антрациклин-гликозидные соединения или их фармацевтически приемлемые соли, способ получения антрациклин-гликозидных соединений или их фармацевтически приемлемых солей

Формула изобретения

1. Антрациклин-гликозидные соединения общей формулы I



где R₁ и R₂ - водород или вместе образуют С₁ - С₄-алкилиденовую группу с прямой или разветвленной цепочкой;

Y - группа общей формулы

где R₃ - водород, низший алкил или С₁ - С₆-алкоксикарбонил;

R₄ и R₅ - водород или С₁ - С₆-алкил с прямой или разветвленной цепью;

n = 0 или число от 1 до 6,

или Y - группа общей формулы



где R₃ - водород, С₁ - С₆-алкоксикарбонил;

m = 1,2,3,

или их фармацевтически приемлемые соли.

2. Способ получения антрациклин-гликозидных соединений общей формулы I



где R₁ и R₂ - водород или вместе образуют С₁ - С₄-алкилиденовую группу с прямой или разветвленной цепочкой;

Y - группа общей формулы

где R₃ - водород, низший алкил или С₁ - С₆-алкоксикарбонил;

n = 0 или число от 1 до 6,

или Y - группа общей формулы

где m = 1,2,3;

R₃ - водород, С₁ - С₆-алкоксикарбонил,

или их фармацевтически приемлемых солей, отличающийся тем, что соединение общей формулы II



где R₁ и R₂ имеют указанные значения;

X - бром, хлор или йод,

подвергают взаимодействию с соединением формулы III

A-OOC-Y,

где Y имеет указанные значения;

A - водород или щелочной металл,

или с его фармацевтически приемлемой солью с получением соединения I, которое при необходимости переводят в соль.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к новым производным антрациклингликозида следующей формулы (I)

(I) где R₁ и R₂ представляют соответственно атом водорода или вместе образуют алкилиденовую группу с прямой или разветвленной цепочкой, содержащей 1-10 атомов углерода;

Y представляет группу

NHR₃ или NR₃ R₃ представляет собой атом водорода, алкильную группу с прямой или разветвленной цепочкой, содержащую 1-10 атомов углерода, алкокси-карбонильную группу с прямой или разветвленной цепочкой, содержащей 1-10 атомов углерода, или 3-6-членную гетероциклическую группу, содержащую атом азота рядом с соседней алкиленовой группой;

R₄ и R₅ представляют собой соответственно атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-5 атомов углерода;

n 0 или представляет собой целое число равное 1-10;

m целое число 1-5; и его фармацевтически приемлемым солям.

К числу антибиотиков антрациклинового ряда относятся полученные из сброженного бульона, содержащего микроорганизмы вида Actinomyces даунорубицин (патент США N 3997662) и доксорубицин (патент США N 3590028).

Антрациклины обладают противоопухолевой активностью широкого спектра действия и используются в качестве химиотерапевтических средств при лечении злокачественных опухолей.

Вышеупомянутые антрациклины имеют следующую структурную формулу (A):

(A) где R представляет собой атом водорода или гидроксильную группу.

Кроме того, известно 2-фторо-замещенное производное антрациклина-А (Японская патентная публикация N Sho 62-145097)

(B) где R представляет собой атом водорода или гидроксильную группу.

Известно получение растворимого производного соединения (В) в виде соединения (С) (Японская патентная публикация N Sho 63-141992).

(C) где R представляет собой группу (СН)_mН (n 0 или n 1-6) или (СН)_n СООН (n0 или n= 1-10). Однако применение известных антрациклинов, таких как даунорубицин, доксорубицин и других, ограничивалось возникновением ряда нежелательных побочных эффектов. Одним из наиболее серьезных побочных эффектов указанных препаратов является их кардиотоксичность, что приводит к необходимости резко ограничивать дозировки и частоту введения, а это, в свою очередь, приводит к уменьшению их общей эффективности в качестве химиотерапевтических средств, используемых при лечении злокачественных опухолей.

Еще одним недостатком указанных соединений является их относительно низкая растворимость в воде, в связи с чем эти соединения трудно вводить в организм в таких количествах, которые были бы эффективными при лечении некоторых форм рака.

Обнаружено, что соединение формулы (I) и его соли проявляют хорошую противоопухолевую активность и отличаются хорошей растворимостью в изотоновой и даже нейтральной воде.

