кетопантотенат кальция, обладающий ацетилирующей активностью d-пантотената кальция

Формула изобретения

Кетопантотенат кальция формулы



обладающий ацетилирующей активностью D-пантотената кальция.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается аналога пантотеновой кислоты (витамина B₃) кальциевой соли N-(4-гидрокси-3,3-диметил-2-оксо-1-бутирил)--аминопропионовой кислоты (кетопантотената кальция) формулы I

(HOCH₂-COCONHCH₂CH₂COO)₂Ca

(l) проявляющего ацетилирующую активность D-пантотената кальция, и может быть использовано в медицине и животноводстве.

Пантотеновая кислота проявляет свои биологические свойства только в D-(R-) форме, DL-форма вдвое менее активна. D-Пантотеновая кислота в организме находится в структуре кофермента А (КоА), который играет центральную роль в обмене веществ человека и животных. Являясь коферментом ацетилирования, КоА в его ацильной форме участвует в биосинтезе углеводов, жирных кислот, аминокислот и белков, стеринов, в синтезе ацетилхлорина. Ацил-КоА необходим для реакций ацетилирования при биотрансформации чужеродных токсических соединений в организме с целью обезвреживания и выведения их из организма. Конъюгация с уксусной кислотой является основным путем инактивации большого количества лекарственных соединений: сульфаниламидов, гидразидов, производных ПАБК и др. КоА образуется в организме при участии цистеина, АТФ и пантотеновой кислоты, причем пантотеновая кислота является единственным незаменимым компонентов в биосинтезе КоА.

В настоящее время витамин В₃ (за рубежом В₅) широко используется в медицине в качестве профилактического и лечебного средства, а также в животноводстве, особенно в птицеводстве и свиноводстве, в качестве витаминной добавки в корм. Недостаток витамина у животных приводит к замедлению роста, снижению воспроизводства, снижению иммунитета к инфекционным заболеваниям.

Для медицинской и пищевой промышленности производится D-пантотенат кальция, для витаминизации кормов DL-пантотенат кальция, содержащий менее 50% активного вещества. Полупродуктом синтеза DL-пантотената кальция является синтетический DL-пантолактон. Для синтеза D-пантотената кальция используется D-пантолактон, который получают различными методами из DL-пантолактона. Все известные методы представляют собой многостадийные процессы с высокими затратами сырья, материалов, энергии и получением больших количеств отходов. Процесс получения D-пантолактона определяет экономику производства витамина. На мировом рынке стоимость витамина в D-форме в 3 раза выше стоимости препарата в DL-форме. Поэтому актуальным является получение новых соединений, обладающих витаминной активностью D-пантотената кальция, имеющих более низкую по сравнению с последним себестоимость при производстве.

Получена кальциевая соль кетопантотеновой кислоты, обладающая ацетилирующей активностью D-пантотената кальция и имеющая значительно более низкую себестоимость при производстве, чем D-пантотенат кальция, так как в синтезе кетопантотената кальция исключается дорогостоящий процесс разделения на энантиомеры пантолактона, то делает его производство менее материально и энергоемким, и экологически более безопасным. Из литературы [1,2,3] известно, что кетопантотеновая кислота не активна как ростовой фактор для микроорганизмов, для которых таковым является D-пентатеновая кислота, и, что кетопантотеновая кислота в опытах in vivo и in vitro превращается в D-пантотеновую кислоту.

Ранее кальциевая соль кетопантотеновой кислоты (кетопантотенат кальция), ее производство и использование в качестве средства, обладающего витаминной активностью D-пантотената кальция не были известны.

Создание нового препарата кетопантотената кальция позволит получить эффективное средство с биологической активностью d-пантотената кальция, которое может быть использовано в медицине и животноводстве.

Кетопантотенат кальция получают конденсацией кетопантолактона с кальциевой солью -аланина в среде низших алифатических спиртов и последующим выделением продукта реакции осаждением ацетоном или упариванием и сушкой очищенного экстракцией водного раствора целевого продукта.

