептид со свойствами интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 человека, в которой тандем двух синтетических генов IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 экспрессируется под контролем тандема двух промоторов триптофанового оперона E.coli и штамм E.coli SG 20050 с этой плазмидой. При выращивании клеток E.coli штамма E.coli SG 20050 с плазмидой p280/2IFN на минимальной среде с низким содержанием триптофана или при индукции клеточной культуры с помощью индолилакриловой кислоты достигается высокий уровень экспрессии генов IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 (25-40 мг рекомбинантного белка на 1 л клеточной суспензии при плотности культуры 10⁹ клеток/мл).

По принципу конструирования, технической сущности и достигаемому результату рекомбинантная плазмида p280/2IFN и штамм E. coli SG 20050 с этой плазмидой являются наиболее близким к заявляемому техническим решением и выбраны в качестве прототипа.

Однако существенным недостатком плазмиды p280/2IFN является необходимость нетехнологичной и дорогостоящей стадии индукции биосинтеза при получении интерферона, так как экспрессия генов IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 в этой конструкции индуцибельна. Кроме того, полицистронная мРНК, трансляция которой обеспечивает синтез интерферона, в районе стыка генов интерферона имеет близко расположенные друг к другу терминирующий и инициирующий сигналы, что приводит к снижению уровня синтеза целевого продукта в результате отрицательной интерференции между термирирующей и инициирующей рибосомами.

Целью изобретения является увеличение уровня биосинтеза интефрерона и упрощения процесса его получения.

Цель достигается с помощью новой рекомбинантной плазмиды pIF16, содержащей тандем двух генов интерферона и кодирующей конститутивный синтез полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона человека, и штамма E.coli SG20050/pIF16, обеспечивающего уровень экспрессии IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 3-5₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054004/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">10⁷ ед./мл клеточной суспензии при плотности клеток 10⁹ клеток/мл, что составляет около 200-300 мг в одном литре такой клеточной суспензии.

Рекомбинантная плазмида ДНК pIF16, кодирующая полипептид со свойствами интерферона человека, характеризуется следующими признаками:

кодиpует аминокислотную последовательность зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 человека,

имеет молекулярную массу 2,84 МД (4,311 т.п.о.),

состоит из:

EcoRI фрагмента ДНК плазмиды pmDS280 (3,170 т.п.о.).

двух EcoRI/PstI фрагментов плазмиды pIF6/8, содержащих фрагмент синтетического гена лейкоцитарного интерферона человека без 7-ми С-концевых триплетов (513 п.о.);

синтетического дезоксиолигонуклеотидного дуплекса

АТСТСТGCGTTCTAAAGAATAAGGATT (I)

ACGTTAGAGACGCAAGATTTCTTATTCCTAATTAA (II)

синтетического цистрона orf ATCTCTGCGTTCTAAAGAATAAGGATT AATTCGATGACATATGGCGGCCTTCCTCCGTCGTATTCGCCCTAAACTGAAGTAAGGATC, имеющего 5"- и 3"-липкие концы для эндонуклеаз рестрикции PstI и EcoRI, соответственно (88 п.o.);

содержит:

в качестве генетического маркера ген ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054002/946.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pIF16 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам,

тандем мутантных промоторов триптофанового оперона E.coli.

терминатор транскрипции фага ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054002/955.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">;

уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенные вправо от сайта EcoRI (279 нуклеотидов): NcoI 1716 нуклеотидов; PstI 3564 нуклеотидов.

Рекомбинантная плазмида pIF16 содержит тандем синтетических генов интерферона, экспрессия которых происходит путем трансляции полицистронной матричной РНК, в которой терминирующий кодон предшествующего цистрона ТАА является частью последовательность Шайн ДальгарноTAAGGA в участке инициации трансляции дистального цистрона. Для уменьшения интерференции между инциирующей и терминирующей рибосомами между двумя генами интерферона встроен синтетический цистрон orf длиной 89 нуклеотидных остатков. Такая организация полицистронной мРНК приводит к снижению отрицательной интерференции при сопряженной трансляции цистронов, что, в свою очередь, делает более эффективным биосинтез белка рибосомой.