Соединение (I)

(I) где R₁ и R₂ представляют соответственно атом водорода или вместе образуют алкилиденовую группу с прямой или разветвленной цепочкой, содержащей 1-10 атомов углерода;

Y представляет группу

- R₃ представляет собой атом водорода, алкильную группу с прямой или разветвленной цепочкой, содержащую 1-10 атомов углерода, алкокси-карбонильную группу с прямой или разветвленной цепочкой, содержащей 1-10 атомов углерода или 3-6-членную гетероциклическую группу, содержащую атом азота рядом с соседней алкиленовой группой;

R₄ и R₅ представляют собой соответственно атом водорода или алкильную группу, содержащую 1-5 атомов углерода;

n 0 или представляет собой целое число равное 1-10;

m целое число от 1 до 5.

Таким образом, одной из целей изобретения является создание нового производного антрациклина, представленного формулой (I) и его фармацевтически приемлемой соли.

Другая цель изобретения состоит в разработке способа получения производного антрациклина, представленного формулой (I) и его фармацевтически приемлемых солей.

Под упомянутыми фармацевтически приемлемыми солями подразумеваются неорганические соли, такие как галиды, фосфаты, сульфаты, нитраты и т.д. органические соли, такие как ацетаты, метансульфонаты, бензосульфонаты, р толуолсульфонаты и др. Указанное в заголовке соединение формулы (I) и его соли проявляют высокую противоопухолевую активность при введении животным и при этом обладают меньшей токсичностью, чем другие вышеупомянутые производные.

Соединение формулы (I) получают взаимодействием соединения формулы (II) (где гидроксильные группы по позициям 3 и 4 могут быть защищены)

(II) где R₁ и R₂ соответствуют вышеприведенным определениям;

Х представляет собой атом брома, хлора или йода, с соединением формулы (III)

А-OCOY (III) где Y имеет вышеприведенные определения;

А представляет собой атом водорода или щелочной металл.

Защищающие группы по позициям 3 и 4, а также аминозащищающую группу удаляют и затем полученное соединение превращают, в случае необходимости, в фармацевтически приемлемую соль. Соль соединения формулы (I), однако, может быть легко получена в ходе вышеуказанной реакции удаления защищающих групп. Например, при получении соединения формулы (I) или его соли в случае, когда Х представляет собой бром и гидроксильные группы по позициям 3", 4" защищены изопропилиденом, уравнение реакции может быть изображено следующим образом:

где R₁, R₂, R₃, R₄, R₅ и А соответствуют вышеприведенным определениям.

Реакцию между соединением формулы (II) и соединением формулы (III) можно проводить в традиционных растворителях, таких как воды; спирты, например этанол; нитрилы, например ацетонитрил; кетоны, например ацетон или метилэтилкетон; циклические и ароматические амины, например пиридин, пирролидин или пирролин; ароматические углеводороды, например бензол, толуол; эфиры, например диоксан, тетрагидрофуран; галогенированные углеводороды, например хлороформ, дихлорметан; и амиды, например, формамид, диметилформамид, диметилацетамид или их смеси. Реакцию можно осуществлять в пределах от 0^оС до температуры кипения растворителя в течение интервала от 30 мин до 48 ч.

Перед проведением этой реакции необходимо защитить гидроксильные группы, и после ее окончания защита может быть снята. В качестве защищающей может использоваться алкиленовая группа как с прямой, так и разветвленной цепочкой.

Исходное соединение формулы (II) может быть получено из известного соединения (Японская патентная публикация N Sho 62-145097).

Если требуется снять защиту с гидроксильных групп соединения формулы (I), защищаемое соединение обрабатывают кислотой, например муравьиной, уксусной, соляной, серной или фосфорной. Аминозащищающая группа также может быть легко устранена.

В реакции снятия защиты можно использовать не содержащий протонов растворитель, например воду, спирт, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид, диоксан, эфир, хлороформ, тетрагидрофуран, дихлорметан или их смеси.

П р и м е р 1. Получение 7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо-3,4,-0-изопропилиден- -L-галопиранозил)- адриамицинон 14-0-[N-(трет- бутилокси- карбонил (Bec) глицината]

К раствору 14-бромо-7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо-3,4, -0-изопропилиден- -L-талопиранозил) дауномиценона (180 г) в водном растворе ацетона (8:26,33 мл) добавляли N-трет-бутилоксикарбонилглицинат натрия (1,5 г). Смесь перемешивали в течение 20 ч, а затем подвергали дистилляции при пониженном давлении для получения остатка. Остаток экстрагировали хлороформом, промывали водой, насыщая раствором NaCl и высушивали в вакууме. Затем остаток очищали с помощью гельпроникающей хроматографии (в качестве геля использовали оксид кремния, а в качестве элюента раствор, из хлороформа и метанола в соотношении 20:1), получали 121 мг названного в заголовке соединения (59%).

