способ получения иммунного препарата

Формула изобретения

1. Способ получения иммунного препарата, включающий иммунизацию коров, выделение иммунных белков, их очистку и получение целевого продукта, отличающийся тем, что коровам в сухостойный период парентерально вводят в смеси с адьювантом вакцину, состоящую из энтеробактерий, патогенных для человека и сельскохозяйственных животных, и осуществляют отдаленную ревакцинацию той же вакциной без адьюванта в цистерну молочной железы в предотельный период и в первые дни после отела, очистку иммунных белков осуществляют до выделения глобулинов путем фракционирования спиртовым методом при низкой температуре, а получение целевого продукта осуществляют стерилизующей фильтрацией и лиофильным высушиванием до содержания глобулинов не ниже 95% причем в качестве сырья используют молоко и молозиво первых семи дней лактации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в корм коровам, начиная с предотельного периода и до седьмого дня лактации, добавляют 5-10%-ный настой или свежую траву крапивы двудомной из расчета 5-10% от массы зеленой части кормов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к способу получения иммунобиологического лекарственного препарата из молока и молозива, и может быть использовано в качестве антибактериального средства для лечения и профилактики кишечных инфекционных заболеваний и дисбактериозов кишечника, в частности, у детей.

По данным ВОЗ, диарейные заболевания во всем мире, особенно в странах Азии, Африки и Южной Америки, у детей до 2-х лет составляют от 10 до 50% а смертность от диарей достигает до 3 млн. человек ежегодно. Дисбиотические расстройства кишечника сопровождают все случаи диарей, а также являются самостоятельной нозологической формой заболеваний. Большой удельный вес занимают острые кишечные инфекции неустановленной этиологии. Поэтому в последние годы в качестве новых лечебных и профилактических средств при кишечных инфекциях (принципиально отличных от антибиотикотерапии) привлекают внимание препараты из грудного молока, содержащие специфические антитела, главным образом Ig G и Ig A, способные нейтрализовать термолабильные и термостабильные фракции токсина, а также фимбриальные факторы колонизации бактерий и обеспечить пассивную иммунологическую защиту кишечника. Важными компонентами антибактериальной защиты, обнаруженными в молоке животных млекопитающих и человека, являются неспецифические факторы такие, как лизоцим, лактоферрин, лактопероксидаза, осуществляющие ряд синергических иммунологических механизмов в кишечнике.

Известен способ получения препарата иммуноглобулина из молозива неиммунизированных млекопитающих после 30 часов past partum (з. Германии N 3924420 по кл. А61К 35/20, опубл. 31.01.91), заключающийся в разбавлении молозива водой, удалении жиров, пастеризации обезжиренного молозива, стерилизации, лиофилизации и высушивании готового продукта при распылении.

Однако терапевтическая эффективность получаемого лактоглобулина чрезвычайно низка, поскольку препарат получают из молозива неиммунизированных коров. Кроме этого, титр антител препарата также низок, что не позволяет использовать его для лечения кишечных инфекций. Препарат применим в основном для профилактических целей.

Наиболее близким по сущности к заявляемому изобретению является способ получения иммунного препарата из молока и молозива (пат. США N 4402938 по кл. А61К 39/00, опубл. 06.09.83), заключающийся во внутривыменной иммунизации копытных pre-partum специфичным антигеноподобным материалом, удалении из вымени секреторной жидкости, удалении из нее жиров, твердых частиц и выделении сыворотки. При этом сыворотку фильтруют через фильтр с порами 0,2 мкм, где отделяют большие молекулы и получают очищенную сыворотку.

Однако полученный иммунный препарат является лактосывороткой, глобулиновая часть которой составляет лишь 35 40% тогда как неиммунные белки составляют 60 65% общего белка лактосыворотки. Лечебный эффект лактосыворотки практически отсутствует против колиинфекций в случаях, когда этиологическим фактором являются патогенные бактерии, не входящие в состав вакцины, используемой для получения лактосыворотки. Лактосыворотка практически не применима для лечения кишечного дисбактериоза. Кроме этого, протеиновая часть лактосыворотки содержит ряд аллергенных белков, в том числе серальбумины, -лактальбумины, b-лактоглобулины, соответствующих их уровню в цельном молоке, что ограничивает возможность клинического использования лактосыворотки у больных с индивидуальной гиперчувствительностью к белкам коровьего молока.

