способ определения диэлектрофоретических скоростей сбора диэлектрически поляризуемых частиц в жидкой суспензии и устройство для его осуществления

Формула изобретения

Способ определения диэлектрофоретических скоростей сбора диэлектрически поляризуемых частиц в жидкой суспензии, предусматривающий индуцирование диэлектрофорезного сбора вблизи электродной структуры взвешенных в жидкости диэлектрически поляризуемых частиц за счет создания в жидкой суспензии пространственно неоднородного переменного электрического поля при возбуждении электродной структуры на заранее определенный промежуток времени переменным напряжением заранее выбранной частоты с последующими прекращением возбуждения электродной структуры и измерением импульса увеличенной концентрации освобожденных в результате этого прекращения возбуждения частиц, отличающийся тем, что обеспечивают протекание жидкой суспензии через электродную структуру, при этом измерение импульса увеличенной концентрации частиц, освобожденных в результате прекращения возбуждения электродной структуры и собранных вблизи последней, осуществляют в месте книзу от электродной структуры.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что процесс индуцирования осуществляют многократно, при этом используют различные частоты подаваемого переменного напряжения во время последовательных периодов возбуждения электродной структуры для получения информации, необходимой для установления общих или критических диапазонов спектра диэлектрофоретических скоростей сбора суспензии.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что обеспечивают сравнение полученной информации, необходимой для установления общих или критических диапазонов спектра диэлектрофоретических скоростей сбора суспензии с соответствующей известной информацией, относящейся к спектрам скорости сбора конкретных идентифицированных частиц, для установления относительной и/или абсолютной концентрации таких идентифицированных частиц, требуемых в исследуемой суспензии для соответствия полученным данным.

4. Устройство для определения диэлектрофоретических скоростей сбора диэлектрически поляризуемых частиц в жидкой суспензии, содержащее камеру для жидкой суспензии, электродную систему, расположенную с возможностью воздействия на эту жидкую суспензию внутри камеры, средство подачи переменного напряжения на электроды электродной системы для создания в жидкой суспензии пространственно неоднородного электрического поля и для диэлектрофорезного сбора вблизи этих электродов взвешенных в жидкой суспензии электрически поляризуемых частиц внутри камеры, отличающееся тем, что оно дополнительно оснащено средством, предназначенным для обеспечения протекания жидкости через камеру, при этом вход и выход камеры расположены так, чтобы жидкость, протекающая через камеру от входа к выходу, проходила электродную структуру.

5. Устройство по п.4, отличающееся тем, что средство, предназначенное для обеспечения протекания жидкости через камеру, представляет собой средство циркуляции жидкости, предназначенное для рециркуляции жидкости от выхода к входу камеры.

6. Устройство по пп.4 и 5, отличающееся тем, что средство для измерения концентрации частиц содержит источник света, предназначенный для проецирования луча света через камеру, размещенный вниз от электродной структуры, и световое детекторное средство, чувствительное к изменению интенсивности светового луча, прошедшего через камеру, обусловленному увеличенной или уменьшенной абсорбцией, или рассеиванию светового луча за счет увеличения или уменьшения концентрации частиц, взвешенных в жидкой суспензии в момент прохождения через последнюю светового луча.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается способа определения диэлектрофоретических скоростей сбора диэлектрически поляризуемых частиц в жидкой суспензии, а также устройства для его осуществления.

Известно, что диэлектрически поляризуемые частицы, взвешенные в какой-либо среде в неоднородном электрическом поле подвержены, даже если они не несут чистого заряда, воздействию диэлектрофоретической соли, стремящейся сдвинуть их (в зависимости от того, больше их поляризуемость поляризуемости среды, или меньше) в направлении увеличения или уменьшения силы электрического поля. Сила F, действию которой подвергается частица объемом V и эффективной поляризуемостью р, определяется уравнением

F p v (E )E, где Е сила электрического поля в месте нахождения частицы, - вектор-оператор. В переменном поле, в котором сила поля в любой точке колеблется, но в котором конфигурация поля остается постоянной, диэлектрофоретическая сила, воздействующая на частицу, имеет одно направление, хотя ее величина циклически варьируется, и результирующее движение частицы также имеет одно направление, так, что она движется, если ее поляризуемость больше, чем поляризуемость окружающей среды, в направлении увеличения силы поля и, обычно, в направлении той или другой системы электродов, между которыми образуется поле. Использование изменяющегося поля дает то преимущество, что оно не подвергает частицу влиянию чистой силы из-за наличия какого-либо чистого электрического заряда на частице, поскольку любая такая сила является в свою очередь изменяющейся, и ее средняя величина за цикл равна 0.