Температура плавления 142-143,5^оС.

ЯМР (CDCl₃, млн, дол. специфический пик): 13,7; 13,1 (ОНх2); 5,53 (дд. 1Н, Н-1", I_H-1"-H-2"= 5,6 Гц, I_H-1"-F 14 Гц; 4,01 (с. 3Н, ОСН₃); 1,55 (с. 3Н, СН₃); 1,32 (с. 3Н, СН₃); 1,30 (д. 3Н, СН₃, I 6,4 Гц); 1,44 (с. 9Н, трет-бутил).

П р и м е р 2. Получение солянокислой соли 7-0-(2,6-дидеокси-2- фторо-L-талопиранозил)-адриамицинон 14-0-глицината.

Соединение, полученное в примере 1, растворяли в 80%-ном растворе уксусной кислоты (10 мл) и перемешивали при температуре 80^оС в течение 3 ч. Растворитель удаляли дистилляцией при пониженном давлении для получения остатка. Остаток подвергали колонковой хроматографии, используя гель оксида кремния (раствор элюента:хлороформ:метанол 5:1) для получения 7-0-(2,6- дидеокси-2-фторо- -L-талопиранозил)-адриамицинон 14-0-глицината. Это соединение растворяли в небольшом количестве дихлорметана. Насыщенный раствор HCl и эфира по каплям добавляли к полученному раствору, получив твердое вещество красного цвета. Полученное твердое вещество красного цвета промывали эфиром, центрифугировали и высушивали, получали названное в заголовке соединение в виде соли соляной кислоты (48 мг, 56%).

Температура плавления 179-185^оС.

ЯМР (CDCl₃, млн. дол. специфический пик): 14, 0, 13,2 (с. каждый 1Н, ОНх2); 8,3 (шир. с. 3Н. -NH₃Cl); 7,9 (м. 2Н, ароматический протон); 7,6 (м. 1Н, ароматический протон); 4,0 (м. 5Н, ОСН₃, СО-СН₂-N); 1,2 (д. 3Н, СН₃, I 6,1 Гц).

П р и м е р 3. Получение солянокислой соли 14-0-глицината 7-0-(2,6-дидеокси-2-фтор- -L-талопиранозил)-адриамицинона.

Соединение (120 мг), полученное в примере 1, растворяли в хлороформе (1,5 мл) и добавляли метанол (15 мл). Добавляли насыщенный HCl и эфиром раствор (12 мл) и смесь перемешивали в течение 4 ч. После завершения реакции отделяли дистилляцией значительную часть растворителя для получения остатка. К остатку добавляли эфир и получали твердое вещество. Это твердое вещество отфильтровывали и высушивали, получали названное в заголовке соединение (84 мг, 80%).

П р и м е р 4. Получение 7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо-3,4-0-изопропилиден- -L-талопиранозил)- адриамицинон 14-0 [N-(трет-бутило- ксикарбонил (Вос)- -аланината]

Осуществляли взаимодействие 14-бромо-7-0(2,6-дидеокси-2-фторо-3,4-изопропи- лиден- -L-талопиранозил) дауномицинона (200 мг) с N-(трет-бутилоксикарбонил)- -аланинатом натрия (634 мг) по способу, аналогичному описанному в примере 1, получали названное в заголовке соединение (144 мг, 62%) в виде твердого вещества красного цвета. В качестве элюента при проведении гельпроникающей хроматографии с гелем из оксида кремния использовали смесь таких растворителей, как бензол и ацетон (4:1).

Температура плавления 138-140,5^оС.

ЯМР (CDCl₃, млн, дол. специфический пик): 13,8; 13,2 (с. каждый 1Н, ОНх2); 5,5 (д.д. 1Н, Н-1, I_H-1"-H-2" 5,6 Гц, I_H-1"-F 13,8 Гц); 4,1 (с. 3Н, ОСН₃); 1,5, 1,4 (с. каждый 3Н, СН₃х2); 1,3 (д. 3Н, СН₃, I 6,4 Гц); 1,4 (с. 9Н, трет-бутил).

П р и м е р 5. Получение солянокислой соли 7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо- -L-талопиранозил)-адриамицинона 14-0- -аланината.

Соединение (140 мг), полученное в примере 4, обрабатывали по способу, аналогичному описанному в примере 3, получали указанное в заголовке соединение (92 мг, 76%).

