полициклические биоцидные соединения и фармацевтическая композиция на их основе

Формула изобретения

1. Полициклические биоцидные соединения формулы

ArCH₂NR,

где Ar 2-бензо[b] нафто[2,1-d]тиофен- 5-ил, 2-бензо[b]нафто[2,3-d]фуран-6-ил, 2-бензо[b] нафто[1,2-d] фуран-5-ил, 2-(7-метил-7H-бензо[c]карбазол-10-ил)метил или 2-бензо[b]нафто[2,1-d]фуран-5-ил;

R группа CH₂OH-CCH₃-CH₂OH,

монометиловые или моноэтиловые эфиры, сложные эфиры или их кислые аддитивные соли.

2. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевым действием, включающая активное вещество и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества используют соединение по п.1 в количестве 5 50 мг на дозу.

3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что активное соединение представляет собой 2-[метил-2-(7-метил-7H-бензо[c] карбазол-10-ил)метиламино]-1,3-протандиол или монометиловый моноэтиловый эфир, сложный эфир или их кислые аддитивные соли.

4. Полициклические соединения формулы ArCH=NR, где Ar и R имеют указанные значения.

Приоритет по признакам:

15.11.84 при Ar 2-бензо[b]нафто[2,1-d]тиофен-5-ил, 2-бензо(b)нафто[1,2-d] фуран-5-ил, 2-бензо(b)нафто[2,1-d]фуран-5-ил и R - группа ;

13.09.85 при Ar 2-бензо(b)нафто(2,3-d)фуран-6-ил и 2-[7-метил-7Н-бензо(c)карбазол-10-ил]метил, R группа .

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к гетерополициклическим алканоильным производным, которые обладают биоцидным действием, более конкретно к аминоалканольным производным, молекулы которых содержат гетерополициклическую кольцевую систему, к способам их синтеза, к их новым полупродуктам, к их содержащим фармацевтическим композициям и к их использованию в качестве биоцидных агентов, в частности противоопухолевых средств.

В некоторых классификационных системах с применением мышей было установлено, что два аналога нитракрина (1-нитро-9-[(3-диметиламинопропил)-амино] акридина), содержащего 2-амино-2-метил-1,3-пропандиоловую и трис-(оксиметил)-метиламиновую группы, обладают также противоопухолевым действиям.

Авторами настоящего изобретения был открыт новый класс гетерополициклических ароматических алканольных производных, которые обладают биоцидным действием.

Предлагается соединение формулы (I): ArCH₂NHR (1) его монометильный или моноэтильный эфир. Соединение формулы (1), включая сюда указанные простые эфиры, содержит в общей сложности не свыше 29 углеродных атомов, а также его сложный эфир и его соль, где Ar-6,6,6,5-тетрациклическая ароматическая кольцевая система, содержащая от 15 до 17 кольцевых атомов, пятичленное кольцо, содержащее один гетероатом, возможно замещенное одним или двумя заместителями. R содержит не более 8 углеродных атомов и представляет собой группу



Класс ароматических кольцевых систем, который охватывается рамками изобретения, может включать соединения следующих формул, где Z гетроатом

6,6,6,5-тетрациклическая кольцевая система























Z









Одна из предпочтительных групп соединений изобретения охватывает также соединения, в молекулах которых Ar-циклическая система, содержащая 15 или 17 кольцевых атомов.

Приемлемую систему, обозначенную символом Ar, можно выбрать из следующих кольцевых систем:







Один из предпочтительных классов соединений формулы (1) класс, в соединениях которого систему, обозначенную символом Ar, выбирают из нижеследующих:



Эти циклические системы отвечают нижеследующей номенклатуре:

Z NH

11-H-Бензо[a]карбазол 5-Н-Бензо[b]карбазол 7-Н-Бензо[c]карбазол

Z O

Бензо[b]нафто[L,1-d]фуран Бензо[b]нафто[2,3-d]фуран Бензо[b]нафто[1,2-d] фуран

Z S

Бензо[b] нафто[2,1-d] тиофен Бензо[b] нафто[2,3-d] тиофен Бензо[b]нафто[1,2-d]тиофен

По предпочтительному варианту боковая цепь СН₂NHR должна быть присоединена в положении:





где Z SO, NMe или NEt.

Более предпочтительный класс соединений формулы (1) класс, в соединениях которого Ar представляет собой

где Z SO, NMe или NEt.

Предпочтительно Ar представляет собой 7Н-бензо(с)карбазол-10-ил или бензо(b)нафто[2,1-d]фуран-5-ил.

Приемлемый ароматический цикл является незамещенным или содержит только один заместитель. По предпочтительному варианту ароматический цикл должен быть незамещенным.

Приемлемое соединение формулы ArCH₂NHR или его монометиловый или моноэтиловый эфир содержит в общей сложности не более 28 углеродных атомов.

Приемлемый R обозначает группу формулы:



Конкретные соединения, охватываемые формулой (1), включают:

2-[[(бензо[b] нафто[2,1-d] тиофен-5-ил) метил] амино]-2-метил- 1,2-пропандиол;

2[[(бензо[b] нафто[2,3-d] фуран-6-ил)ме- тил]амино]-2-метил- 1,3-пропандиол;

2-[[(бензо[b] нафто[1,2-d]фуран-5-ил)ме- тил]амино]-2-метил- 1,3-пропандиол;

2-метил-2-[[7-метил-7Н-бензо[c]карба- зол-10-ил)метил]амино] 1,3-пропандиол;

2-[[(бензо[b] нафто[2,1-d]фуран-5-ил)ме- тил]амино]-2-метил- 1,3-пропандиол;

их простые и сложные эфиры, а также их кислые аддитивные соли.

Соли, которые охватываются рамками изобретения, представляют собой соли соединений формулы (1), а также соли простых эфиров и сложных эфиров этих соединений.

Сложные эфиры и фармацевтически бесполезные соли соединений формулы (1) могут быть использованы в качестве промежуточных продуктов в процессах получения и очистки соединений формулы (1) и их фармацевтически приемлемых солей, вследствие чего они также охватываются рамками изобретения. Так, класс солей соединений формулы (1), которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваются ими, продукты, получаемые из неорганических (минеральных) кислот, в частности соляной, бромистоводородной, серной и фосфорной кислот, и органических кислот, в частности из этионовой (оксиэтилсульфокислоты), малеиновой, малоновой, янтарной, салициловой, винной, молочной, лимонной, муравьиной, лактобионовой, пантотеновой кислот, этансульфокислоты, бензолсульфокислоты, п-толуолсульфокислоты, нафталин-2-сульфокислоты и аскорбиновой кислоты, а также аминокислот, в частности глицина. Предпочтительными являются фармакологически и фармацевтически приемлемые соли, в частности соли, которые растворимы в растворителях, приемлемых для парентерального введения в организм, например, гидрохлориды, метансульфонаты и изотионаты.

