способ идентификации культур рода iersinia с использованием бактериофага

Формула изобретения

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ КУЛЬТУР РОДА IERSINIA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИОФАГА, включающий приготовление взвеси культуры и бактериофага, нанесение их на плотную питательную среду, инкубацию посевов с последующим учетом результатов по степени лизиса культуры бактериофагов, отличающийся тем, что взвесь культуры приготавливают в фосфатном буфере с рН 7,2 7,4, содержащем сернокислый кальций и сернокислый магний в концентрации 10^-2 - 10^-3 М каждый, перед нанесением на плотную питательную среду взвесь культуры смешивают с бактериофагом в соотношении 1 3 1 4, инкубацию проводят в течение 20 30 мин при 36 38^oС, нанесение на питательную среду осуществляют одномоментно репликатором.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к методам идентификации и дифференциации культур с использованием бактериофагов.

Известны различные способы идентификации микроорганизмов с использованием бактериофагов, включающие приготовление взвеси культуры соответствующей концентрации в физиологическом растворе (бульоне), посев ее газоном на агаровую пластинку с последующим подсушиванием и нанесением бактериофага каплями или "дорожкой" на газон культуры (Методические рекомендации по профилактике и лабораторной диагностике бруцеллеза: М. 1980. С.33; Руководство по микробиологии чумы. Саратов, 1972. С. 132). Данный способ позволяет идентифицировать на одной чашке 1-2 культуры;

приготовление взвеси культуры соответствующей концентрации в физрастворе (бульоне), посев ее "дорожкой" на агаровую пластинку с последующим подсушиванием и нанесением каплями бактериофага на "дорожку" культуры.

Данный способ позволяет идентифицировать на одной чашке 3-5 культур одновременно.

Недостатками данных способов являются трудоемкость при одновременной идентификации значительного количества штаммов и связанный с ней материальный расход большого объема питательных сред, относительно невысокая чувствительность метода при исследовании культур с различной степенью фаголизабельности.

Наиболее близко к изобретению относится способ идентификации культур с использованием бактериофага, который включает приготовление взвеси соответствующей концентрации, посев культуры "дорожкой" на плотную питательную среду, подсушивание и нанесение бактериофага каплями на "дорожку" культуры, инкубацию и идентификацию культуры по наличию или отсутствию лизиса ее бактериофагом.

Недостатком этого способа является трудоемкость при одновременной идентификации значительного количества штаммов и связанный с ней материальный расход большого объема питательных сред, относительно невысокая чувствительность метода при исследовании культур с различной степенью фаголизабельности.

Целью изобретения является расширение объема исследования при сокращении материальных затрат с одновременным повышением чувствительности метода.

Сущность изобретения заключается в том, что культуру с фагом наносят на плотную питательную среду и по наличию или отсутствию лизиса проводят идентификацию культуры. Причем бактериофаг в матрице предварительно смешивают в соотношении 3:1 4:1 со взвесью культуры, которую готовят в фосфатном буфере (рН 7,2-7,4), содержащем дополнительно соли CaSO₄ и MgSO₄ в концентрации 10^-3 10^-2 М каждой. Полученную смесь инкубируют в течение 20-30 мин при 36-38^оС, после чего наносят одномоментно репликатором на плотную питательную среду.

Отличительные признаки заявляемого объекта состоят в том, что бактериофаг перед нанесением на плотную питательную среду предварительно смешивают в соотношении 3:1 4:1 со взвесью культуры. Взвесь культуры готовят в фосфатном буфере (рН 7,2-7,4), содержащем дополнительно соли СаSO₄ и MgSO₄ в концентрации 10^-3 10^-2 М каждой. Смесь инкубируют 20-30 мин при 36-38^оС, нанесение смеси на плотную питательную среду осуществляют одномоментно репликатором.

Предварительное смешение бактериофага со взвесью культуры, приготовленной в соответствующем буфере с последующей инкубацией, осуществляется для обеспечения достаточной адсорбции бактериофага на поверхности микробной клетки, при этом жидкая среда, в которой происходит смешение способствует большей возможности контакта бактериофага с клеточными рецепторами; инкубация смеси фагкультура в течение 20-30 мин при 36-38^оС обеспечивает необратимость адсорбции бактериофага на микробной клетке. Соотношение количества бактериофага и микробных клеток в смеси также определяет процесс адсорбции: так, при высокой концентрации бактерий большая часть фаговых корпускул прикрепляется к клеточным рецепторам обратимо при увеличении же количества фаговых частиц, приходящихся на одну микробную клетку до соотношения 3:1 4:1, степень необратимости адсорбции возрастает.

