способ выявления вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, предусматривающий выделение вирусной ДНК, конструирование ДНК-зонда, мечение ДНК-зонда биотином, гибридизацию на фильтре ДНК-зонда с вирусной ДНК с последующим выявлением вирусной ДНК по появлению окрашенных пятен, отличающийся тем, что ДНК-зонд конструируют путем клонирования EcoRI-Pst I фрагмента вирусного генома длиной 1400 п.о. в ДНК фага М13 mp 8, а мечение зонда биотином осуществляют путем модификации цитозиновых звеньев.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к генетической инженерии и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных, а именно инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота (КРС) Bovine Herpes Virus 1 (BHV-1).

До настоящего времени основным методом диагностики ИРТ КРС являлась длительная и достаточно трудоемкая процедура изоляции вируса в чувствительной культуре клеток. Более перспективным методом диагностики является гибридизация нуклеиновых кислот, основанная на использовании ДНК-зондов [1]

Известен способ выявления инфекционного ринотрахеита КРС, основанный на использовании ДНК-зонда, при конструировании которого Hind III фрагмент ДНК-вируса клонировали в плазмиду, а мечение осуществляли ник-трансляцией радиоактивным фосфором [2]

Однако этот зонд сконструирован с использованием в качестве вектора двунитевой плазмиды и обладает не очень высокой чувствительностью ( 150 пг вирусной ДНК). Кроме того, радиоактивно меченый зонд нестабилен (период полураспада около двух недель), и проведение анализов с его использованием небезопасно для персонала лабораторий.

Известен также способ выявления инфекционного ринотрахеита КРС, наиболее близкий к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту (прототип) [3]

Способ включает клонирование Hind III фрагмент ДНК в плазмидный вектор pBR 325. Мечение зонда осуществляют ник-трансляцией с био-II-dUTР. Однако полученный таким методом нерадиоактивно меченый двунитевый ДНК-зонд обладает недостаточно высокой чувствительностью 10-100 пг вирусной ДНК.

Целью изобретения является создание способа выявления инфекционного ринотрахеита КРС, позволяющего вести анализ на наличие вируса в пробах от животных с высокой чувствительностью и специфичностью.

Это достигается конструированием рекомбинантного зонда на основе однонитевого фагового вектора М13mp8 путем клонирования Pst I-EcoRI фрагмента вирусного генома длиной 1400 п.о. в фаговую ДНК. В качестве метки используется биотин, который вводится в ДНК-зонд путем химической модификации по цитозиновым звеньям.

Использование однонитевого ДНК-зонда на 1-2 порядка повышает чувствительность выявления вирусной ДНК по сравнению с двунитевым плазмидным зондом и является более перспективным для проведения гибридизационного анализа.

При проведении поиска не обнаружено технических решений, имеющих признаки, сходные с отличительными признаками заявляемого способа, что позволяет сделать вывод о соответствии его критерию изобретения "Существенные отличия".

Основными отличиями заявляемого способа от известного является то, что в качестве вектора используют однонитевую ДНК фага M13mp8, а в качестве метки используют биотин, который вводят в вектор путем химической модификации ДНК по цитозиновым звеньям. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию изобретения "Новизна".

Новые признаки технического решения в общей совокупности признаков обеспечивают достижение цели изобретения, следовательно, можно сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения "Изобретательский уровень".

П р и м е р 1. Выделение ДНК вируса инфекционного ринотрахеита КРС из инфицированной культуры клеток МДВК и из проб от животных.

Клетки осаждают центрифугированием, к супернатанту добавляют 50%-ный ПЭГ до концентрации 6 и 5М NaCl до концентрации 2,8 Смесь оставляют на ночь при 4^оС, затем центрифугируют. Осадок ресуспендируют в ТЕ-буфере, добавляют 1 М трис-HCl рН 8,0 до 0,01 М, 0,1 М ЕДТА до 1 мМ, 5 М NaCl до 0,15 М, SDS до 1% протеиназу К до концентрации 0,1 мг/мл и ведут гидролиз при 37^оС в течение 2 ч. После этого проводят депротеинизацию раствора с помощью фенола и хлороформа и осаждают вирусную ДНК этанолом.

При выделении вирусной ДНК из проб от животных к образцу спермы или носовых истечений добавляют 1 М трис-HCl рН 8,0 до 0,01 М, 0,1 М ЕДТА до 1 мМ, 5 М NaCl до 0,15 М, SDS до 1% протеиназу К до 0,1 мг/мл и ведут гидролиз при 37^оС в течение 2 ч. Далее вирусную ДНК выделяют так же, как из культуры клеток.

П р и м е р 2. Клонирование фрагментов ДНК вируса инфекционного ринотрахеита в плазмиде pUC18.

ДНК, выделенную из вируса, расщепляют рестриктазами EcoRI, Pst I. Этими же рестриктазами расщепляют ДНК плазмиды pUC18.

