способ получения очищенного димера рибонуклеазы
Классы МПК: | C12N9/96 стабилизация ферментов образованием аддукта или композиции; образование конъюгатов ферментов C12N9/22 рибонуклеазы |
Автор(ы): | Петер Херрманн[CH], Петер Клайн[CH] |
Патентообладатель(и): | Ника Хелт Продактс, Лтд. (LI), Ника Хелт Продактс, Инк. (US) |
Приоритеты: |
подача заявки:
1990-01-08 публикация патента:
20.05.1996 |
Использование: биотехнология и касается способа получения очищенного димера рибонуклеазы, который может быть использован для борьбы с вирусными и бактериальными инфекциями без цитотоксического воздействия, присущего обычно димеру рибонуклеазы. Сущность изобретения: способ включает стадии димеризации мономерной рибонуклеазы в присутствии суберимидатного соединяющего реагента, фильтрования недимеризованных мономеров и олигомеров из раствора димера применением ряда хроматографических этапов на ионообменных смолах, контроля хода реакции с помощью электрофореза на геле и сбора в качестве продукта очищенного димера рибонуклеазы. 20 з. п. ф-лы, 2 ил.
Рисунок 1, Рисунок 2
Формула изобретения
1. Способ получения очищенного димера рибонуклеазы, предусматривающий приготовление раствора рибонуклеазы добавлением мономера рибонуклеазы к буферному раствору, димеризацию мономера рибонуклеазы посредством добавления к раствору суберимидатного сшивающего реагента, причем рН раствора поддерживают на требуемом уровне, а затем остановку реакции димеризации в данный момент посредством снижения рН, очистку полученного раствора димеризованной рибонуклеазы посредством жидкостной хроматографии, элюирование и сбор фракций, содержащих целевой продукт, отличающийся тем, что значение рН указанного буферного раствора устанавливают по меньшей мере равным 9, значение рН раствора рибонуклеазы во время реакции димеризации поддерживают на уровне по меньшей мере 9, реакцию димеризации останавливают в заданный момент снижением рН до примерно 7, а очистку проводят по меньшей мере в две стадии жидкостной хроматографии полученного раствора димерсодержащих фракций, которые предусматривают пропускание раствора по меньшей мере дважды через катионообменную колонку, заполненную поперечно сшитой декстрановой смолой. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что значение рН раствора мономерной рибонуклеазы доводят до 10. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что значение рН раствора мономерной рибонуклеазы доводят добавлением NaOH. 4. Способ по п.1, отличающийся тем, что буфер, используемый в растворе мономерной рибонуклеазы, представляет собой буферный раствор дигидрата-динатрий-гидрофосфата. 5. Способ по п.1, отличающийся тем, что суберимидатный сшивающий реагент добавляют к раствору мономерной рибонуклеазы при поддержании рН раствора около 10. 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве сшивающего реагента добавляют диметилсуберимидат. 7. Способ по п.1, отличающийся тем, что димеризацию проводят при комнатной температуре. 8. Способ по п.1, отличающийся тем, что димеризацию проводят при непрерывном перемешивании раствора. 9. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию димеризации останавливают добавлением HCl. 10. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор димеризованной рибонуклеазы перед очисткой концентрируют с помощью системы с тангенциальным потоком. 11. Способ по п.1, отличающийся тем, что готовят раствор мономера рибонуклеазы из 40 60 г мономера рибонуклеазы и 4 6 л буфера, а диметилсуберимидат добавляют в количестве 4 6 г. 12. Способ по п.1, отличающийся тем, что фракции после первой стадии элюирования анализируют на содержание рибонуклеазы гель-электрофорезом. 13. Способ по п.1, отличающийся тем, что фракции, собранные после первой стадии элюирования, лиофилизируют. 14. Способ по п.1, отличающийся тем, что фракции, собранные после первой стадии элюции, рециркулируют на димеризацию. 15. Способ по п.1, отличающийся тем, что повторную очистку проводят при рН около 5. 