В известных авторам источниках патентной и научно-технической информации не описано способа получения иммунного препарата из молозива коров путем комбинированной иммунизации (парэнтерально и внутривыменно) коров вакциной из энтеробактерий в смеси с адъювантом и без него, позволяющего выделить глобулиновую часть препарата, содержащую антитела основных классов (A, M, G) и усиливающую наряду со специфическими неспецифические факторы (бактерицидность) защиты организма.

Известные в настоящее время иммунные препараты из молока и молозива, применяемые против патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, специфичны в отношении антител и не позволяют проводить лечение инфекций, вызванных возбудителями, не входящими в состав применяемых для иммунизации коров вакцин.

Заявляемый способ позволяет получить иммунный препарат для лечения кишечных инфекций неустановленной этиологии и в случаях, когда этиологическим фактором являются патогенные бактерии, не входящие в состав вакцины, используемой для получения иммунного препарата.

Технический результат расширение спектра применения иммунного препарата при обеспечении возможностей промышленной реализации его получения.

Технический результат достигается тем, что в способе получения иммунного препарата, включающем иммунизации коров, выделение иммунных белков, их очистку и получение целевого продукта, коровам в сухостойный период парэнтерально вводят в смеси с адъвантом вакцину, состоящую из энтеробактерий, патогенных для человека и сельскохозяйственных животных, и осуществляют отдаленную ревакцинацию той же вакциной без адъюванта в цистерну молочной железы в предотельный период и в первые дни после отела, очистку иммунных белков осуществляют до выделения глобулинов путем фракционирования спиртовым методом при низкой температуре, а получение целевого продукта осуществляют стерилизующей фильтрацией и лиофильным высушиванием до содержания глобулинов не ниже 95% причем в качестве сырья используют молоко и молозиво первых семи дней лактации.

Для усиления неспецифических факторов защиты в корм коровам, начиная с предотельного периода и до седьмого дня лактации, добавляют 5 10% настой или свежую траву крапивы двудомной из расчета 5 10% от массы зеленой части корма.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводят иммунизацию коров вакциной, состоящей из патогенных бактерий, например, E. coli серотипов 026, 055, 01111, 0119 и условно-патогенных бактерий, например, B. Proteus vulgaris и B. Proteus mirabilis в сочетании с адъювантом и без него в несколько этапов: в сухостойный период парэнтерально в сочетании с адъювантом, в предотельный период внутривыменно без адъюванта, в первые дни после отела внутривыменно без адъюванта.

Осуществляют отбор молозива первых 6 8 удоев. К молозиву добавляют пепсин, отделяют казеин, фильтруют, удаляют жир и получают лактосыворотку. Затем выделяют из нее глобулиновую часть путем фракционирования спиртом при низкой температуре. Полученный раствор лактоглобулина подвергают осветляющей и стерилизующей фильтрации и лиофильному высушиванию до содержания глобулинов не ниже 95%

С целью повышения неспецифических факторов защиты в молоке в корм животным за 3 недели до отела и в первые 3 4 для после отела добавляют траву крапивы двудомной или 10% настой этой травы из расчета 5 и 10% соответственно от массы зеленой части кормов ежедневно.

В состав крапивы входит комплекс витаминов (вит. C, B₁, B₂, K более 400 биол. ед.), каротиноиды, протопорфирины, гистемин, хлорофилл, микроэлементы молибден, селен, барий, железо, фитонциды, оказывающие выраженное биостимулирующее и биосинтетическое действие в организме.