В свое время предлагалось использовать диэлектрофоретический эффект для сбора биологических клеток из какой-либо водной или другой жидкой суспензии, содержащей такие клетки, посредством помещения этой суспензии в контейнер, снабженный системой электродов так, чтобы электроды были погружены в эту суспензию, и последующей подачей напряжения (как правило переменного) на электроды так, чтобы клетки в суспензии (всегда движущиеся в направлении силы поля в месте их непосредственного положения) были вынуждены двигаться в направлении того или другого электрода и собираться на электродах или в непосредственной близости от них.

Известный способ определения диэлектрофоретических скоростей сбора диэлектрически поляризуемых частиц в жидкой суспензии предусматривает индуцирование диэлектрофорезного сбора вблизи электродной структуры взвешенных в жидкости диэлектрически поляризуемых частиц за счет создания в жидкой суспензии пространственно неоднородного переменного электрического поля при возбуждении электродной структуры на заранее определенный промежуток времени переменным напряжением заранее выбранной частоты с последующим прекращением возбуждения электродной структуры и измерением импульса увеличенной концентрации освобожденных в результате этого прекращения возбуждения частиц.

Скорость сбора клеток по вышеописанному известному способу была зафиксирована фотометрически путем пропускания света сквозь межэлектродные пространства и измерения интенсивности луча света после передачи; снижение интенсивности переданного света, вызванное увеличившейся абсорбцией или рассеянием света в процессе сбора клеток, дает величину как общего количества собранных клеток, так и темпа сбора клеток как функции времени. Как правило, скорость сбора первоначально высокая, а затем падает, что вызвано как снижением концентрации остающихся в суспензии клеток, так и эффектом экранирования или поглощения ввиду наличия на электродах уже собранных клеток.

Выяснилось, что скорость сбора клеток является также функцией частоты примененного электрического поля, т.е. поданного на электроды напряжения. Для любого типа клетки (или другой частоты) спектр скоростей сбора, т.е. кривая отношения скорости сбора клеток к частоте примененного электрического поля, может быть установлен в частотном диапазоне поля от, например, 100 Гц до 10 МГц, и выяснилось, что клетки различных типов имеют значительно отличающиеся спектры скоростей сбора.

Тот факт, что клетки различных типов имеют различные спектры скоростей сбора, может позволить идентифицировать неизвестные взвешенные включения в жидкой суспензии с микроорганизмами посредством установления составного или общего спектра скоростей сбора для суспензии в целом с последующим анализом этого спектра с точки зрения известных спектров возможных индивидуальных включений и пропорций, в которых такие индивидуальные спектры могут быть добавочно соединены, чтобы получить составной спектр соответствующий спектру, установленному экспериментально.

Однако с известным устройством, посредством которого может быть установлен такой составной спектр, время и усилия, необходимые для осуществления этой операции, будут неприемлемо велики, так как после каждого определения скорости сбора при одной частоте контейнер с образцом исследуемой суспензии должен быть вымыт и заполнен новым образцом, или же имеющийся образец должен быть восстановлен до своего и первоначального предпроверочного состояния, например, активным размешиванием, что нелегко осуществить, поскольку суспензия преимущественно находится в неподвижном состоянии. Контроль скоростей сбора с помощью светового луча, который проходит только через межэлектродные пространства, едва ли приемлем, поскольку он не дает информации о собранных частицах, которые скрыты "за" электродами.

Задачей изобретения является усовершенствование известных способа и устройства для установления диэлектрофорезных скоростей сбора и спектров скоростей сбора диэлектрически поляризуемых частиц в суспензии и оценки или идентификации таких частиц в суспензии путем сопоставления с известными спектрами скоростей сбора известных типов частиц. Частицы, к которым изобретение может быть применено, включают различные типы живых частиц, таких, как микроорганизмы и клетки, например, кровяные клетки, подклеточные частицы, например, вирусы и плазмиды, и частицы из неживого материала, например, латексные шарики, которые могут быть, а могут не быть покрыты живым материалом; далее для краткости упоминаются просто частицы, однако это понятие необходимо толковать в самом широком смысле.