Сложные эфиры соединений формулы (1) получают из кислот, которые хорошо известны специалистам в данной области как приемлемые для получения сложных эфиров. Обычно они представляют собой эфиры, получаемые из алкановых кислот С₁-С₆ или производных алкановых кислот, например из уксусной кислоты пропионовой кислоты, н-масляной кислоты и изомасляной кислоты. Сложные эфиры могут быть получены с использованием всех или только некоторых гидроксильных групп, содержащихся в молекулах соединений формулы (1).

Соединения формулы (1), их простые эфиры, сложные эфиры и соли могут быть получены по любому методу, известному как метод получения соединений аналогического строения. Так, например, соединения формулы (1) могут быть получены по любому из методов, указанных ниже.

1. Восстановление соединения ArCH=NR, где значения символов Ar и R определены выше, или соответствующим образом защищенных их производных с последующим удалением защитных групп, где это необходимо.

Условия реакций и реагенты для таких реакций хорошо известны специалистам. Можно создавать любые условия и использовать любые реагенты, которые не вызывают восстановления ароматической циклической системы. Конверсию соединения (II) или его соответствующим образом защищенных производных можно проводить посредством восстановительного агента с последующим удалением защитных групп, если это необходимо. Процесс восстановления удобно проводить с помощью гидрида металла, в частности литийалюминийгидрида, боргидрида натрия, цианборгидрида натрия, или каталитической гидрогенизацией, обычно посредством водорода в присутствии металлического катализатора, в частности палладия или платины или с использованием известных эквивалентных реагентов (March J. Advanced Organic Chemistry. Нью-Йорк: Макгроу Хилл, 1977, с.819-820). Такое восстановление удобно проводить с использованием соединения формулы ArCH= NR в виде его раствора в инертном растворителе или смеси растворителей, совместимых с восстановительным агентом, при неэкстремальных температурах, например 0-80^оС, обычно при комнатной температуре.

В случае применения литийалюминийгидрида и тому подобных реагентов класс приемлемых растворителей включает простые эфиры (тетрагидрофуран, диэтиловый эфир и 1,2-диметоксиэтан), возможно в присутствии углеводородного сорастворителя (толуола, бензола или гексана).

В случае использования боргидрида натрия и тому подобных реагентов класс приемлемых растворителей включает спирты (этанол, метанол или изопропанол), возможно в присутствии углеводородного сорастворителя (толуола, бензола или гексана) или эфирного сорастворителя (диэтилового эфира или тетрагидрофурана).

В случае применения цианоборгидрида и тому подобных реагентов класс приемлемых растворителей включает те, которые описаны как используемые для боргидрида натрия, и восстановление обычно проводят в присутствии кислоты, обычно ледяной уксусной кислоты или этанольного раствора соляной кислоты (Hutchins R. etc. Organic Preparations and Procedures International, 1979, 11, 201).

В случае каталитической гидрогенизации класс приемлемых растворителей включает спирты (например метанол и этанол), возможно в присутствии углеводородного сорастворителя (например толуола или бензола) или эфирного сорастворителя (например диэтилового эфира или тетрагидрофурана), возможно в присутствии кислоты (например ледяной уксусной кислоты или этанольного раствора соляной кислоты).

В том случае, когда в качестве восстановителя используют литийалюминийгидрид, обычно применяют защищенные производные соединений формулы ArCH=NR. Приемлемые защищенные группы должны быть совместимы с используемым восстановительным агентом и легко удаляемым в условиях, не приводящих к деструкции. К ним относятся, например, группы бензилового, тетрагидрофуранилового и изопропилиденового эфиров.

Часто удобно не выделять соединение формулы ArCH=NR, а проводить реакцию соединения ArCHO с соединением NH₂R, где значения символов Ar и R определены выше, и подвергать полученное таким образом соединение формулы ArCН=NR восстановлению по месту использования. Реакцию соединений ArCHO с NH₂R также удобно проводить в условиях с использованием реагентов, которые хорошо известны специалистам в данной области, например в присутствии кислоты, в частности сульфокислоты, т. е. п-толуолсульфокислоты, в среде соответствующего инертного растворителя, например ароматического углеводорода, в частности толуола, с азеотропным удалением воды, за которым следует обработка восстановительных агентов в соответствующем растворителе, в частности, этаноле или метаноле. По другому варианту соединение ArCH=NR, полученное в равновесных условиях в среде приемлемого растворителя, можно подвергать восстановлению по месту использования с помощью соответствующего восстановительного агента, в частности, цианборгидрида натрия.

Соединение формулы ArCHO может находиться в форме защищенного альдегида, например ацеталя, который в реакционных условиях выполняет функцию альдегида. Соединение ArCHO может быть синтезировано реакцией соответствующего полициклического ароматического углеводорода с формилирующим агентом, в частности с таким, который выделяется в результате реакции между тетрахлоридом олова и Cl₂CHOCH₃ или эквивалентными реагентами или с другими стандартными формилирующими реагентами с использованием процедур, которые известны специалистам в данной области например реакцией Гаттермана-Коха [CO/HCl/AlCl₃/ Cu/Cl] реакцией Гаттермана [HCN/HClZnCl₂] и реакцией Вильсмайера [POCl₃/Ph N/Me/CHO или POCl₃/Me₂NCHO]

Соединения ArCHO могут быть получены из соответствующего ароматического гетерополицикла, замещенного соответствующей функциональной группой и конверсией этой функциональной группы в альдегидную группу по известным методам. Класс подходящих функциональных групп включает СНBr, CH₃, COR¹⁹, где R¹⁹ первичная или вторичная алкильная С₁-С₆ группа, СООН или ее производное, в частности остаток сложного эфира, амида или хлорангидрида кислоты, или СN.