Для приготовления вакцины используют штаммы бактерий, находящихся в S-форме, типичные по морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам. Для получения необходимой микробной массы посевы культур производят на стерильные матрицы с питательной средой (pH 7,2 7,4) или с помощью глубинного культивирования на жидких белково-гидролизатных средах в ферментаторах при 37^oC в течение 18 20 часов. Каждую культуру бактерий выращивают и хранят отдельно не более 10 дней. Выращенную микробную массу инактивируют на водной бане при t 60^oC в течение 1 часа. В качестве консерванта используют 0,25% чистого свежеприготовленного фенола. Полученную вакцину контролируют на стерильность, безвредность и иммуногенность.

Посевы на стерильность образцов вакцины производят на тиогликолевую среду, которые выдерживают при t 20 22^oC и 37^oC в течение 10 дней и периодически высевают в питательный бульон с 0,5% глюкозы в среду Сабуро и микроскопируют мазки по Граму. Безвредность вакцины контролируют на 3-х белых мышах при помощи подкожного введения вакцины и контроля за состоянием здоровья и выживанием животных. Контроль иммуногенности вакцины проводят путем однократной подкожной иммунизации белых мышей следующими дозами: 510⁸; 2,510⁸; 1,25 10⁸; 0,62510⁸; 0,31210⁸; 0,156 10⁸ м. т. в объеме 1 мл изотонического раствора хлорида натрия. Через 10 дней мышей заражают внутрибрюшинно 18-часовыми культурами бактерий, входящими в состав вакцины, содержащие не менее 3-х LD₅₀ в объеме 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Параллельно ставят контрольный опыт по определению вирулентности культур. Результаты опыта оценивают по выживаемости мышей в течение 3-х дней. Иммуногенность штаммов рассчитывают по методу Кербера. Иммуногенность вакцины для E. coli и B. Proteus не должна превышать 100 млн. микробных тел.

Иммунизацию коров проводят комбинированным методом следующим образом. Первую внутримышечную иммунизацию проводят за 60 дней до отела вакциной в смеси с равным количеством адъюванта (например, гидроокисью алюминия). Вторую, третью и четвертую иммунизации проводят внутривыменно без адъюванта за 10 14 дней до отела с семидневными интервалами и последнюю иммунизацию осуществляют также внутривыменно без адъюванта на 3 день после отела.

Лактоглобулин может быть получен, например, следующим образом. Молозиво размораживают на водяной бане при 37^oC и добавляют пепсин до конечной концентрации 0,1% для створаживания и отделения казеина. Через 18 20 часов полученную лактосыворотку фильтруют через ватно-марлевый слой и сепарируют для удаления фракции жира и остатков казеина на сепараторе типа ОСБ. Отсепарированную лактосыворотку помещают в реактор с охлаждением типа "БИОР" и устанавливают pH 5,75 0,10 с помощью 1 M раствора бикарбоната натрия. Одновременно снижают температуру сыворотки до 0^oC. Для осаждения глобулинов в реактор подают 50-процентный этиловый спирт на апирогенной дистиллированной воде из расчета 1 кг 50-процентного спирта на 1 литр лактосыворотки, предварительно охлажденной в сборнике-смесителе до минус 15 - минус 20^oC. В осадителе устанавливают pH 1,75 0,1% с помощью 1 М ацетатного буфера. Осаждение ведут в течение 4 5 часов, снижая температуру смеси до минус 6 минус 8^oC и устанавливая pH 6,2 0,05 с помощью 1 М раствора бикарбоната натрия до полного формирования осадка.

Для выделения осадка лактосыворотку центрифугируют на суперцентрифуге типа СГО-100 при температуре минус 6 минус 8^oC. По окончании центрифугирования замеряют вес и объем осадка лактоглобулинов, которые могут хранить до 30 дней при t -15^oC. Полученный осадок лактоглобулина растворяют с помощью автоматического гомогенизатора до 5,5 0,1% раствора белка 0,85% раствором хлорида натрия на апирогенной дистиллированной воде, охлажденного до 2 5^oC, pH 7,1 7,2.

