способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов
Классы МПК: | C12N9/14 гидролазы (3) C12N9/30 грибковое происхождение C12N9/58 получаемые из грибов |
Автор(ы): | Дембровская Е.М., Кузнецова О.С., Яковлева Е.П., Лукницкая О.Ф., Зобнина И.А., Селезнева А.А., Артемьева Н.Г., Синявина О.С. |
Патентообладатель(и): | Всесоюзный научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения |
Приоритеты: |
подача заявки:
1993-02-08 публикация патента:
20.02.1996 |
Использование: биотехнология. Сущность изобретения: для получения комплексного ферментного препарата, содержащего кислую протеазу и
-амилазу, используют продуцент штамм ВКМf-55, который выращивают на агаризованной соево-глюкозной среде с сернокислым натрием и хлористым кобальтом. Через 5 - 7 сут. конидиями гриба засевают жидкую ферментационную среду следующего состава, мас. %: глюкоза 3,0 - 3,2; крахмал 3,0 - 3,2; кукурузный экстракт 1,2 - 1,25 (по сухому остатку); соевая мука 2,0 - 2,2; сернокислый аммоний 0,20 - 0,25; углекислый кальций 0,25 - 0,30; водопроводная вода остальное до 100%. Глубинное культивирование проводят в течение 3 сут. По окончании ферментации протеолитическая активность культуральной жидкости при рН 3,0 составляет 10 - 12 ГЕ/мл, амилолитическая - 7 - 8 АЕ/мл. Выделение ферментного комплекса проводят из фильтрата культуральной жидкости осаждением этиловым спиртом при температуре 5
1oС с последующей лиофилизацией раствора фермента. 3 табл.
Рисунок 1
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054001/945.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054013/177.gif)
Формула изобретения
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ И ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ, предусматривающий приготовление мицелиального посевного материала продуцента Aspergillus oryzae на среде, содержащей соевую муку, водопроводную воду, и последующее глубинное культивирование полученного посевного материала на ферментативной среде, содержащей соевую муку, водопроводную воду, до достижения максимальной активности, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штамм гриба Aspergillus oryzae ВКМ F-55, а выращивание спорового материала ведут на среде, дополнительно содержащей глюкозу, сернокислый натрий, хлористый кобальт, углекислый кальций и агар-агар, при следующем соотношении компонентов, мас.%:Соевая мука - 1,0 - 1,2
Глюкоза - 2,0 - 2,2
Сернокислый натрий - 0,05 - 0,06
Хлористый кобальт - 0,00010 - 0,00015
Углекислый кальций - 0,20 - 0,25
Агар-агар - 2,0
Водопроводная вода - Остальное
при температуре 26 - 28oС в течение 5 - 7 суток, культивирование посевного материала ведут на ферментативной среде, дополнительно содержащей глюкозу, крахмал, кукурузный экстракт, сернокислый аммоний, углекислый кальций, при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Глюкоза - 3,0 - 3,2
Крахмал - 3,0 - 3,2
Кукурузный экстракт - 1,20 - 1,25
Соевая мука - 2,0 - 2,2
Сернокислый аммоний - 0,20 - 0,25
Углекислый кальций - 0,25 - 0,30
Водопроводная вода - Остальное
при температуре 26 - 28oС в течение 3 суток.
Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к медицинской промышленности, в частности к микробиологическому синтезу ферментов медицинского назначения. Известен способ получения комплекса протеаз и![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054001/945.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054001/945.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054001/945.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054013/177.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054013/177.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054001/945.gif)
использование нового штамма Aspergillus oryzae BKMF-55, продуцирующего в определенных условиях культивирования 2 фермента кислую протеазу и
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054001/945.gif)
выращивание посевного материала на агаризованной среде состава, соевая мука 1,0-1,2; глюкоза 2,0-2,2; сернокислый натрий 0,05-0,06; хлористый кобальт 0,00010-0,00015; углекислый кальций 0,20-0,25; агар-агар 2,0; водопроводная вода до 100% при температуре (27
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054013/177.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054013/177.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054001/945.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054001/945.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054013/177.gif)
Конидии гриба в количестве 5 мл 1-миллиардной взвеси в физиологическом растворе вносят в колбы со 100 мл ферментационной среды состава, Глюкоза 3,0 Крахмал 3,0 Кукурузный экстракт 1,2
(по сухому
остатку) Соевая мука 2,0 Сернокислый аммоний 0,20 Углекислый кальций 0,25 Водопроводная вода До 100 рН среды до стерилизации 6,7-6,8
Культивирование микроорганизма проводят в глубинных условиях в колбах Эрленмейера емкостью 750 мл на качалке (200 об/мин) в течение 3 сут. Культуральную жидкость (1100 мл) фильтруют через бумажный фильтр и получают 1000 мл нативного раствора с протеолитической активностью 10 ГЕ/мл и амилолитической активностью 8 АЕ/мл. Протеолитическую активность определяют, используя в качестве субстрата 2% -ный раствор гемоглобина (рН 3,0) по модифицированному методу Ансона ("Биохимия" 37, вып. 1, 1972, с. 198-208). Амилолитическую активность определяют, используя в качестве субстрата 1%-ный раствор крахмала (рН 5,0) по ФС 2639-89. Стадия 2. Выделение ферментного препарата. Выделение ферментного препарата из нативного раствора Aspergillus oryzae BKMF-55 осуществляется осаждением 95% -ным этиловым спиртом. Все операции проводят при температуре (5
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054013/177.gif)
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054001/945.gif)
Удельная активность (по кислой протеазе) полученного препарата более чем в 4 раза превышает удельную активность аналога зарубежного препарата "Луизим", имеющего активность 0,48 ГЕ/мг. Удельная амилолитическая активность полученного препарата в 8-9 раз превышает удельную активность препарата "Луизим", имеющего активность 0,17 АЕ/мг, и соответствует амилолитической активности П10Х [1]
П р и м е р 2. Стадия 1. Биосинтез ферментного комплекса. Биосинтез ферментов штаммом Aspergillus oryzae BKMF-55 осуществляют аналогично примеру 1. Компонентный состав агаризованной среды, Соевая мука 1,2 Глюкоза 2,2 Сернокислый натрий 0,06 Хлористый кобальт 0,00015 Углекислый кальций 0,2-0,25 Агар-агар 2,0 Водопроводная вода До 100. Компонентный состав ферментационной среды, Глюкоза 3,2 Крахмал 3,2 Кукурузный экстракт 1,25 Соевая мука 2,2 Сернокислый аммоний 0,25 Углекислый кальций 0,3 Водопроводная вода До 100. Получают 1000 мл нативного раствора с протеолитической активностью 8 АЕ/мл. Стадия 2. Выделение ферментного препарата. Выделение ферментного препарата из нативного раствора осуществляют аналогично примеру 1. Получают 3,2 г препарата с протеолитической активностью 2,2 ГЕ/мг и амилолитической активностью 1,4 АЕ/мг. Выход по кислой протеазе 58,7% по
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054001/945.gif)
Варианты осуществления предлагаемого способа приведены в табл. 1 и 2, 3. Как видно из данных, представленных в табл. 1 и 2, при использовании II, III и IV вариантов агаризованных и жидких ферментационных сред достигается максимальный уровень образования ферментов. Данные, представленные в табл. 3, свидетельствуют о том, что оптимальной температурой культивирования является (27
![способ получения комплекса амилолитических и протеолитических ферментов, патент № 2054479](/images/patents/418/2054013/177.gif)
Класс C12N9/30 грибковое происхождение
Класс C12N9/58 получаемые из грибов