В том случае, когда ароматический гетерополицикл содержит заместители, ArCHO может быть получен различными методами, которые известны в органической химии, в зависимости от природы заместителя на кольце. В том случае, если заместителем является атом галогена, исходные материалы могут быть получены прямой обработкой ароматического гетерополицикла галоидирующим агентом (хлором, бромом или SO₂Cl₂) или косвенным путем, например реакцией Сандмайера Hodgson H.H. Chem. Rev. 1947, 40, 251). В том случае, если заместителем является алкил, можно провести реакцию ароматического гетероцикла с соответствующими реагентами в условиях обычной реакции Фриделя-Крафтса (Olan G.A. Triedel Crafts and Related Reactions, Vol.1-3. Ner York: Interscience, 1963-1965).

Соединения формулы NH₂R могут быть также получены по методам, известным в технике. В том случае, когда значения символа R определены выше, их можно получить реакцией NO₂R, где R группа формулы

с соответствующим альдегидом, удобнее с ацетальдегидом или формальдегидом, а затем восстановлением, удобнее с помощью водорода и металлического катализатора (например катализатора, содержащего платину) в среде соответствующего растворителя, удобнее ледяной уксусной кислоты.

2. Восстановление соединения Ar.CO. NHR, где значения символов Ar и R определены выше, а гидроксильные группы защищены с последующим удалением защитных групп с гидроксильных групп, где это необходимо. Процесс восстановления можно проводить с помощью стандартных восстановительных агентов, известных как агенты, которые используют в реакции восстановления такого типа и не восстанавливают ароматической кольцевой системы, например, гидридный реагент, в частности литийалюминийгидрид, в инертном растворителе, в частности в простом эфире, т. е. тетрагидрофуране, при неэкстремальной температуре, например 0-100^оС, обычно при температуре кипения простого эфира с обратным холодильником.

Соединение Ar. CO.NHR может быть получено реакцией соответствующей кислоты (ArCOOH) или ее соответствующего реакционноспособного кислотного производного, например галоидангидрида, кислоты, в инертном растворителе, с амином NH₂R, у которого гидроксильные группы возможно защищены, например в том случае, когда соединение NH₂R является диолом, изопропилиденовой группой.

Полученное таким образом соединение Ar.CO.NHR соответствующим образом восстанавливают по месту использования и удаляют защитные группы, если это необходимо, получая соединение формулы (1). Соединения формулы ArCOOH могут быть получены по методам, которые известны любому специалисту в данной области.

Оба альтернативных метода, приведенные выше, можно описать следующей реакционной схемой:

Ar __ ArCH₃__ ArCH

где [i] NH₂R;

[ii] водород в присутствии металлического катализатора или гидрида металла.

Соединения настоящего изобретения обладают биоцидным действием, например токсичностью в отношении некоторых живых клеток, которые вредны организму млекопитающих, например в отношении патогенных микроорганизмов и опухолей. Токсичность в отношении патогенных микроорганизмов продемонстрирована, например, действием против одного или нескольких нижеследующих типов клеток: вирусы (например, Herpes simplex 1/vero Candida albicaus грибки), простейшие (например Eimeria tenella and Trichomonas vaginalis бактерии (например Mycoplasma smeg matis and Streptococcus pyogenes и гельминты (например Nippostrongylus brasiliensis and Brugia pahangi). Противоопухолевое действие соединений формулы (1) было продемонстрировано в ряде проверочных испытаний и прежде всего по активности против асцитической лейкемии Р388/0.

Предпочтительными соединениями формулы (1) являются соединения, которые обладают противоопухолевым действием. Действие против асцитических опухолей, включая Р388/0, очевидно из наблюдений по уменьшению числа клеток опухоли в организме млекопитающих (например мышей, у которых имеются асцитические опухоли) и, следовательно, по увеличению продолжительности жизни этих животных в сравнении с животными контрольной группы, не подвергавшимся лечению, у которых имелись опухоли. Противоопухолевое действие очевидно из наблюдений по уменьшению размеров твердых опухолей после лечения млекопитающих с помощью соединений настоящего изобретения в сравнении с опухолями у животных контрольной группы, которые не подвергались такому лечению. Соединения формулы (1) проявляют также действие против мышиных опухолей, в частности против лимофидной лейкемии Р388/0, лимфоидной лейкемии 1210, меланотической меланомы В16, мастоцитомы Р815, фибросаркомы М АУ/2, аденокарциномы толстой кишки 38, рабдомиосаркомы М5076 и карциномы легких Льюиса.

Действие в одном или нескольких испытаниях на опухолях является показателем противоопухолевого действия в организме человека (Coldin A. Methods in Cancer Research ed VT Devita and H.Busch. Нью-Йорк: Академик Пресс, 1979, 16, 165)

Существуют сублинии Р388/0, которые стали резистентными к действию нижеследующих клинически применяемых агентов: цитозинарбинозид, доксорубицин, циклофосфамид, L-фенилаланиновая горчица, метотрексат, 5-фторурацил, актиномицин D-цис-платин и биохлорэтилнитрозомочевина. Соединения настоящего изобретения проявляют высокую активность против этих опухолей, обладающих такой резистентностью к действию лекарства, при осуществлении процедуры для вышеупомянутой Р388/0.

Было установлено, что соединения формулы (1) обладают действием против опухолевых клеток человека в первичных культурах легкого, яичникак, молочной железы, почки, меланомы, неизвестного primary желужка; поджелудочной железы, мезотелиомы, миеломы и/или рака толстой кишки (используемый в данном описании термин "рак" взят в качестве синонима термина "злокачественная опухоль" или более часто употребляемого термина "опухоль" во всех случаях, за исключением специально оговоренных). Это процедура, в которой было установлено, что предотвращение образования колонии опухолевых клеток, то есть репликации опухолевых клеток, посредством лекарства согласуется с клиническим противоопухолевым действием в организме человека.

Соединения формулы (1), которые обладают противоопухолевым действием, проверенным ин витро с использованием ДНК (это свойство определяют по вискозиметрическим методам с помощью процедуры (Wilson W.D.) и др. Nucleic Acids Researoh, 1954, 4, 2697), а также log P рассчитанным по методике (Hansch C. and A.Leo. Substituent Constauts for Correlation Analysis in Chemiistry and Biologi. New York, 1979), величина которого находится в интервале от -2,0 до +2,5.

