средство, обладающее противошоковой активностью

Формула изобретения

СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОШОКОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, отличающееся тем, что оно представляет собой гидрохлорид 2-этил-6-метил-3-оксипиридина (эмоксипин).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и может быть использовано при лечении шока различной этиологии.

В настоящее время известен ряд соединений, препятствующих развитию эндотоксинового шока. Однако ни одно из них не обладает высоким лечебным эффектом на фоне развившегося шока.

Сложность патогенетической картины эндотоксинового шока, возникающего в результате внедрения в организм патогенной микрофлоры или продуктов ее жизнедеятельности самой различной природы, а также быстрота развития и многообразие клинических проявлений рассматриваются как главные препятствия на пути создания фармакологических средств с эффективными лечебными свойствами.

В последние годы большие надежды возлагаются на блокаторы синтеза простагландинов, прежде всего циклооксигеназы (ацетилсалициловая кислота, индометацин) и тромбоксан-синтетазы (имидазол, ибупрофен).

Работами Halushka et al. показано, что введение ацетилсалициловой кислоты за 30 мин до индукции эндотоксинового шока сублетальными дозами Salmonella enteritidis увеличивает выживаемость животных до 70%

Применение в те же сроки ибупрофена и имидазола увеличивает выживаемость до 80% [1]

В более поздние сроки ни аспирин, ни другие ингибиторы синтеза простагландинов не тормозят развития эндотоксинового шока и не оказывают существенного влияния на процент гибели животных, что, вероятно, связано не только с быстрым развертыванием клинической картины шока, но и включением в патогенетическую цепь механизмов, независимых от продуктов циклооксигеназного каскада.

В настоящее время остается актуальной и проблема лечения острых отравлений, сопровождающихся возникновением экзотоксического шока.

Острые отравления химическими веществами, по данным разных авторов, составляют от 40 до 85% всех случаев отравлений. К химическим веществам, наиболее часто вызывающим отравления, относятся, например, сильнодействующие кислоты, щелочи, лекарственные препараты, средства бытовой химии. Терапия при шоке носит симптоматический характер.

В настоящее время при шоке проводят комплекс лечебных мероприятий, включающий применение: глюкокортикоидов для лечения сердечно-сосудистых нарушений, например, преднизолона, дексаметазона; наркотических анальгетиков для обезболивания; буферных растворов для коррекции водно-электролитного баланса; кровезаменителей для воспаления циркулирующей крови, а также гемодиализ, метод форсированного диуреза, перитонеальный диализ.

На данный момент в медицинской практике не существует противошоковых препаратов.

Цель изобретения противошоковое средство.

Цель достигается применением известного лекарственного вещества гидрохлорида 2-этил-6-метил-3-оксипирида (международное название эмоксипин) формулы I:

HCl (I) по новому назначению, а именно в качестве противошокового средства.

В настоящее время эмоксипин находит применение в глазной практике, например для лечения ожогов сетчатой оболочки глаза.

Механизм известного терапевтического действия эмоксипина связывают с подавлением агрегации тромбоцитов в результате блокады в них активности фосфодиэстеразы циклического 3,5-АМФ. Наши исследования впервые показали, что эмоксипин способен тормозить также и развитие эндотоксинового и токсического шока. В основе противошокового действия препарата лежат совершенно иные механизмы: ингибиция агрегации нейтрофилов и подавление в них биосинтеза липоксигеназных продуктов арахидонового каскада, в частности, лейкотриенов ЛТВ₄, являющихся мощными индукторами септического процесса.

В связи с тем, что в медицинской практике отсутствуют средства для патогенетической терапии шока, сравнение заявляемого препарата проводят с преднизолоном, дексаметазоном, препаратами, используемыми при симптоматической терапии шока.

Нижеследующие примеры иллюстрируют противошоковое действие эмоксипина.

П р и м е р 1. Противошоковая активность эмоксипина на модели эндотоксинового шока. Опыты ставились на двух видах животных: мышах (массой 20-24 г) и кроликах (массой 2,5-3,0 кг), содержащихся в виварии на обычном рационе питания.

Модель эндотоксинового шока создавалась по методу (I) внутривенным введением сублетальных доз липополисахарида В (ЛПС) Salmonella typhimurium L-3629 "Sigma" (США), вызывавших 90% гибель животных в течение 24 ч. Мыши получали ЛПС в дозе 30 мг/кг, кролики 7,5 мг/кг. ЛПС растворяли в физиологическом растворе хлористого натрия, рН среды доводилось до 7,5.