Гидролизаты ДНК вируса и плазмиды соединяют и проводят сшивку ДНК-лигазой фага Т4. Продуктами сшивки трансформируют E.coli JM 103. Отбор клонов проводят по фенотипу: синий фенотип имеют клоны, содержащие исходную плазмиду pUC18, и белый фенотип клоны, содержащие плазмиду pUC18 со вставкой. Клоны с белым фенотипом, фиксированные на нитроцеллюлозном фильтре, гибридизируют с меченой радиоактивным фосфором ДНК вируса ИРТ КРС. ДНК позитивных клонов анализируют рестрикционным анализом. Клон 34 ЕР содержит вставку 1400 п. н. Для проверки специфичности сконструированного зонда проводят выделение ДНК из нового "урожая" вируса, фиксируют ее на нитроцеллюлозном фильтре и проводят гибридизацию с зондом 34ЕР, меченым радиоактивным фосфором. В качестве контролей используют фиксированные на фильтре ДНК аденовируса, ДНК из тимуса теленка и препарат из неинфицированных клеток МДВК, в которых размножали указанные вирусы. Зонд 34ЕР активно гибридизуется только с ДНК вируса инфекционного ринотрахеита.

П р и м е р 3. Переклонирование зонда 34ЕР в векторную ДНК фага M13mp8.

Плазмиду pUC18, содержащую в виде вставки фрагмент генома вируса 34ЕР, нарабатывают в препаративном количестве и счищают в градиенте плотности CsCl. 30 мкг плазмиды гидролизуют рестриктазами EcoRI и PstI, затем проводят электрофорез в 4,5%-ном полиакриламидном геле. Затем полоску геля с фрагментом вирусного генома размером 1400 п. о. вырезают и фрагмент ДНК извлекают из геля электроэлюцией на бумагу ДЕ-81 "Whatman". После этого фрагмент ДНК вируса смывают с бумаги двумя порциями 1,5 NaCl при 56^оС. После переосаждения этот фрагмент ДНК лигируют с векторной ДНК фага М13mp8, обработанной теми же рестриктазами. После лигирования препаратом ДНК трансформируют клетки E. coli DHSLF" в верхнем 0,8%-ном агаре на питательную среду с красителями и индуктором (Y-gal, IPTG). Для анализа отбирают бляшки с фенотипом gal^- и используют для экспресс-анализа. Для этого в течение ночи выращивают клетки E. coli с отобранной бляшкой при хорошей аэрации. После этого клетки осаждают и к 8 мкл супернатанта добавляют по 2 мкл лизирующей смеси, прогревают 10 мин при 65^оС и наносят на 1%-ный гель агарозы, используя в качестве контроля одноцепочечную ДНК фага M13mp8. Клоны фага, которые имели меньшую подвижность, анализируют дальше. Из осадков клеток выделяют репликативную форму рекомбинантного фага и ДНК гидролизуют рестриктазами EcoRI и Pst I, затем наносят на 4,5% -ный полиакриламидный гель с маркерами длины ( /Hae III) и отбирают клоны, содержащие вставку нужной длины.

П р и м е р 4. Нерадиоактивное мечение ДНК-зонда М13mp-BHV-34EP.

К 30-50 мкг однонитевой ДНК M13mp-BHV-34EP в 50 мкл воды добавляют 50 мкл 1 М аминооксибутиламина и прогревают смесь на кипящей водяной бане в течение 7 мин с последующим охлаждением во льду. Процедуру повторяют еще раз, затем раствор наносят на колонку (1 мл) со смолой Sephadex G-50 и ведут гель-фильтрацию ДНК в воде. К ДНК после гель-фильтрации (объем 150-170 мкл) добавляют 1 М NaHCO₃ до конечной концентрации 0,1 М 30 мкл 0,1 М раствора N-гидроксисукцинимидного эфира -аминокапроил-биотина. Смесь выдерживают при комнатной температуре 1,5 ч, затем отделяют биотинилированную ДНК из избытка "активированного" биотина гель-фильтрацией на Sephadex G-50. Выход меченой ДНК составляет 70-80 Биотинилированная ДНК M13mp-BHV-34EP электрофоретически однородна в 1%-ном агарозном геле.

П р и м е р 5. Гибридизация биотинилированного ДНК-зонда с вирусной ДНК.

Вирусную ДНК, выделенную из инфицированной культуры клеток, наносят точками на капроновые фильтры и ведут гибридизацию с биотинмеченым ДНК-зондом M13mp-BHV-34EP в концентрации 200 нг/мл. Раствор для предгибридизации и гибридизации содержит 6х SSC, 5x Денхардта, 0,5% SDS, 100 мкг/мл денатурированной лососевой ДНК. Гибридизацию ведут 16 ч при 60^оС, фильтры отмывают 2 раза в 2 х SSC, 0,1% SDS и 2 раза в 0,2 х SSC, 0,1% SDS при температуре гибридизации.