Соединения настоящего изобретения могут быть использованы для лечения опухолей. Таким образом, предлагается способ лечения опухолей у животных, включая млекопитающих, в частности человека, при осуществлении которого предусматривается введение в организм клинически эффективного количества соединения формулы (1) в фармацевтически приемлемой форме по одному или несколько раз в день или по другому соответствующему графику перорально, ректально, парентерально или локальным нанесением. Кроме того, предлагается соединение формулы (1) для использования в терапевтических целях, например, в качестве противоопухолевого средства.

Количество соединения формулы (1), необходимое для достижения желаемого эффекта в качестве биологического средства, может изменяться и в конечном счете определяется практикой врача или ветеринара. Среди факторов, которые необходимо принять во внимание, включают стадию заболевания, путь введения в организм и природу образования, вес тела млекопитающего, площадь поверхности, возраст и общее состояние, а также то конкретное соединение, которое необходимо вводить в организм. Приемлемая эффективная противоопухолевая дозировка находится в интервале приблизительно 0,1-120 мг/кг живого веса, предпочтительнее 1,5-50 мг/кг, например 10-30 мг/кг. Общая ежедневная дозировка может быть использована в виде однократной дозы, разбита на несколько доз, например на 2-6 доз, которые столько не раз дают вводят в организм или же ее вводят инфузионным путем внутривенно в течение выбранного промежутка времени. Так, для млекопитающего весом 75 кг ежедневная дозировка составляет приблизительно 8 9000 мг, а типичная ежедневная доза 2000 мг. В том случае, если показаны дробные множественные дозировки, лечение обычно можно проводить введением в организм по 500 мг соединения формулы (1) четыре раза в день в виде фармацевтически полезного препарата.

Хотя активнодействующее соединение (определенное в данном описании как соединение формулы (1), его простой эфир, сложный эфир или соль) можно вводить в организм индивидуально, это активно действующее соединение предпочтительнее использовать в виде фармацевтического препарата. Композиции настоящего изобретения для медицинских целей включают активнодействующее вещество совместно с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями для него и другими терапевтическими компонентами. Носители (наполнители) должны быть фармацевтически приемлемыми в смысле совместимости с другими компонентами композиции и не оказывать нежелательного воздействия на реципиента.

Таким образом, предлагается фармацевтическая композиция, включающая соединение формулы (1) (в форме его свободного основания, простого эфира или сложного эфирного производного или же в форме фармацевтически приемлемого кислого продукта) совместно с фармацевтически приемлемым носителем для него.

Предлагается также способ получения фармацевтической композиции, в соответствии с которым предусматривается совмещение соединения формулы (1), его простого или сложного эфира, или его фармацевтически приемлемой соли с фармацевтически приемлемым носителем для него.

Предлагается также способ получения фармацевтической композиции, в соответствии с которым предусматривается совмещение соединения формулы (1), его простого или сложного эфира, или его фармацевтически приемлемой соли с фармацевтически приемлемым носителем для него.

Хотя предполагают, что противоопухолевое действие соединений формулы (1) свойственно им тогда, когда они находятся в форме свободного основания, часто удобно вводить такие соединения в организм в форме кислых аддуктов таких соединений формулы (1). К таким композициям относятся композиции, приемлемые для введения в организм пероральным, ректальным или парентеральным путями (включая подкожные, внутримышечные и внутривенные инъекции). Предпочтительными являются такие композиции, которые предназначены для введения в организм пероральным или парентеральным путем.

Такие композиции могут представлять собой препараты в дозированной форме, которые могут быть приготовлены по любому методу, хорошо известному в технике фармакопеи. При осуществлении всех таких методов предусматривается стадия совмещения активнодействующего вещества с носителем, который включает один или несколько вспомогательных компонентов. Обычно такие композиции готовят однородным или тщательным перемешиванием активно действующего вещества с жидким носителем или тонкодисперсным измельченным твердым носителем, или же и тем и другим одновременно, после чего, если это необходимо, продукт формуют в виде желаемого препарата.

Композиции настоящего изобретения, приемлемые для введения в организм через рот, могут представлять собой дискретные дозированные единицы, в частности капсулы, облатки, таблетки или лепешки, каждая из которых содержит заданное количество активнодействующего вещества, порошок или гранулы, суспензию в водной жидкости или неводной жидкости, в частности сиропы, эликсиры, эмульсии или дозированные жидкости.

Таблетки могут быть изготовлены прессованием или литьем, можно с использованием одного или нескольких вспомогательных компонентов. Прессованные таблетки могут быть изготовлены прессованием с помощью соответствующего оборудования, в котором активно действующее вещество используют в легкоподвижном виде, в частности в виде порошка или гранул, возможно смешанных со связующим компонентом, смазывающей добавкой, инертным разбавителем, поверхностноактивным веществом или диспергирующим агентом. Формованные таблетки могут быть изготовлены литьем в подходящей машине смеси порошкообразного активнодействующего вещества с любым приемлемым носителем.

Сироп можно приготовить добавлением активно действующего соединения в концентрированный водный раствор сахара, например, сахарозы, к которой можно также добавить любые вспомогательные компоненты. Такие вспомогательные компоненты могут включать вкусовые или ароматические добавки, агенты, замедляющие кристаллизацию сахара, или агенты, повышающие растворимость любого другого компонента, в частности многоатомный спирт, например глицерин и сорбит.

Композиции для ректального введения в организм могут быть выполнены в виде суппозиториев с обычным наполнителем, в частности с маслом какао.

Композиции, приемлемые для парентерального введения в организм, обычно включают стерильный водный препарат активно действующего вещества, который по предпочтительному варианту должен быть изотоническим относительно крови реципиента. Такие композиции должны представлять собой раствор фармацевтически и фармакологически приемлемого кислого аддукта соединения формулы (1), который (раствор) является изотоническим относительно крови реципиента. Так, например, такие композиции могут с успехом содержать дистиллированную воду, 5% -ный раствор декстрозы в дистиллированной воде или соль и фармацевтически и фармакологически приемлемый кислый аддукт соединения формулы (1), который обладает соответствующей растворимостью в таких растворителях, например гидрохлоридные изетионатные метансульфонатные соли, предпочтительнее эти последние.

Полезные композиции включают также концентрированные растворы или твердые материалы, содержащие соединение формалы (1), которые при разбавлении соответствующим растворителем образуют раствор, приемлемый для парентерального введения в организм, как указано выше.