16. Способ по п.1, отличающийся тем, что значение рН раствора на повторной стадии очистки устанавливают добавлением натрийацетатного буфера. 17. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фракции после второй стадии элюирования анализируют на содержание рибонуклеазы гель-электрофорезом. 18. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фракции после второй стадии элюции обессоливают. 19. Способ по п.1, отличающийся тем, что обессоливание проводят на колонке с поперечно сшитым декстраном G 25. 20. Способ по п.1, отличающийся тем, что полученный очищенный продукт подвергают удалению эндотоксинов. 21. Способ по п.1, отличающийся тем, что эндотоксины удаляют на колонке с детоксигелем.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к способам получения и очистки димера рибонуклеазы, которые могут использоваться для лечения вирусных и бактериальных инфекций. Все возрастающее количество бактериальных и вирусных болезнетворных штаммов с устойчивостью к известным антибиотикам вызвало необходимость во введении для лечения человека и животных лекарств нового типа. Среди применяемых в настоящее время многих новых методов лечения и лекарств для лечения больных, пораженных различными заболеваниями, получило признание введение таким больным мономерных форм ферментов. В некоторых случаях это необходимо потому, что при некоторых симптомах заболевания наблюдается снижение активности ферментов. Ферменты относятся к каталитически активным белкам, при участии которых протекают все жизненно важные процессы в организме. В силу этого многие ферменты, как в индивидуальном состоянии, так и в определенных сочетаниях выделены из-за их физико-химического, физиологического или биологического действия. К числу различных ферментов, для которых известно лечебное действие или которые снижают свою активность при определенных симптомах заболевания, относятся и рибонуклеазы. Рибонуклеазы образуют группу нуклеиновых ферментов, обычно обнаруживаемых во многих животных и растительных организмах. Изучение свойств рибонуклеазы и методов выделения этого фермента начали в середине 50-х годов Schmidt и McDonald. Среди многих открытий, связанных с этим ферментом, было и то, что раковая ткань характеризуется крайне сниженной активностью своих рибонуклеаз. В одном случае было обнаружено, что мышь с лейкозом обладает значительно пониженной активностью кислотной рибонуклеазы, наблюдаемой, в частности, в митохондриевых и микросомных фракциях, полученных из тканей селезенки животного. Исследования, подобные этим, указывают на то, что введение рибонуклеазы, возможно, удастся использовать для профилактики или для борьбы с симптомами, связанными с вирусной лейкемией. К сожалению потенциальные возможности, которые могли бы быть использованы применением рибонуклеазы, не были реализованы, в первую очередь, вследствие сильного цитотоксического действия мономерной формы этого фермента. Например, в опытах с культивируемыми фибробластами цитотоксическое действие от введения мономерной формы рибонуклеазы наблюдалось даже при чрезвычайно низких ее дозировках. Очевидно, что необходимо создать способы максимального использования потенциальных возможностей рибонуклеазы при одновременном сведении к минимуму потенциально вредного цитотоксического действия мономерной формы этого фермента. Недавно обнаружено, что из рибонуклеазы может быть приготовлена противовирусная или антибактериальная композиция, не обладающая цитотоксическим действием, если такую композицию готовят на димерной форме фермента. Применение композиций димера рибонуклеазы, как найдено, эффективно при лечении ряда инфекционных заболеваний, и в то же время не оказывает сильного цитотоксического действия, обычно связанного с мономером рибонуклеазы. Применение димеров рибонуклеазы в различных курсах лечения раскрыто в находящейся на одновременном рассмотрении заявке РСТ N 88/01785. Хотя некоторые способы получения димерной формы рибонуклеазы из ее