Предложен способ определения диэлектрофоретических скоростей сбора диэлектрически поляризуемых частиц, отличающийся от вышеописанного известного способа тем, что обеспечивают протекание жидкой суспензии через электродную структуру, при этом измерение импульса увеличенной концентрации частиц, освобожденных в результате прекращения возбуждения электродной структуры и собранных вблизи последней осуществляют в месте к низу от электродной структуры.

Предпочтительно, если процесс индуцирования осуществляют многократно, при этом используют различные частоты подаваемого переменного напряжения во время последовательных периодов возбуждения электродной структуры для обеспечения возможности получения информации, необходимой для установления общих или критических диапазонов спектра диэлектрофоретических скоростей сбора суспензии.

В предпочтительном варианте выполнения способа по изобретению обеспечивают сравнение полученной информации, необходимой для установления общих или критических диапазонов спектра диэлектрофоретических скоростей сбора суспензии с соответствующей известной информацией, относящейся к спектрам скорости сбора конкретных идентифицированных частиц, для установления относительной и/или абсолютной концентрации таких идентифицированных частиц, требуемых в исследуемой суспензии для соответствия полученным данным.

Согласно другому аспекту изобретения, оно предлагает устройство для определения диэлектрофоретических скоростей сбора частиц в жидкой суспензии, содержащее камеру для жидкой суспензии, электродную систему, расположенную с возможностью воздействия на эту жидкую суспензию внутри камеры, средство подачи переменного напряжения на электроды электродной системы для создания в жидкой суспензии пространственного неоднородного электрического поля и для диэлектрофорезного сбора вблизи этих электродов взвешенных в жидкой суспензии электрически поляризуемых частиц внутри камеры, отличающееся тем, что, оно дополнительно оснащено средством, предназначенным для обеспечения протекания жидкости через камеру, при этом вход и выход камеры расположены таким образом, чтобы жидкость, протекающая через камеру от входа к выходу, проходила электродную структуру.

В предпочтительном варианте выполнения средство, предназначенное для обеспечения протекания жидкости через камеру, представляет собой средство циркуляции жидкости, предназначенное для рециркуляции жидкости от выхода к входу камеры.

Еще один предпочтительный вариант выполнения устройства по изобретению предусматривает, что средство для измерения концентрации частиц содержит источник света, предназначенный для проецирования луча света через камеру, размещенный вниз от электродной структуры, и световое детекторное средство, чувствительное к изменению интенсивности светового луча, прошедшего через камеру, обусловленному увеличенной или уменьшенной адсорбцией или рассеиванию светового луча за счет увеличения или уменьшения концентрации частиц, взвешенных в жидкой суспензии в момент прохождения через последнюю светового луча.

На фиг. 1 показано схематическое перспективное изображение камеры, снабженной системой электродов для использования в соответствии с изобретением; на фиг. 2 схематическое изображение устройства согласно изобретению, включающего камеру, изображенную на фиг. 1; на фиг. 3 изображение изменения во времени абсорбции светового луча в устройстве на фиг. 2 во время и после периода сбора микроорганизмов или других частиц при использовании этого устройства; на фиг. 4 изображение спектров скоростей сбора четырех различных микроорганизмов, установленных в ходе предыдущих работ.