Помимо вышеуказанных компонентов композиции настоящего изобретения могут включать один или несколько вспомогательных компонентов, выбираемых из класса разбавителей, буферов, ароматизирующих или вкусовых добавок, консервантов (включая антиоксиданты) и тому подобное.

Все рассмотренные растворители представляли собой продукты сорта для реакций, поэтому их использовали без дополнительной очистки, за исключением тех процедур, которые показаны ниже. Тетрагидрофуран (ТГФ) сушили перегонкой с использованием натрий-калиевого сплава в токе азота и немедленно после этого использовали. Толуол перегоняли с использованием дигидрида кальция в токе азота и хранили над молекулярными ситами 3А. В качестве химикалиев использовали продукты сорта для реакций без какой-либо дополнительной очистки во всех случаях, за исключением специально оговоренных. Полное наименование и адрес поставщиков реагентов и химикалиев приведены при первом упоминании, далее в сокращенном виде.

Препаративную жидкостную хроматографическую обработку с высокой разрешающей способностью проводили с помощью прибора Waters Prep LC. System 500 А с использованием двух 500-граммовых столбиков силикагеля (двуокись кремния) во всех случаях, за исключением специально оговоренных. Столбики двуокиси кремния, которые использовали для операций очистки, представляли собой столбики силикагеля для мгновенной хроматографии (Мерк Ко.Инк. Мерк Кемикал Дивижн. Рэхуей, штат Нью-Джерси, 07065 силикагель 60, 230-400 меш.). Воронку из спеченного стекла соответствующего объема приблизительно на 3/4 высоты заполнили силикагелем и равномерно его разместили остуживанием по наружной стенке воронки. Затем поверх силикагеля помещали кусок фильтровальной бумаги и в верхнюю часть равномерно подавали раствор материала, который необходимо очистить. Осторожным вакуумированием с помощью фильтровальной колбы способствовали быстрому продвижению элюента через столбик силикагеля. Фракцию соответствующих объемов объединяли по мере необходимости и направляли на дальнейшие манипуляции.

Аналогичные процедуры показывают температуру плавления (Т_пл.), растворителя для перекристаллизации и данные элементарного анализа (все элементы анализировали с разницей 0,4% от ожидаемой величины). Отмечены все изменения, которые касались процедуры, в частности растворителя, реакционной температуры, продолжительности реакции или обработки.

Данные ЯМР (1Н, 13С), ИК и масс-спектрограмм для всех новых продуктов соответствовали ожидаемым и предложенным структурам. Положения, которые были определены для структурных изомеров, были четко установлены рядом ПМР-спектрограмм, где 0 синглет, М мультиплет, д дублет, дд двойной дублет, т триплет, кв квартет, ш широкий. Все готовые продукты высушили в вакууме под остаточным давлением 20 мм рт.ст. при указанной температуре в течение ночи (12-16 ч).

П р и м е р 1. 2-[[бензо(b)нафто[2,1-d]тиофен-5-илметил]-амино]-2-метил- 1,3-пропандиолметансульфонат.

В круглодонную колбу, снабженную магнитной мешалкой, холодильником, термометром, ловушкой Дина-Старка, трубкой для подачи азота и барботером, загрузили 4,94 г бензо (b) нафто (2,1-d)-тиофен-5-карбальдегида (18,83 ммол, SISA фармасевтикал Лабораториз, Инк. 763 Coucord Avenul Кембридж, штат Массачусетс, 02138), 1,98 г 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола (18,83 ммоль Олдрич), 0,1 г п-толуолсульфокислоты, моногидрата и 200 мл толуола. Смесь перемешивали при температуре кипения с удалением воды в течение 2,5 ч/или до тех пор, пока не прекратилось образование воды, которую экстрагировали 3 порциями по 500 мл этилацетата. Этилацетатные экстракты собрали. Большую часть толуола далее удалили перегонкой. Затем смесь охладили в бане со льдом и разбавили 200 мл абсолютного этанола с последующим дополнительным охлаждением. В реакционную смесь в виде одной порции добавили 0,712 г (18,83 ммоль) твердого боргидрида Na (МСВ Маньюфекчуринг Кемистс, Инк. 2909 Aigheand Ave, штат Цинциннати, ОН, 45212). Далее баню со льдом удалили, реакционной смеси позволили нагреться до комнатной температуры, а затем ее перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь подкислили 10%-ной соляной кислотой и в роторном испарителе удалили растворители. Сырой твердый продукт подвергли встряхиванию в 300 мл 1 н.соляной кислоты, отфильтровали, промыли соляной кислотой, подвергли вакуумному фильтрованию до полусухого состояния и промыли 300 мл диэтилового эфира. Далее материал растворили в 200 мл метанола, профильтровали раствор и подщелачивали 1 л 1 н. раствора гидрата окиси натрия. Промывные жидкости с твердым белым материалом объединили, профильтровали, промыли тремя порциями по 500 мл насыщенного раствора хлористого натрия, высушили над 25 г карбоната калия (Маллинкродт), профильтровали и сконцентрировали в роторном испарителе с получением белого твердого продукта. Этот последний растворили в смеси 200 мл абсолютного этанола с 3 мл метансульфокислоты (99,5% Мортон Тиокол, Инк. Альфа Продактс, РО BOX 299, 152 Андовер Стрит, Данверс, штат Массачусетс, 01923), раствор профильтровали и разбавили до объема 4 л добавлением смеси диэтилового эфира с гексаном в соотношении 1: 1. Этот материал трижды перекристаллизовали из смеси этанола с гексаном в соотношении 1:3, в результате чего получили 2-[бензо(b)нафто(2,1-о)тиофен-5-илметил] -амино-2-метил- 1,3-пропандиолметансульфоната с Т_пл 221-222^оС 1Н-ЯМР (80 МН_z/d⁶-DMSO/ 8,66 (шир. С₂Н, NH), 8,66 (с, 1Н, А Но), 8,48-7,56 (м. 8Н, Az-H), 5,63 (шир.т.2Н, -ОН), 4,85 (шир. м, 2Н, AzСН₂ -) 3,77 (шир. с, 4Н-СН₂ОН), 2,35 (с, 3Н, СН₃SO₃^-), 1,39 (с, 3Н, -СН₃).

П р и м е р 2. 2-[(бензо)b(нафтол)2,3-d-фуран-6-илметил)-амино] 2-метил-1,3-пропандиол.