Строение кетопантотената кальция доказано с помощью данных элементного анализа и ИК-спектра. Кетопантотенат кальция белый порошок, хорошо растворим в воде, хуже в спирте, трудно растворим в ацетоне, хлороформе.

П р и м е р 1. 1,02 г (0,025 гмоль) кальция металлического нагревают 1 ч в 25 мл абсолютного этилового спирта, затем прибавляют 4,46 г (0,05 гмоль) -аланина и перемешивают 1 при 65-70^оС. К полученной массе прибавляют 6,55 г (0,05 гмоль) кетопантолактона и перемешивают 2 ч при 65^оС. Затем спирт отгоняют, остаток растворяют в 40 мл воды, затем экстрагируют хлороформом. Водный слой фильтруют, упаривают и сушат. Получают 10,2 г. Выход 89,7% т.пл. 210-212^оС.

Найдено, C 45,42; H 6,05; N 6,03; Ca 8,52.

C₁₈H₂₈O₁₀N₂Ca

Вычислено, C 45,47; H 5,97; N 5,92; Ca 8,46.

ИК-спектр, см^-1: 3400 (ОН, NH); 1700 (СО), 1660, 1560 (амид I, II).

П р и м е р 2. К 4,46 г -аланина в 25 мл метанола прибавляют 1,43 г окиси кальция и перемешивают час при 60-65^оС. Затем прибавляют 6,55 г кетопантолактона и перемешивают час при нагревании. Затем метанол отгоняют до сиропообразного остатка, к которому при перемешивании прибавляют 50 мл ацетона. Осадок отфильтровывают, промывают ацетоном, сушат. Получают 10,32 г, т. пл. 209-212^оС.

Известно, что у интактных животных, получающих достаточные дозы пантотеновой кислоты, ускоряются реакции биотрансформации ариламинов. Таким образом представляется возможным с помощью пантотеновой кислоты регулировать процесс ацетилирования в организме животных и человека. В связи с этим создание новых средств, производных пантотеновой кислоты, изучение их влияния на ацетилирующую способность организма является актуальной задачей. Суммарную ацетилирующую способность организма оценивали методом количественного определения содержания ариламинов в исследуемом субстрате (моче). В качестве объекта ацетилирования выбирают ароматические амины, поскольку их использование позволяет оценивать активность как N-ацетиламинотрансферазы, так и (косвенно) содержание ацетил КоА.

Для целей данного исследования был выбран сульфацил натрия. Исследование ацетилирующей способности организма белых крыс проводили на беспородных половозрелых крысах-самцах при четырехдневном введении кетопантотената кальция. В каждую группу включали по 14 особей. Исследуемый препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 20 мг/кг. На 4-й день через 4 ч после последнего введения исследуемого вещества внутрибрюшинно вводили раствор сульфацила натрия в дозе 20 мг/кг. Все крысы отсаживались в обменные клетки для сбора мочи. Полученные данные сравнивались с контролем (1 серия, только сульфацил Na) в дозе 20 мг/кг и с D-пантотенатом кальция (II серия).

Средний вес животных в группе колеблется в пределах 158,212,3 г, соответственно абсолютная доза сульфацила составила 3,16 0,25 мг. Измерения диуреза показали, что исследуемое вещество, как и D-пантотенат кальция не изменяет объем выделенной мочи по сравнению с I серией. Анализ результатов экспериментов свидетельствует, то процент выведения сульфацила с мочей значимо не отличался от результатов I и II серии.

Исследуемое вещество в 3 раза повышало экскрецию ацетилированного продукта по сравнению с контролем. При этом выведение свободного продукта снижалось на 10% По сравнению с D-пантотенатом кальция выведение сульфацила как в ацетилированной, так и в свободной форме практически не изменилось (табл. 1,2).