Температура плавления 195-200^оС.

ЯМР (DMCOd, млн, дол. специфический пик); 14,0, 13,2 (с. каждый 1Н, ОНх2); 7,9 (м. 5Н, -NH₃Cl, 2Н, ароматический протон); 7,6 (м. 1Н, 1Н, ароматический протон); 3,9 (с. 3Н, ОСН₃); 1,1 (д. 3Н, СН₃, I 6,5 Гц).

П р и м е р 6. Получение 7-0-(2,6-дидеокси-3,4-0-изопропилиден--L-талопиранозил)-ад- риамицинон 14-0-[6-(трет.-бутилоксикарбонит (Вос))-аминогексаноата]

Осуществляли взаимодействие 14-бромо-7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо-3,4-0-изопро- пилиден- -L-талопиранозил) дауномиценона (220 мг) с 6-(трет-бутил-оксикарбониламино) гексаноатом натрия (900 мг) по способу, аналогичному описанному в примере 1, получали названное в заголовке соединение (158 мг, 64% ) в виде твердого вещества красного цвета. В качестве элюента при гельпроникающей хроматографии с оксидом кремния использовали смесь таких растворителей, как бензол и ацетон (4:1).

Температура плавления 130-132^оС.

ЯМР (CDCl₃, млн. дол. специфический пик): 13,8, 13,2 (с. каждый 1Н, ОНх2); 4,5 (д. д. Н-1", I_H-1"-H-2" 5,5 Гц, I_H-1"-F 13,8 Гц); 4,0 (с. 3Н, ОСН₃); 1,5 (с. 9Н, t-бутил); 1,6, 1,5 (с. каждый 3Н, СН₃х2); 1,3 (д. 3Н, СН₃, I" 6,4 Гц).

П р и м е р 7. Получение солянокислой соли 7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо- -L-талопиранозил)-адриамицинон 14-0-(6-аминогексаноата).

Соединение (150 мг), полученное в примере 6, обрабатывали по способу, аналогичному описанному в примере 3, получали названное соединение (95 мг, 72%).

Температура плавления 188-192^оС.

ЯМР (DMCOd₆, млн. дол. специфический пик); 14,0, 13,2 (с. каждый 1Н, ОНх2); 7,8 (м. 3Н, ароматический протон и амино); 7,6 (м, 3Н, ароматический протон и амино); 3,9 (с. 3Н, ОСН₃); 1,3 (с. 6Н, -СН₂-СН₂-СН₂-); 1,2 (д. 3Н, СН₃, I" 6,4 Гц).

П р и м е р 8. Получение 7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо-3,4-0-изопропилиден- -L-талопиранозил)-адринамицинон 14-0-[N-(трет-бутило- ксикарбонил)-L-аланината]

Осуществляли взаимодействие 14-бромо-7-0-(2,6-дилеокси-2-фторо-3,4-0-изопро- пилиден-L-талопиранозил) дауномиценона (200 мг) с (трет-бутилоксикарбонил)-L-аланинатом натрия (650 мг) по способу из примера 1, получали названное соединение (137 мг, 59%) в виде твердого вещества красного цвета. При гельпроникающей хроматографии с оксидом кремния в качестве элюента использовали смесь таких растворителей, как бензол и ацетон (4:1).

Температура плавления 148,5-151,0^оС.

ЯМР (CDCl₃, млн. дол. специфический пик): 13,8, 13,2 (с. каждый 1Н, ОНх2); 5,5 (д.д. 1Н, Н-1", I_H-1"-H-2" 5,6 Гц); I_H-1"-F 13,8 Гц); 4,1 (с. 3Н, ОСН₃); 1,5, 1,4 (с. каждый 3Н, СНх2); 1,3 (д. 3Н, СН₃I" 6,5 Гц); 1,5 (д. 3Н, СН₃, I 7,1 Гц); 1,4 (с. 9Н, трет-бутил).

П р и м е р 9. Получение солянокислой соли 7-0-(2,6-дидеокси-2- фторо- -L-талопиранозил)-адриамицинон 14-0-L-аланината.

Соединение (130 мг), полученное в примере 8, обрабатывали по способу из примера 3, получали названное соединение (90 мг, 80%).

Температура плавления 177-184^оС.