2А. Бензо (b) нафто (2,3-d)фуран-6-карбальдегид.

Бензо(b)нафто(2,3-dфуран) SISA подвергли формилированию в соответствии с процедурой A. Rieche и др. Chem Ber, 1960, 93,88. Посредством тонкослойного хроматографического анализа было установлено, что сырой альдегид состоит из одного изомера. Очистка хроматографической обработкой с использованием силикагеля и толуола с последующей перекристаллизацией из смеси метилендихлорида с гексаном позволила с достижением 58%-ного выхода получить чистый материал, который, как это было установлено ЯМР-спектральным анализом, представлял собой бензо(b)нафто(2,3-d)фуран-6-карбальдегид) с Т_пл 169-171,5^оС, 1Н-ЯМP (300 МН_z) (СDCl₃) 11,23 (c,1H, CHO), 9,39 (д, 1Н, J_1,2=8,8 H_z H₇), 8,51 (с, 1Н, Н₁₁), 8,01 (д, 1Н, J=6,8 H_z H₁), 7,98 (д,1Н, J_3,4= 8,2H_z H₄), 7,7 ( д.д.д, IH J_1,3 1,5 H, J_2,3 6,3H_z, J_3,4 8,3 H_z H₃), 7,61 (д,IH, J=7,8H H₁₀), 7,58-7,52 (2д,д.д. 2Н, Н_8,9), 7,41 (д.д.д. 1Н, J_1,2 7,5H_z, J_2,3=6,3H_z J_2,4-1,5H_z H₂).

2В. 2-[(бензо)b(нафто(2,3-d-фуран-6-илметил)-амино]-2-метил- 1,3-пропандиолметансульфонат.

С использованием процедуры восстановительного аминирования, которая описана в примере 1, из бензо(b)нафто(2,3-d)фуран-6-карбальдегида (2А) и 2-амино-3-метил-1,3-пропандиола (Олдрич) получили 2-[(бензо)(b)нафто(2,3-d-фуран-6-илметил)- -амино]-2-метил-1,3 -пропандиолметансульфонат, 0,4 Н₂О с Т_пл. 187-190^оC (смесь этанола с диэтиловым эфиром),

1Н-ЯМP (300 МН) (d⁶-ДМSO) 8,82 (с,1Н, Ar-H₁₁), 8,66 (шир. с, 2Н, -NH), 8,35, 8,29, 8,19, (3d, 3H, J=8H, Ar-H_1,4,10),7,78, (д,Н. J=8 H_z Ar H₇), 7,76-7,46 (м, 4Н, Ar-H_2,3,5,8,9), 5,63 (шир. ш.2Н-ОН), 4,98 (шир. м, 2Н, ArCH₂), 3,73 (шир.с, 4Н, -СН₂ОН), 2,30 (с, 3Н, СН₃SO₃), 1,38 (с, 3Н, -СН₃).

П р и м е р 3. 2-[(бензо)(b)нафто(1,2-d фуран-5-илметил)-амино]-2-метил- 1,3-пропандиол.

3А. -бензо(b)нафто(1,2-d)фуран-5-карбальдегид.

Бензо (b)нафто(1,2-d)фуран)SISA подвергли формилированию в соответствии с процедурой, описанной A. Rieche и др. в Chem Ber. 1960, 93. Посредством тонкослойного хроматографического анализа было установлено, что сырой альдегид состоит главным образом из одного изомера. Очистка хроматографической обработкой с использованием двуокиси кремния и толуола с последующей перекристаллизацией из смеси метилендихлорида с гексаном позволила с достижением 39% -ного выхода получить чистый материал, который, как это было установлено ЯМР-спектральным анализом, представлял собой бензо(b)нафто(1,2-d)-фуран-5-карбальдегид с Т_пл 143-145^оС.

1Н-ЯМР (300 МН_z) (СDCl₃) 10,50 (с, 1Н, СНО), 9,3 (д,1Н, J=7,3 H_zH₄), 8,68 (д, 1Н, J 7,3H, H₁), 8,42, (д, 1Н, J 6H_zH₁₁), 8,24 (S, 1H, H₆), 7,82-7,49 (м, 5Н, Н_2,3,8,9,10).

3В. 2-[(бензо)(b)нафто(1,2-d)фуран-5-илметил)-амино] -2-метил-1,3 -пропандиолметансульфонат.

С использованием процедуры восстановительного аминирования, которая описана в примере 1, из бензо(b)нафто(1,2-d)(фуран-5-карбальдегида (3А) и 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола (Олдрич) получили 2-[(бензо(b)нафто(1,2-d)фуран-5-илметил)-амино] -2-метил- 1,3-пропандиолметансульфонат с Т_пл. 215-217^оС (смесь этанола с диэтиловым эфиром).

1Н-ЯМР (300 МН_z) (d⁶-ДМSO) 8,94 (д.1Н,J=8H, Ar-H₁), 8,75 (шир.с, 2Н-NH), 8,63 (д. 1Н, J= 8H, Ar-H₁₁), 8,44 (д, 1Н, J=8H Ar-H₄), 8,20 (c, 1H, Ar-H₆), 7,90-7,55 (м, 4Н, Ar-H_2,3,9,10), 5,60 (ш.с. 2Н-ОН), 4,82 (шир. м, 2Н, ArOH₃^-), 3,73 (шир.с. 4Н-СН₂ОН), 2,32 (с,3Н, СН₃SO₃), 1,36 (с, 3Н-СН₃).

П р и м е р 4. 2-метил-2-[(7-метил-7Н-бензо(c)карбазол-10-ил)- метило)-амино]-1,3-пропандиол.

4А. 7-метил-7Н-бензо(c)карбазол.

6,6 г 7Н-бензо(с)карбазола (ех, РАRJ) растворили в 250 мл тетрагидрофуран в токе азота и обработали 4,2 г калий- т.бутоксида. После завершения операции растворения добавили 7,56 г диметилсульфата. Смесь перемешивали в течение нескольких минут, после чего тонкослойный хроматографический анализ с использованием двуокиси кремния и толуола показал, что реакция завершена. Реакционную смесь вылили в 2 л 1 н. раствора гидрата окиси натрия и перемешали. Полученный таким образом твердый материал собрали фильтрованием, растворяли в 300 мл толуола и подвергли пропусканию через столбик двуокиси кремния (50,8 х 50,8 мм), элюируя толуолом. Фракции, содержащие продукт, выпарили досуха, твердую массу растворили в 400 мл хлористого метилена и разбавили гексаном. Концентрирование в вакууме позволило получить 5,0 г белого твердого вещества, которое отфильтровали и промыли пентаном. Дополнительно 1,06 г продукта (общий выход составил 6,06 г, 87%) получили дополнительным выстаиванием и дальнейшим концентрированием фильтрата. Данные элементного анализа для С₁₇H₁₃N:

вычислено: C 88,28 H 5,67 N 6,06%

найдено: С 88,31 Н 5,68 N 6,01%

4В. 7-метил-7Н-бензо(с)карбазол-10-карбальдегид.