На фиг.1 и 2 изображены схема конструирования и физическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pIF16. С этой целью сначала в плазмиду pmDS280 (эта плазмида является производной известной плазмиды pDS280, но содержит мутации в области промоторов P_trp, обеспечивающие независимую от индукторов триптофанового оперона транскрипцию) по сайту EcoRI встраивают EcoRi PstI-фрагмент ДНК плазмиды pIF6/8, содержащий синтетический ген интерферона без 7-ми С-концевых триплетов, в присутствии синтетического дуплекса

ATCTCTGCGTTCTAAAGAATAAGGATT (I)

ACGTTAGAGACGCAAGATTTCTTATTCCTAATTAA (II)

что восстанавливает целостность гена интерферона и приводит к утрате PstI- и одного из EcoRI-сайтов. Полученную таким образом плазмиду pm280/IFN гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой EcoRI и линеризованную плазмидную ДНК лигируют с тем же фрагментом и синтетическим цистроном orf (приведена структура верхней цепи ДНК) ATCTCTGCGTTCTAAAGAATAAGGATTAATTCGATGACATATGGCGGCCTTCCTCCG TCGTATTCGCCCTAAACTGAAGTAAGGATC, имеющего 5"- и 3"-липкие концы для эндонуклеаз рестрикции PstI и EcoR соответственно. После отбора нужных вариантов получают целевую плазмиду pIF16, строение которой подтверждают анализом рестрикционными эндонуклеазами HaeIII и MspI, а также определением нуклеотидной последовательности районов инициации трансляции и N-концевой части гена IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 (см. фиг.2 и 8).

Для получения штамма-продуцента полипептида с биологической активностью лейкоцитарного интерферона человека плазмидой pIF16 трансформируют компетентные клетки E.coli SG20050.

Полученный таким образом штамм E.coli SG20050/pIF16 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные, блестящие, серые, край ровный. Про росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при 4-40^оС при оптимуме рН 6,8-7,0. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды, а также к тетрациклину (до 50 мкг/мл) благодаря наличию транспозона.

Существенными отличиями штамма E.coli SG20050/pIF16 является то, что он обусловливает конститутивный синтез полипептида со свойствами интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 человека с уровнем экспрессии 3-5₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054004/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">10⁷ МЕ/мл клеточной суспензии, что составляет более 50% суммарного клеточного белка бактерий и превышает показатели известных штаммов E.coli. Эти отличия приведены в табл.1.

Полученный штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов в ВНИИ генетика.

На фиг. 1 показаны схемы получения плазмид pm280/IFN и pIF16; на фиг.2 физическая карта рекомбинантной плазмиды pIF16; на фиг.3 первичная структура плазмиды pIF16 в районе встройки тандема искусственных генов IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 и кодируемые ими аминокислотные последовательности. Подчеркнуты нуклеотидные замены в структурных частях генов IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2, отличающие их от природного и синтетического аналогов. Точки сверху установленная в настоящей работе N-концевая последовательность полипептида, выделенного из штамма E.coli SG20050/pIF16, а звездочки сверху N-концевые аминокислоты, идентифицированные в продуктах его бромцианового расщепления. Точки снизу аминокислоты, идентифицированные с помощью гидролиза карбоксипептидазами А+В и Р.

П р и м е р 1. Химический синтез олигонуклеотидов.

Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе System 1 (Beckman) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3"-коцна и 5"-концу с помощью защищенных фосфамитидов 5-диметокситритил-N-ацил-2-дезоксинук-лео- зид-3-О- (метоксидиизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 05,-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054041/2054041t.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">, размер частиц 40-80 мкм), к которому через 3-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют известный синтетический цикл, но после реакции конденсации проводят промывку смолы смесью тетрагидрофуранпиридин-вода (5:3:2). После окончания синтеза защитные группы удаляли последовательной обработкой тиофенолятом триэтиламмония и конц. аммиаком. При этом происходит отделение олигонуклеотида от носителя, 5"-диметокситритильную группу удаляют кислотной обработкой, и олигонуклеотид очищают электрофорезом в 20% ПААГ, содержащем 7М мочевину. выход 1-5 о.е.

П р и м е р 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pIF16.

Клетки бактерий E.coli С600, содержащие плазмидную ДНК pmDS280, превышают при 37^оС в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем плазмидную ДНК выделяют в соответствии с известной процедурой.

Аналогичным образом выделяют дНК плазмиды pIF6/8, содержащей синтетический ген ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 интерферона. Полученные препараты плазмидных ДНК используют для конструирования плазмиды pm280IFN. С этой целью по 10 мкг плазмидных ДНК pmDS280 и pIF6/8 инкубируют с эндонуклеазой рестрикции EcoRI (10 ед) и смесью эндонуклеазой рестрикции EcoRI и PstI (10 ед каждой) соответственно в 30 мкл буфера R, содержащего 20 мм Трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂), 7 мМ меркаптоэтанол, в течение 1 ч при 37^оС. После инкубации реакции останавливают двухкратной экстракцией смесью фенол-хлороформ (1:1) и ДНК высаживают 70% этанолом. Анализ полноты гидролиза и выделение векторного EcoRI-фрагмента плазмидой ДНК pmDS280 (3,168 т.п.о.) и EcoRI/PstI-фрагмента плазмидой ДНК pIF6/8 (около 0,54 т.п.о.) проводят при помощи электрофореза в 1% -ном геле легкоплавкой агарозы. Далее фрагмент (0,2 мкг) соединяют в присутствии дуплекса:

