способ ингибирования активности вируса иммунодефицита человека - hjv in vivo в эксперименте

Формула изобретения

Способ ингибирования активности вируса иммунодефицита человека HJV in vivo в эксперименте, отличающийся тем, что вводят противомалярийное средство примахин в эффективной дозе.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к использованию противомалярийного лекарства для ингибирования инфекции восприимчивых клеток вирусом человеческого иммунодефицита (НIV), а также к методу ингибирования пролиферации НIV.

Приобретенный иммунный дефицитный синдром (АIDS) является в настоящее время вопросом первостепенной важности в Северной Америке, Европе и Центральной Африке. Полагают, что случайным агентом AIDS является ретровирус. Сделанные в последнее время оценки предполагают, что приблизительно 1,5 миллиона американцев могут подвергнуться воздействию вируса AIDS. Затронутые этим вирусом люди выявляют сильное подавление иммунитета, что может сопровождаться началом дегенеративных и даже фатальных болезней.

Выделение и характеристика первого ретровируса AIDS, известного как LAV, было описано в работе F.Barre-Siroussi и др. Science, 220: 868-871 (1983). Использование некоторых экстрактов этого вируса и некоторых его белков для обнаружения антител против вируса описано в Патенте США N 4708815.

Впоследствии несколькими исследователями было сообщено о нескольких культурах ретровируса AIDS и культуры упоминались в литературе под различными обозначениями. Сейчас ясно, что предложенные ранее вирусы вирус, связанный с лимфаденопатией (LAV), вирус, связанный с иммунным дефицитом (JDAVI 1 и JDAVI 2), человеческий Т-лимфотропный вирус типа III (HTLV-III) и вирус, родственный AIDS (ARV), все являются вариантами одного и того же ретровируса (см. например, Nature, 313: 636-637 (1985).

Субкомитет, уполномоченный Международным Комитетом по систематике вирусов, в последнее время предложил, чтобы ретровирусы AIDS были официально обозначены как "Вирусы иммунодефицита человека", известные в форме аббревиатуры как "HIV". Культуры человеческих ретровирусов с явным, но ограниченным сходством по отношению к культурам HIV (например, более 20% но менее 50% идентичности чередования нуклеиновой кислоты) не должны называться HIV несмотря на то, что имеется непреодолимое сходство у существующих элементов групп в их биологических и структурных свойствах. Science, 232: 697 (1986).

Другой патогенный человеческий ретровирус, названный HIV-2 (по-старому LAV-2) был недавно выделен к западно-африканского пациента с AIDS. Сlavel с сотруд. Science, 238: 343-346 (1986). HIV-2 инфекция связана с синдромом иммунодефицита, не отличающегося клинически от вызываемого прототипом вируса AIDS, HIV-1. HIV-2 является родственным, но при этом отличается от HIV-1. Guyader с сотруд. Nature, 326: 662-669 (1987).

Ретровирусы, генетически родственные и аналогичные в биологическом отношении HIV, были выделены от субчеловеческого подвида приматов. Эти ретровирусы обозначаются как образцы вируса иммунодефицита соответствующего носителя (хозяина), например, такого, как обезьяний вирус иммунодефицита (SIV). SIV был впервые выделен от пленной (содержащейся в неволе) резус макаки (Масаса mulatta) в областном исследовательском центре приматов в Новой Англии (NERPRC). Вскоре последовало сообщение с выделении SIV, названного STLV-III, от африканской зеленой обезъяны. Между HIV-2 и SIV существует обширное серологическое (иммунологическое) сходство в реакционной активности.

Передача HIV обычно происходит при сексуальном контакте, хотя люди, использующие наркотики внутривенно, также представляют собой группу высокого риска. Большое число людей было заражено также HIV после получения зараженной крови или кровяных продуктов.