Стерильный раствор эмоксипина вводили внутривенно: мышам в дозах 50 и 100 мг/кг (в хвостовую вену), кроликам в дозах 20 и 50 мг/кг (в ушную вену) в объемах соответственно 0,1 мл и 1,0 мл через 1 ч после введения токсина.

Контрольные животные получали адекватные дозы аспирина, солюбилизированного в растворе ТВИН-80 (или ТВИН-80 с физиологическим раствором хлористого натрия), ибупрофен ("Upjohn Company", США; 5 и 20 мг/кг) или дексаметазон (0,5 и 5,0 мг/кг).

Противошоковая активность препаратов оценивалась по проценту выживаемости животных через 24 ч после начала эксперимента, а также визуально (по изменению поведения животных) и данным гистологического исследования. В опытах на кроликах проводилась непрерывная регистрация показателей центральной и периферической гемодинамики на протяжении 5 ч от начала эксперимента при помощи специальных датчиков, соединенных с мингографом-34 ("Siemens"). Данные экспериментов обрабатывались статистически. Первые клинические признаки эндотоксинового шока развивались у животных к концу 1 ч после введения эндотоксина.

Субъективно это проявлялось резким торможением двигательной активности (в отдельных случаях судорожными подергиваниями), одышкой, обильной дефекацией в виде жидкого стула, потерей аппетита.

Объективно у кроликов регистрировалось падение артериального давления более, чем на 20% урежение ритма сердечных сокращений в среднем на 15%

Падеж животных начинался с 3-5 ч. В этот период в контрольной группе погибло 24% мышей и 30% кроликов (табл. 1 и 2).

Через 12 ч летальность мышей достигала 47% а к концу эксперимента (через 24 ч) 92% В группе кроликов летальность в те же сроки составила соответственно 50 и 90%

При вскрытии животных выявлялись полнокровие паренхиматозных органов, вздутие легких, множественные кровоизлияния во внутренних органах.

При введении эмоксипина через 1 ч после развития шока в дозе 50 мг/кг падеж мышей к 5 часу не превышал 12% а к исходу суток 30% (табл. 1). В более высокой дозе (100 мг/кг) эмоксипин оказался гораздо менее эффективным.

Противошоковая активность аспирина в дозах 50 и 100 мг/кг не превышала 30% а ибупрофена в дозах 5 и 20 мг/кг 35% в обеих группах мышей, леченых дексаметазоном (0,5 и 5 мг/кг), выживаемость через 24 ч составила 29,4% (табл. 1).

В опытах на кроликах оптимальный терапевтический эффект эмоксипина наблюдался в дозе 20 мг/кг (табл. 2). Артериальное давление при этом начинало стабилизироваться уже через час после введения препарата и к 4 ч приближалось практически к норме (рис.).

Падеж кроликов, получавших эмоксипин и аспирин в дозе 20 мг/кг, составлял в первые 5-8 ч после развития шока 20% а через 24 ч не превышал 33% для группы животных, получавших эмоксипин, а для группы животных, получавших аспирин и ибупрофен, гибель животных составляла 80% (табл. 2).

Эффективность эмоксипина и аспирина в дозе 50 мг/кг, а также ибупрофена (5 и 20 мг/кг) через 24 ч оказалась незначительной (табл. 2).

П р и м е р 2. Противошоковая активность эмоксипина на модели экзотоксического шока, вызванного внутрижелудочным введением уксусной кислоты. Опыты проводились на 150 беспородных белых крысах-самцах массой 180-240 г. Эндотоксический шок вызывали по известной методике путем перорального введения 40% уксусной кислоты (0,4 мл на 100 г массы животного) под гексеналовым наркозом. Эмоксипин вводили однократно внутрибрюшинно в объеме 1 мл в дозах 10, 15, 20, 40, 60 и 100 мг/кг за 1 ч до и через 1 ч после введения уксусной кислоты. Контрольные животные получали преднизолон в дозе 5 мг/кг.

Результаты исследований представлены в табл. 3. Гибель животных наблюдалась через 24 ч от начала эксперимента. Максимальный противошоковый эффект эмоксипина наблюдался в дозе 40 мг/кг независимо от времени введения препарата.

Так, через 28 ч от начала эксперимента погибло лишь 10% За этот же период в группе животных, получавших преднизолон (максимально эффективная доза 5 мг/кг), погибло 60-70% животных. Через 36 ч от начала эксперимента в группе животных, получавших максимально эффективную дозу эмоксипина (40 мг/кг), погибло 40% животных, а преднизолона (5 мг/кг) 100% животных.