5,8 г 7-метил-7Н-бензо(с)карбазола растворили в хлористом метилене и обработали 13,0 г хлорида четырехвалентного олова в токе азота. Эту смесь охладили и добавили в нее по каплям 3,74 г альфа, альфа-дихлорметилметилового эфира. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, после чего выдержали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 15 мин. Тонкослойный хроматографический анализ с использованием двуокиси кремния и толуола показал полноту реакции. Реакционную смесь охладили, добавили в нее 300 мл воды и перемешивали в течение 2 ч. Двухфазную смесь профильтровали, выделили органический слой и выпарили его досуха. Остаток растворили в 100 мл толуола и проэлюировали через столбик двуокиси кремния (127 х 76,2 мм) с помощью толуола. Элюированный девятый литр содержал основной изомер, причем этот литр и десятый литр (элюированный дихлорметаном) объединили и выпарили досуха. Остаток растворили в 200 мл дихлорметана, профильтровали и разбавили пентаном в соотношении 1:1. Раствор выпаривали до тех пор, пока не началась кристаллизация. Добавили дополнительное количество пентана и объем уменьшили до 150 мл. Фильтрование позволило получить 3,83 указанного в заголовке продукта в виде бледно-желтого твердого вещества с Т_пл164-165^оС, чистого, как показал тонкослойный хроматографический анализ. Данные элементного анализа для С₁₈Н₁₃N:

вычислено: C 83,37 H 5,05 N 5,40%

найдено: С 83,19 Н 5,07 N 5,36%

С 3-го по 8-й литры жидкости, элюированной из столбика двуокиси кремния, объединили и выпарили досуха. Твердый материал растворили в 200 мл дихлорметана, затем разбавили 200 мл гексана. В результате выпаривания растворителя получили желтый твердый продукт, который растворили в 200 мл дихлорметана, разбавили 200 мл гексана и сконцентрировали с получением 0,55 г кристаллического желтого твердого продукта, который, как установили ЯМР-спектрографическим анализом, представлял собой 7-метил-7Н-бензо(с)карбазол-5-карбальдегид с Т_пл210-213^оС. Данные элементного анализа для С₁₈Н₁₃NO:

вычислено: C 53,37 H 5,05 N 5,40%

найдено: C 83,43 H 5,08 N 5,37%

4С. 0,3 гидрата 2-метил-2-[(7-метил-7Н-бензо(с)карбазол-10-ил(метил)-амино] 1,3-пропандиолгидрохлорид.

Указанное соединение получили по способу, аналогичному изложенному в примере 1, из 7-метил-7Н-бензо(с)карбазол-10-карбальдегида и 2-амино-2-метил-1,3-пропандиола; его Т_пл составляла 229-230^оС (с разложением, смесь метанола с диэтиловым эфиром в соотношении 1:3). Данные элементного анализа для С₂₂Н₁₅ N₂O₂ C1,0,3 Н₂О:

вычислено: C 67,70 H 6,61 N 7,18 Cl 9,08%

найдено: C 67,61 H 6,53 N 7,17 Cl 9,05% 1H-ЯМР (8МН_z) (d⁶ ДМСО) 9,2-8,97 (м, 4Н, Ar H_1,11, NH), 8,2-7,24 (м, 5Н, Ar H_2,3,5,6,9), 5,60 (шир.с. 2Н, ОН), 4,46 (шир. м, 2Н, Ar CH₂^-), 4,04 (с, 3Н, -NCH₃), 3,71 (шир.с. 4Н, -СН₂ОН), 1,34 (с.3Н, СН₃).

П р и м е р 5. 2-(бензо(b)нафто[2,1-d]фуран-5-илметил)-амино-2- метил-пропандиол.

5А. Бензо(b)нафто[2,1-d]фуран-5-карбоксальдегид.

6,15 г бензо(b)нафто(2,1-d)фурана (PARS) растворили в токе азота в 400 мл хлористого метилена. Затем в раствор добавили 14, 59 г хлорида четырехвалентного олова, после чего 4,02 г альфа, альфа-дихлорметилметилового эфира и образовавшуюся смесь перемешивали в течение ночи с последующим кипячением с обратным холодильником в течение 3 мин. Добавили 200 мл воды и смесь перемешивали в течение ночи. Органический слой отделили и выпарили досуха. Остаток растворили в 200 мл толуола и проэлюировали через столбик двуокиси кремния (88,9 х 76,2 мм) толуолом. Содержащие продукт фракции собрали, выпарили досуха, повторно растворили в 200 мл хлористого метилена, разбавили 500 мл пентана и сконцентрировали до объема 150 мл. К осадку добавили дополнительно 200 мл пентана, после чего материал отфильтровали, получив 5,0 г требуемого соединения с Т_пл. 118-121^оС. Из фильтра дополнительно выделили 0,34 г продукта. Данные элементного анализа для С₁₇Н₁₀О₂:

вычислено: С 82,91 Н 4,09%

найдено: С 83,00 Н 4,13%

Данные ЯМP-спектрограммы соответствовали такой структуре продукта.

5В. 2-(бензо)(b)нафто(2,1-d)фуран-5-илметил)-амино-метил- 1,3-пропандиол.

В соответствии со способом, аналогичным изложенному в примере 1, с использованием бензо(о)нафто(2,1-о)фуран-5-карбоксальде- гида и 2-метил-1,3-пропандиола, получили требуемое соединение в виде его метансульфонатной соли с Т_пл. 216-218^оС (смесь этанола с диэтиловым эфиром в соотношении 1:1). Данные элементного анализа для С₂₂Н₂₅NO₆S:

вычислено: C 60,23 H 5,93 N 3,19 S 7,31%

найдено: С 60,22 Н 5,93 N 3,18 S 7,30% 1Н-ЯМР (80 МН_z) (d⁶-ДМСО) 8,60 (шир. с, 2Н-NH), 8,51 (S,1H, Ar-H₆), 8,50-7,40 (м, 8H, Ar-H_{1,2,3,4,7,8,9,10}) 5,63 (шир. с. 2Н-ОН), 4,70 (шир.с. 2Н, А СН₂^-), 377 (шир.с. 4Н-СН₂ОН), 2,36 (с, 3Н, СН₃SO₃), 1,39 (с.3Н-СН₃).

