способ диагностики клещевого энцефалита

Формула изобретения

Способ диагностики клещевого энцефалита путем исследования крови больных, отличающийся тем, что в крови определят наличие РНК вируса клещевого энцефалита путем гибридизации биотин-меченого продукта амплификации ДНК-копии генома вируса с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на лавсановой пленке, с последующей пришивкой конъюгата и обнаружения комплекса биотин-стрептовидин-щелочной фосфатазы, и при появлении на пленке цветной реакции диагностируют клещевой энцефалит.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для диагностики клещевого энцефалита (КЭ).

Известен способ диагностики КЭ, основанный на определении вирусспецифических белков с помощью иммуноферментного анализа (О.В.Наволокин Иммуноферментный метод при излучении клещевого энцефалита: Автореф. дис. канд. мед. наук. Томск, 1987). Однако особенности техники ИФА не позволяют использовать его для исследования крови больных.

Известен также способ диагностики КЭ, основанный на выявление РНК вируса в реакции молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) с ³²P-меченным плазмидным зондом (заявка N 4861877/14, положительное решение ВНИИГПЭ от 27.09.91 г. ). Однако, использование его ограничено необходимостью работы с радиоактивным изотопом.

Задача изобретения: ранняя диагностика и повышение точности способа исключения радиоактивной опасности.

Достигаемый технический результат: усовершенствование лабораторной диагностики КЭ, повышение диагностической эффективности способа, избавление от необходимости работы с радиоактивным изотопом, сокращение времени исследования по сравнению с радиоактивным вариантом гибридизационного анализа. Высокая специфичность олигонуклеотидов, использованных в качестве праймеров и зондов, позволяет одновременно с индикацией возбудителя осуществлять его идентификацию, что обеспечивает экспрессную и раннюю диагностику КЭ.

Для решения поставленной задачи способ предусматривает выделение очищенных стандартизованных препаратов вирусной РНК из крови больных, амплификацию ее в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с биотинилированными праймерами, гибридизацию с олигонуклеотидными зондами, иммобилизованными на твердой подложке, и выявление биотина по цветной реакции.

Способ осуществляют следующим образом.

Из исследуемой крови выделяют суммарную РНК, подвергают ее реакции обратной транскрипции с целью получения ДНК-копии (кДНК) вируса КЭ. Затем кДНК множат в ПЦР с биотинилированными праймерами, комплементарными консервативному району генома вируса КЭ. Продукт ПЦР наносят на лавсановую пленку, к которой ковалентно пришиты олигонуклеотидные зонды, специфичные для вируса КЭ, и осуществляют реакцию гибридизации. Отгибридизированную пленку инкубируют с конъюгатом стрептавидин щелочная фосфатаза и проявляют с помощью субстрата. По появлению окраски, соответствующей накоплению продукта реакции щелочной фосфатазы с субстратом, делают заключение о наличие РНК вируса КЭ в крови больного и диагностируют КЭ.

Пример. Обнаружение РНК вируса КЭ в крови больных. Выделение РНК.

Кровь для исследования в количестве 250 мкл вносят в стерильную полипропиленовую пробирку с раствором натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) до конечной концентрации 8 mM с целью предотвращения свертывания. Затем к пробе добавляют 250 мкл раствора, содержащего 0,5% додецилсульфата натрия и 50 mM ацетата натрия pH 5,2, а также 500 мкл фенола (60^oC), насыщенного 10 mM раствором ацетата натрия до pH 5,2. Смесь инкубируют на водяной бане в течение 15 мин при 60^oC, периодически встряхивают, охлаждают 15 мин при -20^oC, центрифугируют, отбирают 200 мкл водной фазы и помещают в чистую пробирку. Добавляют 600 мкл перегнанного этилового спирта, встряхивают и осаждают РНК при -40^oC в течение 1 часа. Затем образцы центрифугируют при 8000 10000 об/мин, водно-спиртовую фазу удаляют, а осадок промывают спиртом и растворяют в 40 мкл стерильной бидистиллированной воды.

Реакция обратной транскрипции.