Становится все более очевидным, что в передаче HIV важными являются факторы из-за наличия AIDS в области эпидемической малярии. Одним из факторов этиологической склонности к AIDS является недостаточность функции Fc-рецептора в ретикулоэндостелиальной (фагоцитовой) системе. В.S.Bender, J.Infect. Dis 152: 409-412 (1985). Недостаточность функции Fс -рецептора эритроцитов и последующая очистка иммуноглобулина эритроцитов клеток была продемонстрирована у пациентов с вирусом AIDS. Кроме того, было показано, что активность антитела ретровируса в отношении вируса AIDS выявляет значительную кросс-реактивную способность в отношении уровня антител против Рlasmodium falciparum. R. J. Biggar с сотр. Zancet, 7 сентября 1985: 520-523. Хотя и остаются некоторые дебаты по вопросу о кросс-реактивности (R.J.Biggar с сотруд. New Engl. J. Med. 315: 57-8 (1986), A.E.Greemburg и др. Zancet, 2 августа, 1986: 247-249), эта дискуссия не принимает во внимание возможность двойственной экспозиции (продолжительности) и очищения от инфекционного агента AIDS разработкой антител в отношении вируса AIDS. Далее кросс-активность антител между AIDS и малярией выявляется эффективностью действия до некоторой степени специфичных антималярийных агентов в благоприятных инфекциях. Пириметамин-сульфадоксин в сочетании показали эффективность в воздействии на Рneumocystis carinii инфекции у пациентов с AIDS. (R.D.Pearson и др. Ann. Inr. Med. 106: 714-718 (1987г).

Существование многочисленных человеческих вирусов иммунодефицита таких, как HIV-1 и HIV-2 создает сложную эпидемиологическую картину. Существует общее убеждение в том, что должна быть создана эффективная вакцина или фармацевтическая композиция против инфекции HIV для того, чтобы задержать распространение этих ретровирусов. Работа по созданию вакцины развивается, но эффективный агент пока еще не найден. Таким образом, в этой области существует необходимость создания метода ингибирования активности HIV in vivo.

Изобретение помогает в осуществлении этой задачи. Оно дает метод ингибирования активности человеческого вируса иммунодефицита (HIV) in vivo и этот метод включает прием человеком-носителем антималярийного лекарства примахина. Антималярийное средство применяется человеком в количестве, достаточном для предотвращения или по меньшей мере ингибирования Т лимфоцитов HIV in vivo или для предотвращения или по меньшей мере ингибирования повторности HIV in vivo.

Неуловимость и отвлеченность (отклонение) HIV создает определенные трудности в воздействии на него. Предлагаемое является средством и методом, способным предотвратить распространение и приобретение HIV-инфекции, и помогает воздействовать на эту инфекцию.

Метод, предлагаемый данным изобретением, используется для воздействия на людей, или инфицированных HIV, или восприимчивых к HIV-инфекции. Выражение "НIV"инфекция" включает все типы инфекций, включенных в классификационную систему, опубликованную центрами по руководству болезнями, Атланта, Джорджия. Эти инфекции включают острую инфекцию HIV; бессимптомные условия; устойчивую распространенную лимфаденопатию и другие болезни, такие как органические (общие) болезни, неврологические болезни, вторичные инфекции, вторичные (побочные) раковые заболевания и другие состояния, характерные для HIV-инфекции или иммунодепрессии.

Метод данного изобретения особенно полезен для ингибирования активности HIV-1 или HIV-2 у людей, инфицированных ими. Несмотря на то, что это изобретение дает описание в отношении человеческих культур, идентифицированных в литературе как LAV-1, HTIV-III и LAV-2, понятно, что это изобретение распространяется в такой же мере на эквивалентные ретровирусы. Полагают, что эти ретровирусы являются причиной заболевания AIDS и HIV.

В цели данного открытия вирус рассматривается как то же самое или как эквивалент LAV/HTIV-III, если он в основном соответствует следующим критериям:

а) вирус является тропическим для Т-лимфоцитов, особенно для кооперирующих Т-клеток (СD4⁺);

b) вирус является цитопатическим для инфицированных СD4⁺ клеток;

с) вирус кодирует RNA-депендент (аргумент) DNA полимеразы (обратная трансцитаза), который является Мg²⁺-депендентом и может использовать олигомер (dT) _12-18 в качестве основы для обратной транскрипции (перехода) из его 3" ITR;

d) вирус в основном является иммунологически кросс-реактивным по отношению к белкам (протеинам), закодированным как и области LAV/HTIV-III;

е) вирус в значительной степени принимает участие в нуклеотидной гомологии (приблизительно 75-100% ) и в последующей аминокислотной гомологии (приблизительно 75-100%) с LAV или HTIV-III.