Осветляющую и стерилизующую фильтрацию раствора лактоглобулина проводят на фильтрующих пластинах "Владипор" типа МФА-МА N 8 и N 9 с размером пор 26

42 мкм и типа МФА N 1 с размером пор 8 14 мкм на установке УСФ-028-7М. Розлив стерильного лаклоглобулина для высушивания осуществляют во флаконы, емкостью 25,0 мл по 5,0 0,1 мл на установке типа "Магнолия". Высушивание лактоглобулина осуществляют сублимационным способом на установке типа УС-75 в стерильных условиях при t минус 40 минус 50^oC для закаливания (выдержки), при t 40^oC для процесса высушивания лактоглубулина из замороженного состояния в течение 18 20 часов от начала процесса.

Контроль целевого продукта сухого лактоглобулина проводили путем определения содержания белка колориметрическим методом по биуретовой реакции на фотоэлектрокалориметре с помощью кювет с толщиной слоя 10 мм, зеленым светофильтром и стандартным раствором белка. Содержание основного вещества - лактоглобулина определяли методом электрофореза на ацетатной пленке с буферным раствором pH 8,6, ионной силой 0,5 при градиенте потенциала от 3 до 8 В/см, силой тока 0,3 мА/см. Окраску полос проводили амидо-черным 10 В в ацетатном буфере и фотокалориметрируют на ФЭК при красном светофильтре (l= 620-650 нм).

Количественное содержание иммуноглобулинов в целевом продукте определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. В качестве стандарта использовали очищенный препарат сывороточных иммуноглобулинов. Контроль pH лактоглобулина на этапах проводили с помощью универсального потенциометра ЭВ-74 или pH-метра 1431П. Контроль стерильности лактоглобулина осуществляли методом усредненной пробы в типогликолевую среду с последующим пересевом и микроскопированием мазков по Граму. Безвредность лактоглобулина определяли на 2-х морских свинках и 3-х белых мышах, которым вводили по 5 мл растворенного 5% препарата и наблюдали в течение 7 дней за состоянием здоровья животных. Испытания на токсичность проводили на 5 белых мышах, которым вводили в хвостовую вену 0,5% мл 5% раствора лактоглобулина. Мыши должны оставаться здоровыми. Остаточную влажность лактоглобулина определяли путем высушивания точной навески в количестве 0,1 0,15 г в течение 1-го часа при t 100^oC (не более 3 1%). Растворимость лактоглобулина определяли при введении во флакон с препаратом 10 мл дистиллированной воды (не более 61 мин). Антитела к патогенным бактериям, взятым в состав вакцины, определяли в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с эритроцитарным О-диагностикумами, приготовленными по методу Вестфаля, с эритроцитами барана, сенсибилизированными по методу Бойдена. В качестве контроля использовали стандартные иммунные сыворотки к эталонным штаммам бактерий. Содержание общего белка и белковых фракций в целевом продукте иммунном лактоглобулине, полученном по описанному выше способу, представлено в таблице 1.

Содержание иммуноглобулинов основных классов: G, A и M в целевом продукте лактоглобулине, полученном по описанному способу из молозива и молока первых 6 удоев, представлено в таблице 2. Уровень антител лактоглобулина приведен в таблице 3.

Эффективность действия полученного целевого продукта подтверждается примерами клинических испытаний.

Пример 1. Проводили лечение детей в возрасте от 2-х месяцев до 1 года, больных колиинфекцией, обусловленной энтеропатогенными E. coli, со средней тяжестью течения болезни. Детей распределили на 3 группы: однородных по возрасту, тяжести течения болезни, методам смешанного и искусственного вскармливания:

1-я группа дети, больные колиинфекцией, вызванной энтеропатогенными E. coli серотипов 026, 055, 0111 и 0119, входящими в состав вакцины (12 чел.), леченные лактоглобулином;

2-я группа дети, больные колиинфекцией, вызванной энтеропатогенными E. coli серотипов 09, 018, 044, 0114, 0125, 0142, 0151, не входящими в состав вакцины (12 человек), леченные лактоглобулином;

3-я группа дети, больные колиинфекцией, вызванной энтеропатогенными E. coli серотипов обеих перечисленных групп, не получали лактоглобулина, принимали плацебо и необходимое медикаментозное лечение, включая антибиотики и симптоматические средства (контрольная).