AGAATCTCTGCGTTCTAAAGAATAAGGATT (I)

ACGTTCTTAGAGACGCAAGATTTCTTATTCCTAATTAA (II)

с векторной ДНК (1,5 мкг) с помощью 30 ед. Т4 ДНК лигазы в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15^оС. Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli С600. Трансфоманты высевают на агаризованную среду, содержащую ампициллин (100 мкг/мл) и полученные таким образом отдельные колонии выращивают при 37^оС в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем плазмидную ДНК выделяют в соответствии с известной процедурой и анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции HaeIII и EcoRI. Из клонов, содержащих встроенный фрагмент, выделяют плазмидную ДНК, строение которой подтверждают прямым определением нуклеотидной последовательности ДНК в районе встройки с помощью модифицированного метода Максама-Гилберта. Полученная таким способом плазмида pm280IFN используется для получения целевой плазмиды pIF16.

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды pm280IFN в 80 мкл буфера R прибавляют 10 ед рестрикционной нуклеазы EcoRI и инкубируют 90 мин при 37^оС. Анализ полноты гидролиза и выделение векторного фрагмента (около 3,7 т.п.о.) проводят при помощи электрофореза в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы и 0,5 мкг выделенного вектора лигируют с 02, мкг фрагмента и синтетического дуплекса, использованными в предыдущей сшивки при получении плазмиды pm280IFN, в условиях, описанных выше. 15 мкл этой лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli С600. Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из 10 ампициллиноустойчивых клонов выделяют ДНК и анализируют ее рестриктным анализом с помощью рестриктаз HaeIII и XhoI. Из проанализированных 5 препаратов ДНК показывали нужный набор рестриктных фрагментов. Окончательно структуру рекомбинантной ДНК pIF16 подтверждают определением нуклеотидной последовательности в районе расположения тандема синтетических генов интерферона. Физическая карта плазмиды pIF16 и нуклеотидная последовательность тандема искусственных генов интерферона приведены на фиг.2 и 3 соответственно.

П р и м е р 3. Получение штамма-продуцента полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 человека.

Плазмидой pIF16 трансформируют компетентные клетки E.coli SG20050 и получают штамм-продуцент полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона человека.

П р и м е р 4. Определение продуктивности штамма E.coli продуцента полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона человека.

Клетки E.coli SG20050/pIF16 выращивают при 37^оС в 20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке при скорости вращения 120 об/мин, отбирают пробу 2 мл и клетки центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин. Содержание рекомбинантного интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 определяют тремя различными способами.

I. Радиоиммуноанализ.

Клеточный осадок растворяют в 200 мкл раствора 8 М мочевины в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 20 мкг/мл п-метилсульфонилфторида. Перед внесением в лунки пробы подвергали центрифугированию в течение 2 мин при 12000 об/мин. Сначала в лунки полистирольного планшета вносят 50 мкл раствора кроличьих антител (0,2 мкг/мл) против интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 (ВНИИОЧБ Минмедпрома СССР, Ленинград) в буфере А, содержащем 0,02 М фосфат натрия, рН 7,5, 0,15 М NaCl, 1 мМ EDTA и 0,1% БСА, и инкубируют 1 ч при 20^оС. Затем раствор удаляют из лунок аспирацией, прибавляют 200 мкл 0,4%-раствора бычьего сывороточного альбумина в буфере А (буфер Б) и инкубируют 1 ч при 20^оС. После этого лунки тщательно промывают буфером А, затем вносят исследуемые и калибровочные образцы и инкубируют 18 ч при 4^оС. После трехкратной промывки 200 мкл буфера Б в лунки вносят раствор меченных ¹²⁵J моноклональных антител NK-2 (CellTech, США) в буфере Б и инкубируют 6 ч при 20^оС. Затем лунки планшета промывают несколько раз буфером А, разрезают и просчитывают на гамма-счетчике (LKB, Швеция). Для построения калибровочных кривых использовали высокоочищенный препарат интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 (НПО "Фермент", Вильнюс) с удельной активностью 1,6₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054004/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">10⁸ МЕ/кг.

По данным радиоиммуноанализа продуктивность заявляемого штамма E.coli составляет 4,7₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054004/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">10⁷ МЕ/мл культуры клеток.