Основной фармацевтически активный компонент, применяемый в способе данного изобретения, представляет собой антималярийное средство.

Антималярийные средства, которые могут быть применены при практическом осуществлении предложенного способа выбраны из групп, состоящий из алкалоидов, таких как хинин и хинидин; 9-аминоакридины, такие как мепакрин; 4-аминохинолины, такие как хлорохин и амодиахин; 8-аминохинолины, такие как примахин, памахин и хиносид. Дигуаниды, такие как прогуанил (хлоргуанид), также могут быть использованы. Примерами других подходящих антималярийных средств являются диаминопиримидины, такие как пириметамин или другие редуктазные ингибиторы-производные дигидрофолиевой кислоты, такие как триметопри; сульфоны, также как диаминодифенилсульфон (DDS или дапсон) и диформилдифенилсульфон; сульфонамиды, такие как сульфадиазин, сульфаметоксипиразин, сульфамонометоксин, сульфадоксин и сульфаметоксазол.

Могут быть применены также мефлохин, галофантрин; гидроксианилино-бензо-нафтиридины, такие как пиронаридин; сесквитерпен лактоны, такие как артемизинин. Эти антималярийные средства и способы их приготовления известны.

При практическом осуществлении метода данного изобретения могут использоваться комбинации одного или большего числа антималярийных средств помимо комбинации пириметамин-сульфадоксин. Так, например, может быть использована комбинация пириметамина и хлорхина. Аналогично, амолиахин может быть использован вместе с примахином, приметамин может сочетаться с дапсоном, хлорохин может быть использован с примагуанином или хлоропрогуанином, пириметамин или другое средство антифолат может быть скомбинированным с сульфадоксином и пириметамин может быть использован вместе с сульфаленом или сульфалиазином или сульфаметоксипиразином.

Было найдено, что использование одних антибиотиков по способу данного изобретения в качестве антималярийных средств, не является эффективным. Таким образом, выражение "антималярийное средство" предполагает исключить антималярийные антибиотики при использовании только одниих антибиотиков в процессе осуществления метода данного изобретения. Однако понятно, что антималярийные антибиотики, такие как тетрациклин и клиндамицин (диоксициклин, линкомицин) могут применяться в комбинации с одним или с большим числом упомянутых выше антималярийных средств.

Понятно также, что предложенный способ может быть осуществлен соединениями, которые замещают in vivo на один из приведенных выше антималярийных препаратов, а также и соединений, которые образуют метаболиты (продукты обмена) in vivo аналогично метаболитам, образованным из упомянутых выше антималярийных средств.

Антималярийные средства могут применяться в форме свободных оснований или в форме фармацевтически приемлемых кислых присоединенных солей. Примерами подходящих солей являются хлориды, гидрохлориды, сульфаты, фосфаты и дифосфаты. Могут быть использованы также другие водорастворимые нетоксичные неорганические и органические соли.

При осуществлении предложенного способа антималярийное средство принимается большинством людей с применением одного из обычно используемых методов приема антималярийных агентов. Так, например, лекарство может быть введено большинству людей оральным способом или парентерально, путем внутривенных или внутримышечных инъекций. Для инъекций описанные выше соединения могут быть приготовлены в форме растворов, суспензий или эмульсий в средах, удобных в применении для этой цели. Могут использоваться также и другие методы приема.

Антималярийное лекарство применяется в соответствии со способом данного изобретения в количестве, достаточном для обеспечения адекватной концентрации лекарства для прекращения действия или по меньшей мере для ингибирования инфекции Т-лейкоцитов вируса HIV in vivo или для предотвращения или по меньшей мере ингибирования повторности HIV in vivo. Количество лекарства, таким образом, зависит от абсорбции, локализации и выведения из человеческого организма. Эффективность антималярийных лекарств определяется дозой. Дозировка антималярийного лекарства должна быть достаточной для создания минимального заметного эффекта, при этом доза должна быть меньше, чем установленная летальная доза. Дозировка принимаемого антималярийного лекарства для носителя (инфекции) может варьироваться в широких пределах. Соединения могут приниматься в минимальном количестве, дающем терапевтический эффект, и доза может быть увеличена в случае необходимости до максимальной величины дозировки, переносимой пациентом. Антималярийное лекарство может приниматься с относительно высокими весовыми дозировками при более низком содержании основного вещества или лекарство может приниматься в виде однородной дозировки.