мономерной формы известны, важное значение имеет возможность получения больших количеств димерной формы недорогим и эффективным путем. Таким образом, крайне желательно создание системы получения и анализа больших количеств очищенного димера рибонуклеазы, содержащего минимальные количества таких примесей, как мономеры, мультимеры или другие загрязняющие вещества. Согласно изобретению предлагаемый способ получения в качестве конечного продукта димера рибонуклеазы предусматривает стадииа) приготовления раствора рибонуклеазы добавлением мономерной рибонуклеазы к буферному раствору с установлением рН, по меньшей мере равным 9;
b) добавления суберимидатного (содержащего имидат пробковой кислоты) связующего средства, такого как диметилсуберимидат с целью димеризации мономеров рибонуклеазы в растворе рибонуклеазы с поддерживанием в растворе рН 9 или выше;
с) понижения рН примерно до 7 с целью прекращения реакции димеризации на данном уровне;
d) очистки раствора димеризованной рибонуклеазы проведением первого этапа фильтрования, на котором раствор пропускают через ионообменную смолу и отбирают фракции, содержащие существенные количества димерной формы рибонуклеазы;
е) проведения второго этапа фильтрования, на котором фракции, отобранные на первом этапе фильтрования, пропускают через ионообменную смолу;
f) сбора в качестве конечного продукта второго этапа фильтрования димерной рибонуклеазы высокой степени чистоты. Применением вышеприведенного способа можно приготовить в качестве конечного продукта большие количества димера рибонуклеазы, который будет чрезвычайно полезен для лечения различных вирусных и бактериальных заболеваний. Фиг. 1 и 2 графически иллюстрируют характер элюирования при ионообменной хроматографии, проводимой в соответствии с предлагаемым изобретением. При получении в соответствии с предлагаемым изобретением димерной формы рибонуклеазы в качестве исходных продуктов могут быть использованы любые доступные в настоящее время мономеры рибонуклеазы. Применяемые в предлагаемом изобретении мономеры рибонуклеазы получены от фирмы Серва Файн Биокемика, ГмбХ, Гейдельберг и имеют каталожный N 28260. Применяемые мономеры могут быть представлены рибонуклеазой А или любой другой из доступных рибонуклеаз. Мономеры рибонуклеазы готовят к реакции соединения их растворением при комнатной температуре в фосфатном буфере с получением раствора мономера рибонуклеазы. В качестве применяемого буфера рекомендуется 0,1 М буферный раствор дигидрата динатрийгидрофосфата, в котором растворяют мономер непрерывным перемешиванием раствора по меньшей мере 2 ч. Приемлемый буферный раствор получен растворением примерно 70 г дигидрата динатрийгидрофосфата примерно в 1000 мл Н2О. Хотя точные количества реагентов и растворов, применяемых в способе предлагаемого изобретения, могут меняться, тем не менее реакцию димеризации предлагаемого изобретения осуществляют применением 40 60 г мономера рибонуклеазы, растворенных в 5 л раствора дигидрата динатрийгидрофосфата в качестве буфера. Кроме того, рекомендуется установить в растворе мономера значение рН по меньшей мере 9, наиболее предпочтительно около 10. Установление рН может быть проведено добавлением 0,1 н. NaOH. Реакцию димеризации инициируют добавлением в качестве сшивающего средства суберимидата в определенном отношении к раствору мономера рибонуклеазы с установлением значения рН, равного по меньшей мере 9 или выше, предпочтительно 10 (
![способ получения очищенного димера рибонуклеазы, патент № 2060274](/images/patents/412/2060012/177.gif)
![способ получения очищенного димера рибонуклеазы, патент № 2060274](/images/patents/412/2060012/177.gif)
![способ получения очищенного димера рибонуклеазы, патент № 2060274](/images/patents/412/2060012/177.gif)
0,72 г трис-НСl (0,06 М),
0,136 г ЭДТК (III) (5 мМ),
0,18 г глицерина (10%),
5 г SDS, устанавливают рН 7,2 (добавление 90 мл воды),