Блок камеры, изображенный на фиг. 1 и обозначенный "БК", включает заднюю пластину 1 и переднюю пластину 2, выполненные из стекла и прозрачные, с проложенным между ними листом-разделителем 3. Центральная часть разделителя 3 удалена так, чтобы образовывать между пластинами 1 и 2 тонкую камеру 4. Толщина разделителя 3 может составлять порядка 0,05 мм, однако может варьировать в широком диапазоне, что зависит от размеров взвешенных частиц, с которыми может происходить взаимодействие. Пластина 2 снабжена входом 5 и выходом 6, открытыми к камере 4. Камера 4 может иметь порядка 10 мм в высоту и 40 мм в длину. Задняя пластина 1 имеет сверху электродную структуру в форме металлического слоя, например, из алюминия, нанесенного на нее толщиной, например, 1 мкм, а затем вытравленного, чтобы обеспечить пару взаимопереплетенных электродов 7 и 8, объединенных с связующими терминальными лепестками 9 и 10 соответственно. Каждый электрод может быть образован восемью параллельными пальцами шириной 0,06 мм каждый и отделенными от каждого соседнего пальца другого электрода на 0,06 мм, а центральная часть длины каждого пальца находится внутри камеры 4, чтобы быть в непосредственной близости к находящейся в ней жидкости, хотя может присутствовать защитная пленка из изолирующего материала для недопущения фактического контакта между жидкостями и электродами. Форма электродов такова, чтобы обеспечивать пространственно абсолютно неоднородное электрическое поле в непосредственной близости от них когда на них подается напряжение. Электроды 7 и 8 расположены ближе к входу 5, чем к выходу 6, оставляя между электродами и выходом 6 область 11 в камере 4, через которую луч света (например, длиной волны 450 или 660 нм, или другой длиной волны, более подходящей для конкретного материала), обозначенный стрелкой 12, может подаваться без помехи в виде электродов 7 и 8.

Блок камеры БК, изображенный на фиг. 1, включен в устройство согласно изобретению, изображенное на фиг. 2. Он включает резервуар 13 с жидкой суспензией 14, содержащей частицы, например, микроорганизмы, которые необходимо идентифицировать. Трубка 15, соединенная с входом 5 блока камеры, погружается в жидкую суспензию 14 в резервуаре 13, и выход 6 блока камеры соединен трубкой 16 с насосом 17, который может быть перистальтическим насосом, который прогоняет жидкую суспензию через камеру 4 и возвращает ее в резервуар 13 через возвратную трубку 18, например, в объеме 0,1-1,0 мл в 1 мин. Воздух из воздуховода 19 в виде пузырьков проходит через суспензию 14 в резервуаре и служит как для перемешивания суспензии, так и для ее аэрации. Также внутри резервуара 13 находится рН-измеритель 20 для контроля уровня рН суспензии 14, чтобы позволять поддерживать его в требуемых постоянных рамках, поскольку выяснилось, что скорость сбора микроорганизмов с помощью диэлектрофореза на электродах 7 и 8 зависит от уровня рН суспензии. Предпочтительнее, чтобы все устройство содержалось в условиях требуемой постоянной температуры, поскольку изменения температуры также могут оказывать влияние на темпы сбора.

Устройство также включает сигнальный генератор 21, вырабатывающий переменное напряжение избранной частоты и амплитуды, которая может быть подана с помощью переключателя 22 на осциллоскоп 23, который служит для его контроля и на электроды 7 и 8 блока камеры БК. Для удобства напряжение, подаваемое на электроды, имеет амплитуду, установленную в диапазоне 5-30 В, и частоты в диапазоне от 10 Гц до 10 МГц или более. Также имеются источник света, предпочтительнее источник света ЛЕД 24, запитываемый энергией посредством источника энергии 25 как показано на фиг. 1, предназначенный для проецирования луча света 12 через камеру 4, и фотометр, обозначенный цифрой 26 на фиг. 1, который измеряет интенсивность луча 12 после его прохождения через камеру 4 и обеспечивает входные данные для графопостроителя 27.

При использовании устройства, когда насос 17 постоянно прогоняет поток суспензии 14 сквозь камеру 4 и рециркулирует его в резервуар 13, переключатель 22 замкнут на период, например, 5 с для подачи напряжения с сигнального генератора 21, которое имеет заранее определенную амплитуду и избранную частоту, на электроды 7 и 8 и выработки пространственно неоднородного переменного электрического поля в суспензии вблизи электродов, в результате чего микроорганизмы суспензии движутся под воздействием диэлектрофореза и собираются на электродах или вблизи их. Когда переключатель 22 разомкнут, собранные микроорганизмы освобождаются и уносятся вниз непрерывным потоком жидкой суспензии, чтобы пройти через световой луч 12 в виде локализованного импульса повышенной концентрации микроорганизмов в суспензии.