Дозировка и частота приема будут меняться для применяемого антималярийного средства в соответствии с методом изобретения. Антималярийные средства по данному изобретению могут быть применены в количествах вплоть до 6-кратных максимальных доз, рекомендуемых для лечения малярии. Обычно доза не превышает 5-кратной величины максимальной дозы, рекомендуемой для лечения марярии, и наиболее часто она составляет величину, не превышающую 4-кратную максимальную величину дозы, рекомендуемой для лечения малярии.

Мефлокуин также рекомендуется для орального приема. Таблетки, содержащие 250 мг лекарства, могут приниматься в виде единичного приема или раздельными дозами в 1500 мг.

Доза антималярийного лекарства определяется с учетом величины среднего веса. Таким образом, понятно, что дозировка будет изменяться в пределах 20-25% для пациентов с более легким или более тяжелым весом. Аналогичным образом дозировка для детей будет регулироваться с использованием хорошо известных для этой цели расчетных формул.

Примакуин вследствие его более эффективного экстраэритроцитового воздействия на ретикулоэндотелиальную систему и на распространение вируса является более предпочтительным антималярийным средством для использования по методу данного изобретения. Доза для взрослого человека составляет около 15 мг/день основания (26 мг/день соли) орально или около 45 мг/неделю основания (79 мг/неделю соли) орально. Для детей доза составляет около 0,3 мг/кг основания в день (0,5 мг/кг в день соли) орально или около 0,9 мг/кг основания в неделю (1,5 мг/кг соли в неделю) орально.

Как отмечалось ранее, любое из антималярийных лекарств может быть использовано по данному изобретению при уровнях дозировки, в несколько раз превышающих дозировки, рекомендуемые для лечения малярии. Так, например, взрослая доза примакуина может быть увеличена до 250 мг/неделю основания. В качестве другого примера, хлорокуин может быть применен в соответствии с данным изобретением с уровнем взрослей дозировки около 1800 мг/неделю.

Из-за риска гемолиза, в особенности для индивидуумов с дефицитом глюкоза-6-Р-дегидрогеназы, существуют и другие альтернативы. Они включают менее токсичные 8-аминохинолины или другие носители, связывающие примакуиновые агенты. (I.Hofsteenge и др. J.Med.Chem. 29: 1765-1769, 1986).

Существует много предложений в отношении механизма действия антималярийных средств при использовании их для предотвращения и лечения малярии. (D.A. A.Akintonwa, J.Theor. Biol. 106: 78-87, 1984). R.Deslauriers и др. Biochimica et Biophisica Asta, 931: 267-275, 1987). Предполагаемые механизмы включают ингибирование лизосомных катепсинов, протонирование в пределах кислого внутриклеточного отдела, стабилизацию мембран и энзимное возбуждение. Непосредственное действие антималярийных средств в предотвращении и лечении малярии состоит в ингибировании спорозоидной инвазии (приступа) ретикулоендотелиальных клеток. (A. L. Schwartz и др. Molec. and Biochem. Parasit. 14: 305-311, 1985). Во всех случаях, механизм, по которому антималярийные средства ингибируют активность HIV in vivo по методу данного изобретения не до конца понятен. Механизм может быть обусловлен одним фактором или комбинацией факторов, таких изменение генотипного или фенотипного (симптомного) признаков ретровирусов или изменение виральных или клеточных процессов.