Из табл. 3 видно также, что увеличение дозы эмоксипина до 60-100 мг/кг не приводит к повышению противошокового эффекта.

П р и м е р 3. Противошоковая активность эмоксипина на модели экзотоксического шока, вызванного внутрижелудочным введением дихлорэтана. Опыты ставились на 150 беспородных белых крысах-самцах массой 180-240 г. Экзотоксический шок вызывали путем внутрижелудочного введения дихлорэтана в объеме 0,1 мл на 100 г массы животного (методика разработана авторами). Эмоксипин и преднизолон вводили так же, как в примере 2.

Результаты исследований представлены в табл. 4.

Максимально эффективная доза эмоксипина в этом случае составляла 20 мг/кг. Так, при введении эмоксипина в этой дозе через 24 ч от начала эксперимента гибель животных сокращалось более чем в 3 раза (погибло 20% животных) по сравнению с группой животных, получавших максимально эффективную дозу преднизолона (погибло 60 и 70% животных) в зависимости от времени введения преднизолона). Через 24 ч от начала эксперимента в группе животных, получавших преднизолон, погибло 100% а в группе животных, получавших эмоксипин, 50-80% Увеличение дозы эмоксипина до 100 мг/кг не приводило к увеличению противошокового эффекта.

Причиной летальных исходов при шоках различной этиологии является развитие синдрома дыхательной недостаточности, или так называемого "шокового легкого". Формирование этого симптомокомплекса обусловлено агрегацией нейтрофилов в микрососудах малого круга кровообращения, эмболизацией последних клеточными агрегатами и разрушением легочной паренхимы лизосомальными ферментами нейтрофилов и реактивными формами О₂. Примеры 4-6 иллюстрируют способность эмоксипина ингибировать агрегацию нейтрофилов, индуцированную in vitro веществами с различным механизмом действия.

П р и м е р 4. Подавление эмоксипином агрегации нейтрофилов, индуцированной липополисахаридом В Salmonella typhimurium. Периферические нейтрофилы выделяли согласно способу, модифицированному авторами. В ходе выделения использовался буфер ТСМ (II) без кальция и магния. Донорами служили самцы кроликов породы серая шиншилла (масса 3,0-3,5 кг). Кровь (40-60 мл) забирали из краевой вены уха в 1/10 объема 3,8%-ного раствора цитрата натрия. Тромбоциты отделяли центрифугированием, для удаления эритроцитов использовались седиментация в растворе декстрана и гипотонический лизис. Полученную суспензию лейкоцитов фракционировали центрифугированием в градиенте плотности (60% перколл, "Рharmacia", Швеция). Клетки, прошедшие сквозь градиент, дважды отмывали, а затем ресуспендировали, доводя плотность суспензии до 1,1110⁷ клеток/мл. 98% клеток составляли гетерофилы (подсчет проводили в мазках, окрашенных по Романовскому). Жизнеспособность клеток составляла в среднем 97% (судя по исключению трипановой сини). Базофилы и мононуклеары отсутствовали, контаминация тромбоцитами не превышала 1/100. При работе с клетками использовалась либо полипропиленовая, либо силиконированная стеклянная посуда. Процедура выделения велась при 4^оС.

Агрегация нейтрофилов регистрировалась турбидиметрически с помощью стандартного агрегометра фирмы "Chronolog Corporation" (модель 330, США), снабженного самописцем (чувствительность 10 мВ, скорость ленты 25,3 мм/мин). В силиконированную кювету с покрытой тефлоном магнитной мешалкой помещали 0,45 мл суспензии нейтрофилов, затем добавляли по 5 мкл концентрированных растворов хлористого кальция и хлористого магния, 20 мкл раствора эмоксипина в 0,15 М растворе хлористого натрия (или 20 мкл 0,15 М раствора хлористого натрия) и прогревали в ячейке прибора в течение 2 мин при 37^оС, после чего включали самописец и вносили в кювету 20 мкл солюбилизированного липополисахарида В (ЛПС; конечн. конц. 200 мкг/мл). При таком соотношении объемов конечная плотность суспензии составляла 10⁷ клеток/мл, содержание кальция и магния соответственно 1,3 и 1,0 мМ, а конечная концентрация эмоксипина 3, 5 или 10 мМ. Для установки максимума светопропускания пользовались разведенной вдвое суспензией нейтрофилов. Ни ЛПС, ни эмоксипин в использовавшихся концентрациях не обнаруживали токсического эффекта при получасовой инкубации (исключение трипановой сини).