10 мл бета-меркаптоэтанола (10%). Для проведения электрофореза на геле готовят 18%-ный разделяющий гель, на который наносят 3,9%-ный сбирающий гель. Раствор разделяющего геля для 18% акриламида состоит из следующих компонентов:
9 г акриламида,
0,045 г бисакриламида,
0,136 г трис-НСl с рН 8,8 (0,325 М),
0,03 г SDS,
200 мкл 10%-ного раствора персульфата аммония,
20 мкл ТЕМЕD. Раствор сбирающего геля для 3,9% акриламида состоит из следующих компонентов:
0,39 г акриламида,
10,4 мг бисакриламида,
0,125 г трис-НСl с рН 6,8,
10 мг SDS,
100 мкл 10%-ного раствора персульфата аммония,
10 мкл ТЕМЕD. SDS-PAGE получают следующим образом. Берут две стеклянные пластины размером 20 х 20 см, тщательно очищают и ополаскивают этанолом и помещают одну над другой. Двумя разделяющими полосками толщиной 1 мм (длина 20 см, ширина 1 см) обеспечивают пространство между пластинами, которое заполняют гелем. Разделяющие полоски крепят на левом и правом краях пластинок. Нижний край заделывают липкой лентой из текстиля и все три края закрепляют в зажимах. Края дополнительно герметизируют 1%-ным раствором агарозы. После затвердевания агарозы промежуточное пространство в вертикальном положении заполняют вышеприготовленным раствором разделительного геля примерно на 3 см ниже верхнего края стеклянной пластинки и пипеткой Пастера покрывают сверху слоем воды. В течение примерно 30 мин гель оказывается полимеризованным. Слой воды удаляют и край геля ополаскивают один раз вышеохарактеризованным раствором сборного геля. Затем промежуточное пространство до самого края заполняют раствором сборного геля, после чего вводят гребенку сбора образцов из Тефлона таким образом, что нижний край кармана для образца выступает примерно на 1 см над передним краем слоя разделительного геля. Спустя примерно 15 мин сборный гель оказывается полимеризован, и гребенку удаляют. Затем снимают липкую ленту из текстиля и гель в вертикальном положении присоединяют к устройству для проведения электрофореза. Буферные камеры заполняют буфером для электрофореза (6 г трис-основания (0,05 М), 28,5 г глицина (0,38 М), 1 г SDS (0,1) и 1000 мл Н2О) и карманы в геле ополаскивают один раз путем опрыскивания буфером. Образцы димера рибонуклеазы нагревают примерно 10 мин при 95оС в буферном покрытии и им заполняют контейнер или область в кармане для испытуемого образца, соответствующего карману в геле. Электрофорез ведут примерно 4 ч при 20 мА. Однако если хотят продлить электрофорез примерно на сутки, его проводят при пониженном токе в 6-8 мА. Движущийся фронт становится видимым пpи подмешивании в кроющий буферный раствор 0,02 бромфенола голубого. Электрофорез прекращают, когда движущийся фронт достигает верхнего края геля. Разделяющий гель отрезают, сушат примерно 30 мин в фиксирующем растворе и затем вновь обеспечивают в течение 2 ч в отбеливающем растворе, состоящем из 400 мл метанола, 140 мл уксусной кислоты и 2000 мл H2O. Фиксирующий раствор готовят смешиванием 500 мл отбеливающего раствора с 12 мл раствора красителя, включающего 1 г Кумасси голубого (Р250, Мерк), 50 мл Н2О и 50 мл метанола. Полосы белка делают видимыми окрашиванием вышеприведенным раствором красителя. Определение следов с применением метода SDS-PAGE показало постепенное увеличение в образцах количества димеризованной рибонуклеазы при непременном содержании в образцах также и мультимеров. Все фракции, содержащие в основном димерную форму, объединяют и концентрируют до 800 мл в тангенциальной проточной системе (Миллипор). Мембранную диафрагму вновь ополаскивают 400 мл раствора, прошедшего через мембрану, так что в итоге сохраняется общий объем раствора димера в 1200 мл. Полученный раствор лиофилизуют и хранят при 4оС до следующего этапа. Лиофилизацию проводят делением раствора порциями по 200 мл в круглодонных колбах на 500 мл. Колбы помещают в жидкий азот и вымораживают в роторном испарителе (Гейдольф VV60). Затем колбы плотно закрывают и выдерживают 30 мин при -30оС. Наконец полученный продукт лиофилизуют использованием стандартных рабочих