Таким образом, антималярийное лекарство может ингибировать инфекцию восприимчивых СD⁴⁺ клеток нарушением функции рецепторов клеток или виральной оболочки рецепторов или изменением природы механизма связи. Очевидно, что вирус подвергается транслокации в клетку. Таким образом, антималярийное средство может изменять процесс транслокации. Далее, геномные элементы, которые регулируют образование продуктов, необходимых для виральной воспроизводительности (повторяемости), могут быть изменены или антималярийные средства могут затронуть их фуункции. Например, антималярийные средства могут действовать как ингибиторы обращения транскриптазы или могут изменять природу оболочки гликопротеина ретровируса или ингибировать образование гена, или воздействовать на уровень образования детерминантов гена на поверхности тела. Антималярийные средства могут также действовать непосредственным вмешательством в функционирование ретикулоендотелиальной системы либо до, либо после того, как произошло заражение (инфицирование) HIV. Например, антималярийные средства могут усиливать выделение Fc-рецептора или функцию in vivo в мононуклеарно-фагоцитной системе. Это может привести к снижению восприимчивости к условно-патогенным инфекциям, связанным с AIDS. Антималярийные средства могут также ингибировать протиферацию (разрастание) HIV в инфицированных фагоцитовых клетках. Понятно, что антималярийные средства могут действовать любым из указанных способов или их комбинированием, или другими способами.

Эффективность антималярийного средства в предотвращении или ингибировании инфекции клеток демонстрируется с использованием стандартных in vivo испытаний. Так, ингибирующий эффект антималярийных средств на инфекцию HIV или на воспроизводимость может быть продемонстрирован культивированием вируса или зараженных вирусом клеток в присутствии или в отсутствии антималярийных средств с последующим сравнением результатов.

Примахин для борьбы с эпидемиями СПИД. Мichael H. Davis M.O.

ВИЧ ИСПЫТАНИЯ in vivo С ПРИМАХИНОМ

По заключенному контракту с СайСтемикс Инк. Пало Альто, Калифорния под медицинским руководством Др. J.M.McCune^I проведены испытания примахина на его способность ингибировать репликацию ВИЧ in vivo. Согласно модели испытаний иммунодефицитным мышам трансплантируют плодную ткань человека. После трансплантации служащих моделью мышей инфицируют ВИЧ с целью испытания антивирусных или иммуномодулирующих лекарств.

Методики.

Мышей линии Scid-hu через три недели после трансплантации (каждая весом 15-20 г) инфицируют каждую ВИЧ-1, изолят JR-CSF путем внутривенной ретро-орбитальной инъекции с использованием инокулума размером 120000 ТСLD 50/03 мл. На 14-й день мышей умерщвляют и образцы плазмы хранят при -20^оС. Кроме того, для последующих исследований хранят образцы ткани.

В табл. 1 предствален исходный протокол, а в табл. 2 уточненный протокол, полученный после смерти мышей группы 4 предположительно от токсичного уровня примахина.

С использованием примахина в виде дифосфата приготовлены два исходных примахина. Исходный раствор А содержит 10 мг/мл в дистиллированной воде, а исходный раствор В 1 мг/мл в дистиллированной воде. Мыши группы 3 получают 0,85 мл раствора В, группы 4 0,85 мл раствора А, группы 5 0,1 мл раствора В в разбавлении 1:5, приготовленного за день до применения, и группы 6 0,375 мл исходного раствора В в разбавлении 1:5, приготовленного за день перед употреблением.

Заключительные испытания

РНК виремии ВИЧ-инфицированных мышей линии SCID-hu подвергнута испытанию с использованием ПК-амплификации с помощью праймеров, специфичных на консервированную U5-gag область ВИЧ генома:

661 5"-CCTGCGTCGAGAGAGCTCCTCTGG-3";

667 5"-GGCTAACTAGGGAACCCACTG-3".

При получении вирусной РНК, синтезе кДНК и ПК-амплификации используют 400 мкл целостной крови. Кровь смешивают с 100 мкл фосфатного буферного солевого раствора, содержащего 50 ед/мл гепарина, и центрифугируют 5 мин при 7000 об/мин и 4^оС. Плазму вновь центрифугируют два часа при 15000 об/мин и 4^оС. Вирусные комочки вновь суспендируют в 400 мкл 1хМАТ-буфера (500 мМ NaCl; 10 мМ Трис-НСl, рН 7,5; 1 мМ ЭДТК; 1% НДС) плюс 100 мкг протеиназы К, 100 мк ТРАN и мкл РНКазина на образец. Инкубацию ведут 1-2 ч при 37^оС на качающейся платформе. Затем образцы экстрагируют сначала 500 мкл насыщенного фенола, 500 мкл смеси фенола с хлороформом (1:1) и наконец 500 мкл хлороформа. Образцы в течение 30 мин осаждают на сухом льду 100%-ным этанолом и 40 мкл 3 М NaOAc. Образцы центрифугируют при 12000 об/мин, надосадочную жидкость декантируют и образовавшиеся комочки сушат 20 мин в вакууме. Затем образцы обрабатывают с целью синтеза кДНК использованием МоМuLY обратной транскриптазы (1-2 ч при 37^оС). Для обнаружения ВИЧ-РНК используют в ходе синтеза кДНК праймирующий олиго-661; наряду с 661-праймером в ходе состоящей из 60 циклов ПК-амплификации (95^оС 1 мин, 55^оС 1 мин, 72^оС 1 мин 30 с) используют обратный 667-праймер в сочетании с Тао полимеразой. Продукты ПКО-амплификации разделяют на 3%-ный гелях агарозы с детектированием по окрашиванию этидий-бромидом.