Каждый опыт начинали с проверки клеток на способность к спонтанной агрегации. Спонтанно агрегирующие клетки признавали непригодными для эксперимента. После начала агрегации запись вели в течение 5 мин. Количественную оценку агрегационного ответа давали по следующим параметрам:

1) лаг-периоду L-промежутку времени между внесением индуктора в кювету и началом агрегации, с;

2) максимуму светопропускания В_м (в процентах по отношению к светопропусканию разведенной вдвое суспензии);

3) начальной скорости агрегации v, определявшейся по величине тангенса угла наклона касательной, проведенной к кривой через начальную точку, мм/мин.

Оценка значимости полученных результатов проводилась с помощью t-критерия Стьюдента.

Преинкубация с эмоксипином вызывала дозозависимое угнетение агрегации. Как видно из табл. 5, эмоксипин в концентрации 3-5 мМ увеличивал лаг-период в среднем в 1,9 раза (р < 0,01). Преинкубация с 10 мМ эмоксипина приводила к удлинению лага примерно в 3 раза (р < 0,001).

Если принять за 100% максимальное увеличение светопропускания, вызываемое 200 мкг/мл ЛПС, преинкубация с эмоксипином в концентрации 3 мМ вызывала уменьшение этого параметра на 42% (р < 0,001), 5 мМ на 55% (р < 0,001), 10 мМ на 76% (р < 0,001).

Скорость агрегации нейтрофилов при инкубации с 3 мМ эмоксипина снижалась вдвое (р < 0,001). Увеличение концентрации эмоксипина до 5 и 10 мМ приводило к уменьшению скорости агрегации соответственно в 3 (р < 0,001) и 4 (р < 0,001) раза.

П р и м е р 5. Подавление эмоксипином арахидонат-индуцированной агрегации нейтрофилов. Нейтрофилы выделяли из стабилизированной цитратом натрия венозной крови нормальных доноров, не принимавших в течение предшествующих 7-10 дней лекарственных препаратов. Нейтрофилы составляли около 95% выделенных клеток, жизнеспособность во всех случаях превышала 95% Контаминирующие тромбоциты встречались не чаще 1/100. Опыт ставили так же, как описано в примере 4, с небольшими изменениями (плотность суспензии доводили до 1,0910⁷ клеток/мл, в кювету вносили 0,46 мл суспензии, раствор эмоксипина добавляли в объеме 25 мкл). Индуктором служила арахидоновая кислота ("Fluka", Швейцария), которую хранили в виде концентрированного раствора в абсолютном этаноле при -70^оС. Рабочий раствор готовили перед началом каждого опыта таким образом, что при добавлении его в объеме 5 мкл концентрация арахидоновой кислоты в кювете составляла 510^-5 М.

Влияние эмоксипина на арахидонат-индуцированную агрегацию нейтрофилов было еще более выраженным. Преинкубация с 3 мМ эмоксипина приводила к удлинению лаг-периода в 2,9 раза (р < 0,001); в концентрациях 5-10 мМ эмоксипин увеличивал этот показатель в среднем в 4,6 раза (р < 0,001).

Как видно из табл. 6, в концентрациях 3-5 мМ эмоксипин вызывал уменьшение максимума светопропускания в среднем на 66% (р < 0,001). Преинкубация с 10 мМ препарата практически предотвращала агрегацию (уменьшение В_м на 92% р < 0,001).

При инкубации нейтрофилов с 3, 5, 10 мМ заявляемого вещества скорость агрегации уменьшилась соответственно в 2 (р < 0,001), 3 и 6 раз (р < 0,001).

П р и м е р 6. Подавление эмоксипином агрегации нейтрофилов, индуцированной кальциевым ионофором А 23187. Ионофор А 23187 ("Calbiochem-Вehring", США) растворяли в диметилсульфоксиде ("Serva", ФРГ) и хранили при -70^оС. Перед началом каждого опыта маточный раствор разводили в 10 раз буфером. Опыты ставили так же, как описано в примере 4. Объектом исследования служили кроличьи и человеческие нейтрофилы. Индуктор вносили в кювету в объеме 20 мкл. Величина лаг-периода не использовалась для количественной характеристики подавления А 23187 индуцированной агрегации.