Значительное влияние на процесс адсорбции оказывает также присутствие катионов в среде взаимодействия фаг-бактерия, поскольку начальной ступенью адсорбции фага является образование электростатических связей между соответствующими конфигурациями ионных зарядов на поверхности как бактериофага, так и микробной клетки. Катионы, присутствующие в среде, в частности Са²⁺ и М²⁺, определяют формирование электростатических зарядов на обоих телах, что обеспечивает эффективность столкновения между фаговыми частицами и бактериальными клетками, которое приводит к присоединению бактериофага.

Способ осуществляется следующим образом. Готовят взвесь культур исследуемых штаммов в концентрации 1 10⁹ микробных клеток (м.к.)мл в фосфатном буфере (рН 7,2-7,4), содержащем дополнительно соли СаSO₄ и MgSO₄ в концентрации 10^-2 10^-3 М каждой. В лунки стерильной матрицы вносят 1 часть (10 мкл) взвеси культуры исследуемых штаммов, сюда же добавляют 3-4 части (30-40 мкл) бактериофага. Параллельно в лунки также вносят в том же объеме (1 часть 10 мкл) взвеси культуры, куда бактериофаг не добавляют (контроль культуры). Матрицу накрывают чашкой Петри и помещают в термостат при 36-38^оС на 20-30 мин, после чего штампом-репликатором делают отпечатки на агаровой пластинке. На одной чашке таким образом можно исследовать до 25 штаммов. Чашки с посевами инкубируют в течение 24-36 ч при 36-38^оС. Идентификацию культур осуществляют по степени их лизиса бактериофагом. При этом возможны следующие уровни колебаний чувствительности:

"СL" полный лизис культуры бактериофагом;

"SCL" единичные колонии на фоне сплошного лизиса;

"OCL" вторичный рост культуры на фоне сплошного лизиса;

"+++, ++, +" единичные негативные бляшки на фоне сплошного роста культуры;

"-" отсутствие лизиса.

П р и м е р 1. В качестве системы фаг-микроорганизм были использованы:

1. I.pestis 461 + чумной бактериофаг;

2. I.pestis EB + чумной бактериофаг;

3. I.pseudotuberculosis 1 серовар + псевдотуберкулезный бактериофаг.

Готовят взвесь указанных культур до концентрации 1 10⁹ м.к./мл в фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем дополнительно соли CaSO₄ и MgSO₄ в концентрации 10^-3 М каждой. В лунки матрицы вносят 10 мкл взвеси культур исследуемых штаммов, сюда же добавляют 30 мкл (1:3) соответствующих бактериофагов. Параллельно в лунки вносят взвесь культур в том же объеме (10 мкл) контроль культуры. Матрицы помещают в термостат на 20 мин при 36^оС, после чего штампом-репликатором наносят данную взвесь на агаровую пластинку. Чашки с посевами инкубируют 24-36 ч при 36-38^оС.

При просмотре чашки на фоне роста культуры в контроле наблюдается ее лизис в опыте рост культуры отсутствует.

П р и м е р 2. Были использованы те же системы фаг-микроорганизм, что и в примере 1.

Готовят взвесь культуры до конечной концентрации 1 10⁹ м.к./мл в фосфатном буфере (рН 7,3), содержащем дополнительно соли CaSO₄ и MgSO₄ в концентрации 5 10^-3 М каждой. В лунки матрицы вносят 10 мкл взвеси культур, сюда же добавляют 35 мкл (1:3,5) соответствующих бактериофагов. Параллельно в лунки вносят взвесь культур в том же объеме (10 мкл) контроль культуры. Матрицу инкубируют 25 мин при 37^оС, после чего штампом-репликатором наносят данную смесь на агаровую пластинку. Чашку с посевом инкубируют 24-36 ч при 36-38^оС.

При просмотре чашки на фоне роста культуры в контроле наблюдается ее лизис в опыте рост культуры отсутствует.

П р и м е р 3. Были использованы те же системы фаг-микроорганизм, что в примерах 1 и 2.

Готовят взвесь агаровой культуры до конечной концентрации 1 10⁹ м.к. /мл в фосфатном буфере, содержащем дополнительно соли СaSO₄ и MgSO₄ в концентрации 10^-2 М каждой. В лунки матрицы вносят взвеси культур по 10 мкл, сюда же добавляют 40 мкл (1:4) соответствующих бактериофагов. Параллельно в лунки вносят культуру в том же объеме (10 мкл) контроль культуры. Матрицу инкубируют 30 мин при 38^оС, после чего штампом-репликатором наносят данную смесь на агаровую пластинку. Чашку с посевом инкубируют 24-36 ч при 36-38^оС.

При просмотре чашки на фоне роста культуры в контроле наблюдается ее лизис в опыте рост культуры отсутствует.

Таким образом, изобретение позволяет расширить объем исследования в 4-5 раз при сокращении расхода питательных сред в 4-5 раз, при этом повышается чувствительность метода в 1,2-1,5 раза.