Результаты испытаний на противоопухолевое действие. Методики оценки противоопухолевого действия таких соединений являются теми, которые используют в Timor Panel при осуществлении программы Development Therapeutics Program в Отделении лечения раковых заболеваний Национального института рака (Goldin A. et.al. Methods in Cancer Research. Академик Пресс, 1979, т.XVI, с.165). Для повышения эффективности испытаний в уровень дозировок и схему их введения в организм были внесены некоторые изменения.

Испытание на лимфоидной лейкемии Р388/0. В качестве подопытных животных использовали мышей СД2-F, одного пола, весом 20 3 г. В день 0 животным как контрольной группы, так и группы, которая подвергалась лечению, внутрибрюшинной инъекцией вводили суспензию 10⁶ живых клеток опухоли Р388/0. В ходе проведения каждого испытания оценивали по несколько дозировок, которые охватывают также и LD₂₀. Испытаниям на каждую дозировку подвергали группу по 6 животных. Испытываемые соединения использовали в виде препаратов либо в физиологическом растворе, который содержал 0,05% продукта Tween 80, либо в дистиллированной воде, которая содержала 5% декстрозы. Эти препараты вводили внутрибрюшинно на 1-й, 5-й и 9-й дни относительно для имплантации клеток опухоли. Дозировки рассчитывали в мг/кг в зависимости от веса каждого индивидуального животного; фиксировали день гибели каждого животного и рассчитывали средние данные для каждой группы животных групп, подвергавшихся лечению (Т), и контрольных групп (С). Критерий активности соединения определяли по формуле Т/C х 100 120% Результаты испытаний с Р388/0 суммированы в табл. 1 и 2.

Данные биологической активности сложноэфирных производных:

1) 2,2-бис(метоксиметил)-2-(((7-метил-7Н-бензо(с)карбазол-10 -ил)метокси)амино)этанол НС Оптимальная доза,

мг/кг Т/C х 100%

100 150

2) 2-(этоксиметил)-2-(((7-метил-7Н-бензо(с)карбазол-10-ил-) метил)амино)-1,3-пропандиол НС Оптимальная доза,

мг/кг Т/С х 100%

85 115

3) 3-метокси-2-метил-2-(((7-метил-7Н-бензо(с)-карбазол-10-ил) метил)амино)пропанол НС Оптимальная доза,

мг/кг Т/C х 100%

100 190

4) (1,1-бис(метоксиметил)этил)(7-метил-7Н-бензо(с)карбазол-10-ил) метил)амин НСl Оптимальная доза,

мг/кг Т/C х 100%

160 170

П р и м е р ы на композиции.

А. Таблетки, мг: Соединение формулы (1) в виде метансульфоната 500,0 Предварительно желатинизированный кукурузный крахмал 60,0 Натрийгликолят крахмала 36,0 Стеарат магния 4,0

Соединение формулы (1) тонко измельчают и гомогенно смешивают порошкообразными основами для приготовления лекарств, предварительно желатинизированным кукурузным крахмалом и натрий- гликолятом крахмала. Порошки увлажняют очищенной водой для формования гранул. Гранулы сушат и смешивают со стеаратом магния. Затем композицию подвергают прессованию с формованием таблеток весом приблизительно по 600 мг каждая.

Б. Таблетки, мг: Соединение формулы (1) 500,0 Кукурузный крахмал 70,0 Лактоза 83,8 Стеарат магния 4,2 Поливинилпирролидон 14,0 Стеариновая кислота 28,0

Соединение формулы (1) тонко измельчают и гомогенно смешивают с порошкообразными основами для приготовления лекарств, кукурузным крахмалом и лактозой. Порошки увлажняют раствором поливинилпирролидона в очищенной воде и денатурированном спирте для формования гранул. Гранулы сушат и смешивают с порошкообразной стеариновой кислотой и стеаратом магния. Затем композицию подвергают прессованию с формованием таблеток весом приблизительно по 700 мг каждая.

В. Капсулы, мг: Соединение формулы (1) 500,0 Кукурузный крахмал 50,0 Стеарат магния 3,0

Тонко измельченное соединение формулы (1) смешивают с порошкообразным кукурузным крахмалом и увлажняют денатурированным спиртом с целью уплотнить порошок. Высушенный порошок смешивают со стеариновой кислотой и этой массой заполняют полутвердые желатиновые капсулы.

Г. Сироп, мг: Cоединение формулы (1) 250,0 Этанол 250,0 Глицерин 500,0 Сахароза 3500,0 Ароматизирующая или вкусовая добавка Нужное

количество Краситель Нужное

количество Консервант 0,01% Очищенная вода Нужное

количество

до объема 5

Соединение формулы (1) растворяют в этаноле, глицерине и порции очищенной воды. В другой порции горячей очищенной воды растворяют сахарозу и консервант, затем добавляют краситель и его растворяют. Оба раствора смешивают и охлаждают, после чего добавляют вкусовую или ароматизирующую добавку. В конечную массу добавляют очищенную воду. Образовавшийся сироп тщательно перемешивают.

Д. Препарат для внутривенных инъекций.

Соединение формулы (1) (в виде метансульфоната) 5,0 мг

Глицерин Количество, необходимое

для изотоничности

Консервант 0,1%

Соляная кислота или гидрат Количество, необходимое для

окиси натрия регулирования величины рН

Вода для инъекций Количество, необходимое

до объема 1 мл

Соединение формулы (1) и консервант добавляют в глицерин и порцию воды для инъекций. Величину рН регулируют добавлением соляной кислоты или гидрата окиси натрия. Добавляют воду до достижения желаемого конечного объема и после тщательного перемешивания раствор считается готовым. Этот раствор стерилизуют фильтрованием через мембранный фильтр 0,22 мкм и в асептических условиях им заполняют стерильные 10-миллилитровые ампулы или пробирки.