П р и м е р 6. Выявление биотинилированного ДНК-зонда на фильтрах после гибридизации.

После гибридизации с биотинилированным ДНК-зондом и отмывки от зонда фильтры обрабатывают блокирующим буфером в течение 1 ч при комнатной температуре (блокирующий буфер: 0,1 М трис-HCl рН 7,5; 0,1 М NaCl; 3 мМ MgCl₂; 0,5% твин-20). После стадии блокирования фильтр помещают на 5 мин в реакционный буфер, затем переносят его на чистый лист лавсана и смачивают разбавленным конъюгатом стрептавидина со щелочной фосфатазой. На фильтр размером 10 х 10 см необходимо 2 мл разбавленного в 2000 раз реакционным буфером конъюгата (реакционный буфер: 0,1 М трис-HCl рН 7,5; 0,1 М NaCl, 3 мМ MgCl₂, 0,05% твин-20).

Фильтр накрывают вторым листом лавсана, убирают пузырьки воздуха между листами и оставляют на 30 мин, затем отмывают от избытка конъюгата 3 раза по 5 мин блокирующим буфером и 1 раз 5 мин АР-буфером (АР-буфер: 0,1 М трис-HCl рН 9,5, 0,1 М NaСl, 5 мМ MgCl₂).

Затем фильтр помещают в раствор красителей для фосфатазы, который готовят непосредственно перед использованием следующим образом: навески 2,5 мг 5-бром-3-индолилфосфата и 5 мг нитротетразолевого синего растворяют каждую отдельно в 50 мкл диметилформамида, растворы переносят в пробирку с 15 мл АР-буфера и перемешивают. Окраска пятен или полос, содержащих биотиновые производные ДНК, развивается в течение нескольких часов в темноте. На один фильтр необходимо около 5 мл раствора красителей в буфере.

Таким образом, сконструирован ДНК-зонд M13mp-BHV-34EP на основе фаговой ДНК M13mp8 путем клонирования EcoRI Pst I фрагмента вирусного генома длиной 1400 п. о. Нерадиоактивно меченый однонитевой ДНК-зонд содержит биотиновые звенья, ковалентно связанные с цитозиновыми основаниями. Степень модификации оснований в ДНК составляет 4%

Проведены исследования по чувствительности и специфичности биотинилированного ДНК-зонда M13mp-BHV-34EP, полученного на основе однонитевой фаговой ДНК, в сравнении с биотинилированным ДНК-зондом, полученным на основе плазмидной ДНК путем мечения ее ник-трансляцией с био-II-dUTP. Оба зонда содержали один и тот же фрагмент вирусного генома. Гибридизацию с зондами вели на ДНК вируса ИТР КРС, выделенной из инфицированной культуры клеток. В качестве контроля аналогичные опыты были проведены на ДНК вируса герпеса 4 типа и ДНК аденовируса КРС 1 типа.

Результаты проведенных опытов представлены в таблице.

Приведенные в таблице данные показывают, что чувствительность выявления вирусной нуклеотидной последовательности с помощью биотинилированного однонитевого фагового зонда М13mp-BHV-34EP составляет 1 пг. Полученный ДНК-зонд специфичен вирусу ИТР КРС, не гибридизуется с другими вирусными ДНК.

Заявленный способ выявления ИРТ КРС был испытан на пробах спермы быков-производителей с Головного племпредприятия Новосибирской области. Было обследовано 128 животных, и у 27 животных получен положительный сигнал после гибридизации с однонитевым биотинилированным ДНК-зондом, что указывает на вероятность присутствия вируса ИРТ КРС в сперме быков. При обследовании этих животных иммунологическим методом реакции нейтрализации были также получены положительные результаты.

Проведены испытания данного способа выявления ИРТ КРС на пробах носовых истечений от больных телят. Он показал высокую степень специфичности при выявлении вируса ИРТ, при этом время анализа составляло около 1 сут. что в 10 раз меньше по сравнению с вирусологическим тестированием, которое длится больше недели.

Данный способ может быть использован в ветеринарной практике для экспресс-диагностики различных форм проявления ИРТ КРС и во время эпизоотий ИРТ КРС как в хозяйствах промышленного типа, так и в системе предприятий Госплемобъединений.

Наиболее эффективно использование биотинилированного ДНК-зонда может быть как при респираторной, при половой формах заболевания, так и в случае выявления ДНК вируса ИРТ КРС при карантинировании вновь завезенных животных, а также для диагностики заболевания на ранних стадиях. Использование зонда эффективно при выявлении ДНК вируса в сперме быков-производителей, изучении причин абортов у коров, диагностике латентной формы ИРТ КРС и изучении степени родства герпес-вирусов КРС.