Как видно из табл. 7, преинкубация кроличьих и человеческих нейтрофилов с 10 мМ эмоксипина приводила к уменьшению максимума светопропускания в два раза (р < 0,001). Судя по изменениям начальной скорости агрегации, человеческие нейтрофилы были более чувствительны к протекторным эффектам эмоксипина. Обработка препаратом (10 мМ) снижала скорость агрегации гранулоцитов кролика в 1,4 раза (р < 0,001), в случае человеческих клеток этот показатель уменьшался вдвое (р < 0,001).

Таким образом, эмоксипин в концентрациях 5-10 мМ эффективно ингибирует агрегацию нейтрофилов, вызванную различными индукторами. Дексаметазон, являющийся одним из самых мощных лекарственных средств группы глюкокортикостероидов, ингибирует агрегацию нейтрофилов на 50% в концентрации 80 мМ (32 мг/мл). Ингибиторы циклооксигеназы не влияют на агрегационную способность нейтрофилов.

Следующий пример иллюстрирует способность эмоксипина блокировать липоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты. Липоксигеназные продукты являются как медиаторами активации нейтрофилов (15-17), так и медиаторами шока.

П р и м е р 7. Подавление эмоксипином продукции лейкотриена В₄ и 5-гидрокси-6,8,11,14-эйкозатетраеновой кислоты (ЛТВ и 5-НЕТЕ).

Опыт ставили так же, как описано в примере 4, но объем проб увеличивали вдвое. Через 5 мин инкубации интактных или протектированных эмоксипином нейтрофилов с ЛПС или 0,15 М раствором хлористого натрия реакцию останавливали добавлением 1,5 объемов ледяного метанола. Пробы инкубировали 15 мин при 4^оС, а затем центрифугировали (2000g, 4^оС, 10 мин), супернатанты подкисляли 1 М раствором соляной кислоты до рН 3,5 и хранили при -70^оС до определения.

Липоксигеназные продукты экстрагировали двумя объемами этилацетата, экстрагент удаляли под азотом, а осадок растворяли в буфере для соответствующего радиоиммуноанализа.

ЛТВ₄ и 5-НЕТЕ определяли радиоиммунохимически с помощью коммерческих наборов (³Н-LtB₄ assay reagent system, "Amersham" Великобритания; 5-НЕТЕ ³Н-RIA Kit, "Seragen", США). В каждой пробе делали два параллельных измерения. Уровень обоих продуктов выражали в пг/10⁷ клеток/мл. Значимость оценивали с помощью t-критерия Стьюдента для попарно связанных вариант.

Как видно из табл. 8, клетки, стимулированные ЛПС, образовывали в 1,4 раза меньше 5-НЕТЕ (р < 0,001) и в 1,6 раза больше ЛТВ₄ (р < 0,01) по сравнению с нативными нейтрофилами.

Преинкубация с 10 мМ эмоксипина приводила к еще более резкому уменьшению продукции 5-НЕТЕ (в 1,4 раза по сравнению с клетками, обработанными ЛПС, р < 0,05; в 1,9 раза по сравнению с нестимулированными клетками, р < 0,001. Под влиянием эмоксипина продукция ЛТВ₄ снижалась в 2 раза по сравнению с ЛПС-индуцированной (р < <0,05) и была в 1,3 раза меньше, чем в нестимулированных клетках (р < 0,05).

Таким образом, даже двухминутный контакт нейтрофилов с эмоксипином полностью блокирует продукцию лейкотриенов, индуцированную ЛПС. Дексаметазон подавляет синтез липоксигеназных продуктов в клетках некоторых линий лишь после многочасовой инкубации. Кроме того, эффективность дексаметазона как ингибитора продукции лейкотриенов определяется способностью клеток к синтезу белка. Однако при эндотоксиновом шоке синтез белков нарушается и даже высокие дозы дексаметазона не блокируют продукцию метаболитов арахидоновой кислоты. И, например, ингибирующая активность кортикоидов может зависеть от того, какой агент использован в качестве триггера метаболизма арахидоновой кислоты. Например, дексаметазон не подавляет продукцию лейкотриенов в клетках легочной ткани, стимулированных антителами, а гидрокортизон в лейкемических базофилах крысы, стимулированных ионофором А 23187. К лекарственным препаратам, ингибирующим циклооксигеназу и тромбоксан-синтетазу, ферменты биосинтеза лейкотриенов не чувствительны.

Представленные данные позволяют заключить, что впервые найдено высокоэффективное средство патогенетической терапии шоковых состояний.