методик. Перед следующим этапом процесса мономерную рибонуклеазу, отфильтрованную на первом этапе фильтрования, собирают и рециркулируют на димеризацию. Для этого отфильтрованные фракции, содержащие в основном рибонуклеазу в мономерной форме, объединяют и концентрируют до 4 л с помощью вышеупомянутой тангенциальной проточной системы. Затем мономерные фракции димеризуют с применением соединяющего реагента по вышеприведенной методике. После стадии соединения с применением рециркулированных мономеров по вышеприведенной методике осуществляют этап фильтрования по вышеприведенной методике с переводом рециркулированных мономеров в димерную форму. Продукты лиофилизации, полученные в первом процессе димеризации, объединяют с димерными продуктами лиофилизации, полученными из рециркулированных мономеров. Объединенную смесь лиофилизованной рибонуклеазы, полученную в результате указанных операций, затем вновь хроматографируют на Сефадексе G50F с целью лучшего отделения димеров от мономеров и олигомеров. Хроматографию проводят использованием колонки с Сефадексом G50F (Фармация) и 0,2 М буферного раствора ацетата натрия с рН 5. 0,2 М буферный раствор ацетата натрия получают растворением 27,22 г тригидрата ацетата натрия в 1000 мл воды. Хроматографию проводят в тех условиях и с применением той же аппаратуры, что и на первом этапе фильтрования. Достигнутый в этом случае характер элюирования представлен на фиг.2. На диаграмме жирной линией показано поглощение растворами рибонуклеазы при более чувствительном детектировании, чем в случае, показанном тонкой линией. В середине диаграммы при более чувствительном детектировании показан большой основной пик, соответствующий димеру, при котором имеются всего два слабых вторичных пика. SDS-PAGE анализ ферментов, отобранных из фракций пика, показал значительное накопление димеров в основном пике, если сравнивать с характером элюирования на первом этапе фильтрования. Фракции основного пика объединяют и концентрируют с помощью вышеописанной тангенциальной проточной системы. Для обессоливания собранные фракции пропускают через колонку с Сефадексом G25. Диаметр колонки 25,2 см, высота 65 см, базовый объем 32 л, и колонка работает при скорости потока 15 л/ч. Все растворы рибонуклеазы основного пика второго этапа фильтрования (максимум 5 л) наносят на колонку с Сефадексом. Обессоливание осуществляют применением 50 мМ буферного раствора гидрокарбоната аммония. Цикл обессоливания длится 90 мин, в течение которых отбирают 5 л. Остальные продукты цикла отбрасывают. Регистрируют характер элюирования и в колбу Шотта на 5 л отбирают единственный пик. Следы образца очищенного конечного продукта откладывались на графике в условиях восстановления бета-меркаптоэтанолом и в невосстановленном виде, SDS-PAGE анализ очищенного конечного продукта показал присутствие только димерной формы рибонуклеазы. Для перевода лиофилизованного белка в фармацевтически приемлемую форму необходимо из димерной рибонуклеазы удалить эндотоксины. Для этой цели очищенные димеры хроматографируют на колонке с Детоксигелем. Для достижения максимальной регенерации целевого димера рибонуклеазы необходимо применять буферные растворы со значением рН в физиологическом интервале. Этого достигают использованием солевых растворов. Растворы фермента наносят на колонку с Детоксигелем с удалением при этом вплоть до 1500 Э.Е./мл. Перед и после каждого цикла Детоксигель регенерируют 1% дезоксихолата с последующим тщательным ополаскиванием водой до тех пор, пока в промывных водах не перестанет обнаруживаться эндотоксин. Объем колонки 750 мл (диаметр 9,5 см, высота 14 см), и колонку уравновешивают 0,1 М раствором бикарбонатата аммония. Не содержащий эндотоксина буферный раствор смешивают со стерильной водой. Раствор рибонуклеазы в объеме 2 л наносят на слой геля и оставляют впитываться в гель. Затем блок элюируют уравновешивающим буфером и собирают в стерильные химические стаканы. Затем раствор направляют