II. Определение биологической активности.

Клетки суспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 0,1 М трис-HCl, рН 7,0, 30 мМ NaCl, 1% SDS, 1% меркаптоэтанола и 5 М мочевины, нагревают 3 мин на кипящей водяной бане и центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин. Из супернатантов готовят образцы путем последовательных двукратных разбавлений в среде Эрла (начиная с разбавления 1/100). Активность интерферона определяли стандартным способом по ингибированию цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на диплоидные фибробласты человека. В качестве стандарта использовали препараты лейкоцитарного интерферона человека (ВНИИ ОЧБ Минмедпрома СССР, Ленинград), охарактеризованные относительно международного стандарта B 69/19.

По данным определения биологической активности продуктивность заявляемого штамма E.coli составляет 3-50₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054004/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">10⁷ МЕ/кл культуры клеток.

III. Определение по отношению к суммарному клеточному белку.

Клетки суспендируют 200 мкл буфера, содержащего 125 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 20% глицерин, 3% SDS, 3% меркаптоэтанол, 0,005% бромфеноловый синий, и нагревают 10 мин на кипящей водяной бане и охлаждают во льду. Образцы 2, 5 и 10 мкл подвергают электрофорезу в 12,5% SDS-ПААГ. По окончании электрофореза гель промывают 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и прокрашивают пр помощи кумасси R-250. После отмывки избытка красителя гель сканируют при 550 нм, используя лазерный сканиметр UltroScan XL (LKB, Швеция).

По данным сканирования рекомбинатный интерферон 2 составляет от 50 до 65% всего белка E.coli.

П р и м е р 5. Выделение и характеризация белка, синтезирующегося в клетках штамма E. coli продуцента полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона человека.

Клетки E.coli SG20050/pIF16 выращивают при 28^оС в 500 мл LB-бульона как указано в примере 4, биомассу собирают центрифугирвоанием 15 мин при 6000 об/мин, клеточный осадок промывают 200 мл буфера 5А, содержащем 10% сахарозу, 0,1 М трис-HCl, рН 7,5, 5 mM Na₂EDTA и 0,5 mM DTT, ресуспендируют в 20 мл этого же буфера и разрушают ультразвуком с помощью ультразвуковой установки Soniprep 150 (MSE). Полученный лизат осветляют центрифугированием 30 мин при 10000 об/мин, осадок дважды промывают 30 мл раствора 6 М мочевины в буфере PBS, содержащего 150 mM NaCl, 20 mM калий фосфат, рН 7,5, 5 mM Na₂EDTA, растворяют в 20 мл раствора 7,5 М гуанидинхлорида в буфере PBS, нерастворившиеся частицы удаляют центрифугированием 30 мин при 2000 об/мин и осветленный раствор IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 хранят при -15^оС. Аликвоты этого раствора IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 анализируют тремя различными способами как описано в примере 4.

По данным радиоиммуноанализа полученный раствор IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 содержит 3₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054004/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">10¹⁰ МЕ в 20 мл раствора.

По данным определения биологической активности полученный раствор IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 имеет активность 2-5₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054004/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">10⁹ МЕ/мл.

По данным сканирования рекомбинантный интерферон ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 в полученном растворе IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 составляет 90-95% всего белка.

П р и м е р 6. Анализ аминокислотной последовательности рекомбинантного интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2.

2 мл раствора IFN- 2 хроматографируют на колонке 2,3х40 мм с широкопористым обращеннофазовым носителем Полисил ОДС-300 в градиенте смеси ацетонитрила, изопропанола и воды (3:1:1) со скоростью 1 мл/мин с детекция профиля элюции при 280 нм. Основной белковый пик, содержащий по данным электрофореза гомогенный IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2, собирают и используют для анализа аминокислотного состава. С-концевых аминокилсотных последовательной и N-концевых аминокислотных остатков в продуктах его исчерпывающего гидролиза бромистым цианом с помощью известных методов. Результаты этих анализов приведены в табл.2 и на фиг.3.

Полученные данные о строении продукта экспрессии искусственного гена IFN- ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 в клетках штамма E.coli SG20050/pIF16 свидетельствуют об идентичности исследуемого полипептида его природному аналогу лейкоцитарному интерферону человека ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2.

Таким образом, заявляемое изобретение позволяет получать полипептид со структурой белка идентичной структуре природного лейкоцитарного интерферону человека ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 и и со свойствами лейкоцитарного интерферона ₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054001/945.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">2 человека, причем уровень биосинтеза интерферона составляет 3-5₂ человека, штамм escherichia coli - продуцент зрелого лейкоцитарного интерферона ₂ человека, патент № 2054041" SRC="/images/patents/418/2054004/729.gif" ALIGN="ABSMIDDLE">10⁷ МЕ/мл культуры клетлок, что составляет свыше 50% суммарного клеточного белка E.coli при упрощенной технологии его получения за счет исключения стадии индукции биосинтеза белка и усовершенствования структурной организации полицистронной мРНК, содержащей тандем полностью синтетических генов интерферона.