Об эффективности лечения судили по исчезновению энтеропатогенных кишечных палочек при посевах из испражнения в течение 1 2 недель от начала болезни, нормализации стула и общего клинического состояния больных.

Для определения аллергической чувствительности к коровьему лактоглобулину учитывали соответствующие клинические проявления, количество зозинфилов крови и ставили реакцию дегрануляции тучных клеток крови крыс с сывороткой крови больных и лактоглобулином.

В результате клинических наблюдений установлено, что лечение лактоглобулином оказалось полным и высокоэффективным у больных первой группы и сопровождалось исчезновением явлений интоксикации, нормализацией стула и исчезновением энтеропатогенных E. coli из испражнений на первой неделе от начала болезни. Клинические результаты лечения оказались позитивными и у больных 2-й группы, однако исчезновение патогенных эшерихий из испражнений у них происходило на 2-й неделе от начала болезни. У детей контрольной группы, не получивших лактоглобулина, клиническое улучшение наступало лишь на 2-й и 3-й неделе, а патогенные E. coli продолжали высевать из испражнений вплоть до 3-й недели от начала болезни. У 9 из 14 детей данной группы наблюдались рецидивы инфекции. Клинические результаты лечения представлены в таблице 4.

Таким образом, на примерах первых двух групп больных видно, что целевой продукт лактоглобулин оказывается эффективным не только в отношении энтеропатогенных E. coli, входящих в состав вакцины, но и других серотипов энтеропатогенных кишечных палочек благодаря содержанию в нем как специфических (антитела), так и неспецифических (бактерицидной) факторов иммунитета.

Ни у одного из больных, принимавших лактоглобулин, не отмечено каких-либо клинических симптомов непереносимости и сенсибилизации к коровьему белку лактоглобулина.

Пример 2. Клиническую эффективность целевого продукта иммунного лактоглобулина определили при лечении кишечного дисбактериоза у детей, обусловленного бактериями протея, а также цитробактора, клебсиелл, энтеробактериа и другие. О специфическом антибактериальном действии лактоглобулина судили по исчезновению и уменьшению в испражнениях путем посевов количества B. Proteus vulgaris et B. Proteus mirabilis, входящих в состав вакцины; о неспецифическом действии судили по исчезновению других условно-патогенных бактерий, не входящих в состав вакцины. Под наблюдением находилось 78 детей опытной группы, которым в течение 14 21 дня давали лактоглобулин из расчета 10,0 10% раствора белка на прием за 20 мин до еды 2 - 3 раза в день. Детям контрольной группы (30 человек) давали плацебо (глюконат кальция) по той же схеме, что и лактоглобулин, а также симптоматические средства. Для выявления аллергологической непереносимости к белку коровьего лактоглобулина отмечали клинические признаки, количество зозинофилов крови, и ставили реакцию дегрануляции тучных клеток крови крыс с сывороткой крови больных и лактоглобулином. Клинические результаты лечения представлены в таблице 5.

Показатели бактериологической эффективности лечения представлены в таблицах 6 и 7.

Полученные данные показывают, что лечение лактоглобулином оказывает специфическое действие в отношении протея за счет антител, полученных в процессе вакцинации коров, а также неспецифическое действие в отношении условно-патогенных бактерий (цитробактера, клебсиелл, энтеробактера), которые не входили в состав вакцины и обусловлены неспецифическими защитными факторами. Лактоглобулин оказывает также заметное нормализующее действие на состав облигатной микрофлоры, что подтверждается тенденцией к увеличению количества лакто- и бифидобактерий.

Таким образом, предлагаемый способ может быть использован для получения целевого продукта иммунного лактоглобулина. Благодаря высокому содержания специфических антител и неспецифических факторов антибактериальной защиты целевой продукт может широко применяться для лечения детей, больных кишечной инфекцией, в частности колиинфекцией и дисбактериозом, обусловленными энтеропатогенными условно-патогенными бактериями как входящими, так и не входящими в состав вакцины, а также с целью профилактики указанных заболеваний. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5