ДНК инфекция клеток человека методом трансплантированной лимфы анализировалась с помощью ПКО-амплификации с применением праймеров, специфичных на консервированную U5-gag область ВИЧ генома (см. выше). По прекращении исследований in vivo лимфоидную ткань человека иссекают из скоплений жировой ткани молочной железы и хранят в жидком азоте. Образцы лизируют в 800 мкл буфера для лизиса (1% НДС, 1 х SSC; 150 мМ NaCl, 15 мМ цитрата натрия, рН 7) плюс 200 мкг проназы Е на образец. Инкубирование на качающейся платформе ведут примерно сутки при 37^оС. Затем 400 мкл каждого образца экстрагируют сначала 500 мкл насыщенного фенола, затем 500 мкл смеси фенола с хлороформом (1:1) и наконец 500 мкл хлороформа. Образцы вновь осаждают 100%-ным и 40 мкл 3 М NaAOc (30 мин на сухом льду). Образцы центрифугируют при 12000 об/мин, насадочную жидкость декантируют и образовавшиеся комочки сушат 20 мин в вакууме. Комочки вновь суспендируют в 100 мкл ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТК). Реакции в цепи под воздействием полимеразы ведут с помощью праймеров 661 и 667 в сочетании с Тао полимеразой в ходе 60 циклов (95^оС 1 мин, 55^оС 1 мин, 72^оС 1 мин 30 с). Продукты ПКО-амплификации разделяют на 3%-ных гелях агарозы и детектируют по окрашиванию этидий-бромидом.

Результаты.

Качественный завершающий анализ закончен 16 мая 1990 г. Ткани хранят для последующего количественного ПКО-анализа, отложенного до момента, пока метод не стал доступным.

В табл. 3 приведены результаты качественного анализа. В приведенной таблице источником тканей служат 5 отдельных доноров, пронумерованных последовательно в контрольной группе 1. В каждой группе трансплантацию проводят в такой последовательности, что мыши 11, 16, 26, 36, 41 и 46 являются реципиентами одних и тех же доноров. Последовательность повторяется для мышей 12, 17, 27 и т.д.

При таком качественном исследовании очевидно связанное с дозировкой понижение при определении периферийной виремии. Ткань хранится в ожидании дальнейшего разивтия количественного анализа. Следуеть отметить, что в то время, как в контрольных анализах с AZT не наблюдается поддающейся измерению ДНК из виремии или вирусной ткани, доза AZT в этом и других моделях исследования подбиралась такой, чтобы получить нулевые показания в контрольных анализах. В прежней модели протокола с AZT результаты с AZT описывались как аналогичные результатам, обнаруживаемым с примахином. В данной модели для данного испытания по контракту, также как и в испытаниях по контракту с другими агентами, при параметрах для нулевых показаний необнаруживаемые количества периферийной виремии не видны в контрольных анализах. В целом для агентов, эффективно снижающих виремию по этой модели, можно наблюдать изменяющуюся реакцию в пределах данного интервала дозировок с демонстрацией эффекта реакции на дозировку.

AZT не решает экстракции ДНК виремии или вирусной ткани в обычных допустимых для человека дозах. Кроме того, AZT оказывает неблагоприятное воздействие на клеточные и серологические меры иммунности по ходу понижения вирусной репликации. Этим исследованием по контракту на этот раз не анализировались другие иммунологические факторы, такие как уровень иммуноглобулина и популяции лимфицитов в испытуемых группах.