на лиофилизацию в стерильной круглодонной колбе. Содержание эндотоксинов в препарате определяют с помощью диагностического набора под названием "Коутест (R)" фирмы Каби-Витрум, Мюнхен. Анализ основан на активации лизата амебоцитов (ЛА), эндотоксинами (лимулис-тест). Активированный ЛА отделяет от хромогенного субстрата (S-2423) желтый краситель п-нитроанилин, и изменение в окраске определяют спектрофотометром при 405 нм в качестве меры содержания эндотоксина. Полученную в качестве продукта очищенную димерную рибонуклеазу, содержащую менее 0,1 нг/мл эндотоксинов, загружают в круглодонные колбы и лиофилизуют. Полученный продукт представляет собой раствор лиофилизованного димера рибонуклеазы высокой степени чистоты, который может храниться, пока не потребуется для дальнейшего использования. П р и м е р 2. Анализ ферментативной активности. Ферментивная активность димерной рибонуклеазы, полученной способом предлагаемого изобретения, может быть определена методом определения активности, приведенным в работе Kunitz, J. Gen. Physiol 24, 15 (1940). Определение основано на том факте, что в результате влияния рибонуклеазы на рибонуклеиновую кислоту ее спектр поглощения в УФ-диапазоне смещается к коротковолновой границе. В интервале 290-305 нм концентрация нуклеиновой кислоты уменьшается в результате гидролиза под действием рибонуклеазы. В начальной фазе реакции это уменьшение происходит линейно, и может быть использовано в качестве меры ферментивной активности. В данном случае уменьшение количества нуклеиновой кислоты определяют при 300 нм. Определение проводят при постоянной температуре 25оС, при этом используют регулируемую кювету с тем, чтобы все растворы могли быть обработаны перед использованием в течение 5 мин при 25оС. Показания снимают на спектрофотометре при 300 нм. Реакционный объем составляет 3 мл, и реакцию проводят в кювете на 3 мл при толщине слоя 1 см. Реакционную смесь готовят использованием 1,5 мл раствора рибонуклеиновой кислоты, 0,05 0,5 мл испытуемых образцов, включая фракции рибонуклеазы, и воды, добавляемой до объема 10 мл. Раствор рибонуклеиновой кислоты готовят растворением 80 мг натриевой соли рибонуклеиновой кислоты (Боэрингер) в 50 мл ацетатного буфера. Ацетатным буфером является 0,1 М ацетатный буфер с рН 5, который получают смешиванием 0,57 мл ледяной уксусной кислоты примерно с 80 мл дистиллированной воды, установлением рН 5 добавлением 1 н. NAOH и доведением объема до 100 мл добавлением дистиллированной воды с последующим фильтрованием в стерильных условиях. Растворы испытуемого образца, включая димеры рибонуклеазы, получают растворением 5 мг образца димера рибонуклеазы в 5 мл дистиллированной воды и разбавлением таким образом, что определяемое значение находится в благоприятном интервале. Растворы рибонуклеиновой кислоты и испытуемого образца смешивают в кювете и уменьшение нуклеиновой кислоты прослеживают примерно 20 мин применением спектрофотометра Спектроник 101 (Бош энд Ломб). Регистрируют характер поглощения, причем около 8 мин наблюдается линейный интервал. Реакцию продолжают при 25оС до полного ее завершения, что происходит спустя примерно 3 ч. Затем растворы вновь анализируют для определения конечных величин и измерения повторяют дважды для получения усерединенных величин. Для подсчета ферментивной активности необходимо определить затухание нуклеиновой кислоты в начале реакции (Ео) и конечное затухание (Ее) реакции в момент
![способ получения очищенного димера рибонуклеазы, патент № 2060274](/images/patents/412/2060061/916.gif)
![способ получения очищенного димера рибонуклеазы, патент № 2060274](/images/patents/412/2060061/916.gif)
![способ получения очищенного димера рибонуклеазы, патент № 2060274](/images/patents/412/2060274/2060274t.gif)
Димерные рибонуклеазы предлагаемого изобретения показали значительную ферментативную активность.
Класс C12N9/96 стабилизация ферментов образованием аддукта или композиции; образование конъюгатов ферментов