Результирующая форма выходного сигнала фотометра, записанная графопостроителем 27 и представляющая измеренную интенсивность 1 светового луча 12 как функцию времени t, указана на фиг. 3. В отсутствие подаваемого на электроды 7 и 8 напряжения, впрямую замеренная интенсивность луча I₁ меньше величины I₀, которая будет представлять интенсивность луча перед его прохождением через блок камеры БК. Разница I₀-I₁ представляет потерю интенсивности во время прохождения через блок камеры БК, преимущественно из-за абсорбции и/или рассеяния света микроорганизмами взвешенными в протекающей через камеру 4 жидкости. Когда переменное напряжение подается на электроды 7 и 8 на время t₁, измеряемая интенсивность света резко возрастает до величины I₂, поскольку микроорганизмы начинают собираться на электродах или вблизи них и их концентрация в находящейся внизу жидкости, когда она проходит через световой луч 12, резко снижается. За промежуток до времени t₂, когда поданное напряжение отключается, темп сбора на электродах начинает уменьшаться и измеряемая интенсивность светового луча начинает снижаться, поскольку концентрация микроорганизмов под электродами начинает соответственно возрастать. Снятие подаваемого напряжения в момент t₂ приводит к внезапному освобождению с электродов собранных микроорганизмов, которые переносятся вниз в виде высоко локализованного импульса увеличенной концентрации микроорганизмов в текущей суспензии, вызывая резкое снижение интенсивности луча до незначительной величины I₃при прохождении импульса через луч. Мгновенье спустя, в момент t₃, импульс проходит, и измеряемая интенсивность луча возвращается к своей обычной величине I₁. Увеличение абсорбции, выражаемое разницей интенсивности I₁-I₃ (возможно, на величину 100), представляет собой гораздо более точную меру количества микроорганизмов, собранных за интервал от t₁ до t₂, и, следовательно, первоначальной скорости сбора, чем относительно небольшое увеличение интенсивности от I₁ до I₂, которое является прямым последствием скорости сбора.

После того, как импульс суспензии с увеличенной концентрацией прошел через световой луч 12, он быстро рассеивается во время его перекачивания в резервуар 13, где он далее размешивается с помощью воздуха из воздуховода 14. Последующие подачи переменного напряжения на электроды 7 и 8 с различными частотами, предпочтительнее в автоматическом режиме, под контролем компьютера 28, как это схематически указано на фиг. 2, могут следовать одна за другой в быстрой последовательности для установления информации, которая, будучи заложенной в компьютер, будет определять спектр темпа сбора экзаменуемой жидкости. Таким образом, время необходимое для получения спектра сбора в диапазоне частот от 10 Гц до 1 МГц может быть сокращено с более чем дня, как требуют уже известные способы, до 5 мин или менее. Сравнение определяющей информации полученного таким образом спектра с соответствующей информацией от известных спектров избранных индивидуально микроорганизмов или других относящихся к делу частиц для получения анализа содержания частиц в экзаменуемом образце может быть также осуществлено весьма быстро при использовании соответствующей компьютерной программы так, чтобы анализы образцов могли быть быстро осуществлены с использованием устройства и способа согласно изобретению.

Спектры темпа сбора для четырех микроорганизмов, известные из предыдущей работы (фиг. 4), где кривые соответственно представляют спектры скоростей сбора Staphylococcus aureus, Pseudomonas fluorescens, E.coli и B.cereus.

Вместо того, чтобы использовать эти известные результаты в качестве эталонных спектров, было бы лучше, воспользовавшись данным устройством согласно изобретению, создать библиотеку таких эталонных спектров, полученных с использованием этого устройства с условиями функционирования, установленными в процессе последовательного применения устройства. В целом, однако, устройства требуют лишь незначительной повседневной калибровки, обеспечивая в то же время необычно высокую чувствительность, повышенную селективность для микробов и других типов частиц, а также повышенную скорость и простоту действия в сравнении с известным устройством.

Как было упомянуто выше, электроды 7 и 8 могут выполняться из алюминия и изготавливаться посредством наложения слоя металла на стеклянную пластину с последующим вытравливанием для обеспечения требуемой формы электрода. Вместо алюминия могут применяться платиновые или позолоченные хромовые электроды, изготавливаемые либо с помощью вытравливания, либо с помощью технологии "подъема", при которой на субстрате перед наложением металлического слоя с помощью подходящего материала, например, фотостойкого материала, формируется форма-маска, удалением которой затем удаляются ненужные области отложившегося металла так, чтобы металл оставался только в тех местах, где он отложился непосредственно на субстрат.