ЯМР (ДМСОd₆, млн. дол. специфический пик); 14,0, 23,2 (с. каждый 1Н, ОНх2); 8,5 (шир. с. 3Н, -NH₃Cl); 7.9 (м. 2Н, ароматический протон); 7,6 (м. 1Н, ароматический протон); 3,9 (с. 3Н, ОСН₃); 1,5 (д. 3Н, СН₃, I 7,1 Гц); 1,3 (3Н, СН₃, I" 6,5 Гц);

П р и м е р 10. Получение 7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо-3,4-0-изопропилиден-L-тало- пиранозил)- адриамицинон 14-0[N(трет-бутилоксикарбонил)-L-валината]

Осуществляли взаимодействие 14-бромо-7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо-3,4-0-изопро- пилиден- -L-талопиранозил)дауномиценона (200 мг) с (трет-бутилоксикарбонил)-L-валинатом (700 мг) по способу, аналогичному описанному в примере 1, получали названное соединение (145 мг, 60%) в виде твердого вещества красного цвета. В качестве элюента при гельпроникающей хроматографии с оксидом кремния использовали смесь таких растворителей, как бензол и ацетон (4:1).

Температура плавления 137-139^оС.

ЯМР (CDCl, млн. дол. специфический пик): 13,9, 13,2 (с. каждый 1Н, ОНх2); 5,5 (д.д. 1Н, Н-1", I_H-1"-H-2" 5,5 Гц, I_H-1"-F 13,8 Гц); 4,0 (с. 3Н, ОСН₃); 1,4 (с. 9Н, трет-бутил); 1,3 (д. 3Н, СН₃, I" 6,4 Гц); 1,0 (д. д. 6Н, -CH(CH₃).

П р и м е р 11. Получение солянокислой соли 7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо- -L-талопиранозил)-адриамицинон 14-0-L-валината.

Соединение (140 мг), полученное в примере 10, обрабатывали по способу из примера 3, получали названное соединение (90 мг, 74%) в виде твердого вещества красного цвета.

Температура плавления 164-168^оС.

ЯМР (DMCO-d₆, млн. дол. специфический пик): 14,0, 13,2 (с. каждый 1Н, ОНх2); 8,4 (шир. с. 3Н, NH₃Cl); 7,9 (м. 2Н, ароматический протон); 7,6 (м. 1Н, ароматический протон); 4,0 (с. 3Н, ОСН₃); 1,2 (д. 3Н, СН₃, I" 6,5 Гц); 1,0 (д.д. 6Н, -CH(CH₃).

П р и м е р 12. Получение 7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо-3,4-0-изопропилиден- -L-талопиранозил)-адриамицинон 14-0-[N-(трет-бутило- ксикарбонил)-L-пролината]

14-Бромо-7-0-(2,6-дидеокси-2-фторо-3,4-0-изопропилиден- -L-талопиранозил) дауномицинон (200 мг) и N(трет-бутилокси-карбонил)-L-пролинат (900 мг) обрабатывали по способу из примера 1, получали названное соединение (150 мг, 62% ) в виде твердого вещества красного цвета. При гельпоглощающей хроматографии с оксидом кремния использовали смесь таких растворителей, как бензол и ацетон (4:1).

Температура плавления 145,5-148,5^оС.

ЯМР (CDCl₃, млн. дол. специфический пик): 13,8, 13,2 (с. каждый 1Н, ОНх2); 5,5 (д. д. 1Н. Н-1", I_H-1"-H-2" 5,5 Гц, I_H-1"-F 13,8 Гц); 4,0 (с. 3Н, ОСН₃); 1,4 (с. 9Н, трет-бутил).

П р и м е р 13. Получение солянокислой соли 7-0-(2,6-дидеокси-2- фторо- -L-талопиранозил)-адриамицинон 14,0-L-пролината.

Соединение (140 мг), полученное в примере 12, обрабатывали по способу, аналогичному описанному в примере 9, получали названное соединение (94 мг, 77%) в виде твердого вещества красного цвета.

Температура плавления 180-185^оС.

ЯМР (DMCO-d₆, млн. дол. специфический пик): 14,0, 13,1 (с. каждый 1Н, ОНх2); 10,2, 9,1 (2 шир.с. каждый 1Н, -NH₃Cl); 7,9 (м. 2Н, ароматический протон); 7,6 (м. 1Н, ароматический протон); 3,9 (с. 3Н, ОСН₃); 1,2 (д. 3Н, СН₃, I" 6,3 Гц).

Биологическая активность.