Таким образом, в итоге проведенных экспериментов установлено, что суммарная ацетилирующая способность организма белых крыс по тесту ацетилирования ароматических аминов (N-ацетилирование) значимо возрастает под влиянием кетопантотената кальция. При этом активность исследуемого вещества лишь незначительно превышала таковую D-пантотената кальция. Для определения острой токсичности кетопантотената кальция в эксперименте находилось 42 белых нелинейных мышей обоего пола, средней массой 18 3 г. Животные распределены на 7 групп по 6 голов в группе. Первые 6 групп получили кетопантотенат кальция внутрь одноразово в 0,2 мл дистиллированной воды в дозах: 3,4,5,6,7,8 г/кг массы. 7-я группа контрольная, мыши этой группы получили одноразово внутрь только по 0,2 мл дистиллированной воды. Наблюдение за мышами велось в течение 14 дней. Начиная с дозы 6 г/кг в первые 2 ч после введения препарата наблюдались признаки интоксикации: вялость, учащенное дыхание. Затем эти признаки бесследно проходили. Мыши всех групп практически здоровы, отклонений от контроля в состоянии и поведении животных не отмечено. По окончании опыта после забоя и визуального осмотра внутренних органов не обнаружено никаких изменений. Большие дозы препарата ввести не удалось из-за его дальнейшей нерастворимости. Кетопантотенат кальция можно считать малотоксичным соединением, так как его доза в 8,0 г/кг оказалась нетоксичной, а терапевтическая доза D-пантотената кальция равна 13,2 мг/кг. LD₅₀ для D-пантотената кальция при пероральном введении равна 5,92 г/кг, следовательно, кетопантотенат кальция можно считать менее токсичным соединением, чем D-пантотенат кальция.

Изучение субхронической токсичности кетопантотената кальция проводилось в течение 2 месяцев в сравнении с D-пантотенатом кальция. В опыте находились 70 нелинейных белых крыс обоего пола, средней постановочной массой 725 г, которые распределены на 7 групп. Первые три группы животных получали кетопантотенат в 0,2 мл дистиллированной воды в дозах: 13,2 мг/кг (терапевтическая доза D-пантотената кальция), 132 и 264 мг/кг (дозы в 10 и 20 раз больше терапевтической) внутрь ежедневно в течение опыта. Следующие три группы животных получали в тех же дозах и тех же условиях для сравнения препарат D-пантотенат кальция. 7-я группа контрольная, включала интактных животных. Взвешивание животных еженедельное. Велось постоянное наблюдение за развитием и состоянием крыс. Увеличение массы животных за опыт показано в табл.3, из которой следует, что кетопантотенат кальция, как и сравниваемый с ним D-пантотенат кальция, при длительном применении оказался нетоксичным препаратом. Увеличение массы крыс, получавших кетопантотенат в разных дозах, было выше таковой у контрольных животных на 3,7-6, (соответственно дозам). Примерно в такой же степени было увеличение массы животных, получавших D-пантотенат кальция по сравнению с контролем. По окончании эксперимента при забое и тщательном визуальном осмотре внутренних органов животных ни в одной из групп не было обнаружено местно-раздражающего действия от введения кетопантотената. Исследование острой и субхронической токсичности при длительном введении кетопантотената кальция в разных дозах и местно-раздражающего действия при применении препарата в течение 2 месяцев показало, что кетопантотенат в остром опыте менее токсичен, чем сравниваемый с ним D-пантотенат кальция, и является малотоксичным соединением. При длительном применении в терапевтической, в 10 и 20 раз больше терапевтической дозах он оказался нетоксичным препаратом с выраженной активностью D-пантотената кальция. При длительном применении внутрь не обладает местно-раздражающим действием.

Таким образом, полученные данные по ацетилирующей активности и токсичности свидетельствует о том, что кетопантотенат кальция обладает выраженной активностью D-пантотената кальция и является малотоксичным соединением.

К преимуществам заявляемого соединения следует отнести его меньшую токсичность. Результаты проведенных исследований позволяют рассматривать кетопантотенат кальция как перспективное средство В₃-витаминной активности и значительно более низкой себестоимостью при производстве, чем D-пантотенат кальция, которое может быть использовано в медицине и животноводстве.