Эксперимент 1. Противоопухолевую активность предлагаемых соединений изучали на мышах CDF, пораженных мышиным лейкозом L1210. Здоровые самки мышей CDF были заражены путем внутрибрюшного введения лейкозных клеток L1210 в количестве 1х10⁵ на одно животное. Зараженных мышей подвергали воздействию испытываемых соединений в различных дозировках, которые вводились в брюшную полость на первый, пятый и девятый день после введения лейкозных клеток (первую инъекцию делали спустя 24 ч после введения лейкозных клеток). Для сравнения вводили также доксорубицин гидрохлорид. Все испытываемые соединения и доксорубицин гидрохлорид растворяли в отфильтрованной (0,22 мкм) дистиллированной воде. Состояние животных регистрировали через 60 дн после заражения лейкозными клетками и сравнивали выживаемость этих животных с показателями для животных из контрольной группы, которые были заражены теми же опухолевыми клетками, но получили терапию в виде введения отфильтрованного физиологического раствора. Результаты показаны в табл.1, где значения T/C (в) определяли как частное от деления среднего времени выживания мышей, получавших испытываемые соединения, на время выживания мышей из контрольной группы, которое затем умножали на 100. Время выживания мышей после введения опухолевых клеток было установлено в 60 дн. Увеличение значения T/C (в) указывает на рост противоопухолевой активности соединения.

Предлагаемые соединения оказались менее токсичными, чем доксорубицин гидрохлорид, который при дозировке 16 мг/кг продемонстрировал значительное уменьшение T/C по сравнению с T/C при дозировке 8 мг/кг. Предлагаемые соединения такой токсичности не имели. Как показано в табл.1, большинство предлагаемых соединений продемонстрировали большую противоопухолевую активность по сравнению с доксорубицин гидрохлоридом. Более того, соединением из примера 3 при дозах 32 мг/кг, 16 мг/кг и 8 мг/кг излечивали мышей с особо сильным развитием опухоли.

Эксперимент 2. В лабораторных условиях ингибирующую активность предлагаемых соединений в отношении клеток мышиного лейкоза L1210 определяли посредством слегка модифицированного анализа с использованием тетразолия (Cancer Research, февраль 1987, т.47, с.936-942).

Клетки мышиного лейкоза L1210 в экспоненциальной фазе помещали в 96-ячеечные чашки для микротитрования, при этом плотность составила 1х10⁵ клеток на ячейку. В качестве среды для выращивания культуры клеток использовали материал RPMI 1640 (Roswell Rark Memorial Institutes, 1640), дополненный 10% -ной термоактивированной сывороткой коровьего эмбриона (FBS), 2 ммоль L-глюкатилина, пенициллином G с натрием (100 единиц на 1 мл питательной среды) и стрептомицин сульфатом (1 мг на 1 мл питательной среды).

Затем добавляли предлагаемые антрациклиновые соединения и дексорубицин гидрохлорид для увеличения конечных концентраций с 1 нг/мл до 300 нг/мл. Контрольные образцы не содержали лекарственного препарата.

Клетки инкубировали в течение 72 ч при температуре 37^оС в атмосфере, состоящей из СО (10%) и воздуха (90%). К концу этого периода в каждую ячейку добавляли 50 мкл раствора МТТ (3-(4,5- диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромида) (2 мг на 1 мл в соляном растворе с фосфатным буфером) и клеточные культуры инкубировали при температуре 37^оС в течение 4 ч в инкубаторе с СО₂, МТТ восстанавливается до водонерастворимого МТТ формазана (1-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-3,5-дифенилфор- мазана)митохондриальной суццинатдегидрогеназой только в живых клетках. К концу инкубирования удалили 200 мкл плавающего сверху слоя и растворили кристалл МТТ формазана, добавив 200 мкл диметилсульфоксида и перемешав в смесь.

Сразу же после этого чашки исследовали с помощью сканирующего многоячеечного спектрофотометра с разрешенным 540 нм (иммуносорбентный анализатор энзимного типа фирмы Biotech Instruments Inc. Берлингтор, шт. Вермонт).

Значения поглощения (абсорбции) скорректированы по несвязанным контрольным величинам.

Величины поглощения являются прямо пропорциональными числу живых клеток. Величину 1 IC 50 определяли как соответствующую 50%-ному уменьшению поглощения по сравнению с необработанными контрольными образцами и рассчитывали по кривой зависимости ответной реакции от дозы. Полученные значения приведены в табл.2.

Как видно из табл.2, все испытывающиеся соединения, за исключением примера 7, оказались более цитотоксичными по отношению к клеткам мышиного лейкоза L1210, чем доксорубицин гидрохлорид.