В пробирку помещают 20 мкл полученного раствора, добавляют равный объем 0,125 M раствора KCl, 1 мкл биотинилированного прямого праймера (исходная концентрация 10 о. е./мл) инкубируют на водяной бане при 100^oC в течение 3 мин (для денатурации РНК). Затем пробирку со смесью помещают на водяную баню 42^oC на 15 мин (для отжига затравки и матрицы), сразу добавляют 1 мкл фермента обратной транскриптазы (25 50 е.а.) и 10 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 mM dATP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dCTP, 2,5 mM MnCl₂, 0,15 M трис-HCl pH 8,1. Реакцию обратной транскрипции осуществляют в течение 30 мин при 42^oC, затем пробирки помещают на 1 мин в кипящую баню для инактивации фермента.

Полимеразная цепная реакция.

По окончании синтеза кДНК к пробе добавляют 1 мкл биотинилированного обратного праймера (исходная концентрация 10 о.е./мл), 6 мкл H₂O и 40 мкл реакционной смеси, содержащей 1,3 mM dATP, 1,3 mM dTTP, 1,3 mM dGTP, 1,3 mM dCTP, 0,63 mM MnCl₂, 0,19 M трис-HCl pH 8,2, 0,092 M KCl, 10,2 mM дитиотриетол, 0,43 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. После отжига затравки и матрицы при 100^oC в течение 1 мин пробирку переносят на водяную баню 50^oC, добавляют 1 мкл термостабильной ДНК-полимеразы (2 5 е.а.) и каплю очищенного парафина для предотвращения испарения. ПЦР ведут в следующем режиме: 95^oC 0,6 мин (денатурация), 55^oC 1 мин (отжиг матрицы и праймеров), 70^oC 2 мин (ферментативная реакция). Всего осуществляют 25 таких циклов.

Исследуемые образцы (продукты амплификации) денатурируют в присутствии 0,2 H NaOH на кипящей бане в течение 5 мин, затем охлаждают во льду, щелочь нейтрализуют добавлением трис-HCl pH 7,5 до конечной концентрации 0,5 M.

Реакции гибридизации.

Вначале осуществляют предгибридизацию. Активированную лавсановую пленку с пришитыми к ней зондами, комплементарными внутренним районам амплификата, блокируют в буфере Б, содержащем 1 M NaCl, 0,05 M трис-HCl pH 7,5 и 100 мкг/мл ДНК молок лосося, на бане с качалкой при 52^oC в течение 1 ч.

Пленку сушат на воздухе, помещают в чашку Петри на смоченную в гибридизационном буфере фильтровальную бумагу и наносят денатурированные амплификаты по 1,5 2,0 мкл. Реакцию гибридизации проводят при 52^oC в течение 30 мин на бане с качалкой. Затем пленку отмывают трижды по 20 мин при комнатной температуре с помощью буфера A, содержащего 0,5 M NaCl, 0,1 M трис-HCl pH 7,5, 0,05% твин-20. Далее осуществляют блокировку пленки в растворе 1% желатина и 0,2% казеина в буфере A в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем в этот раствор добавляют конъюгат стрептавидинщелочная фосфатаза (конечная концентрация 1,5 мкг/мл) и инкубируют 1 ч при комнатной температуре. Отмывку пленки от остатков непрореагировавшего конъюгата осуществляют в растворе 1% желатина и 0,2% казеина в буфере A трижды по 10 мин и дважды по 30 мин при комнатной температуре.

Для проявления пленки навески 0,5 мг 5-бром-4-хлор-индолил фосфата и 1,0 мг нитротетразолиевого синего растворяют каждый в отдельной пробирке в 10 мкл диметилформаида и вносят в 2,5 мл буфера, содержащего 0,1 M трис-HCl pH 9,0, 1 mM MgCl₂, 0,1 mM ZnCl₂, 0,1 M NaCl, в эту смесь помещают пленку и оставляют на ночь в холодильнике на +4^oC. По окончании проявления пленку промывают дистиллированной водой.

В качестве положительного контроля используют РНК, выделенную из мозга мышей, зараженных лабораторным штаммом вируса КЭ; в качестве отрицательного

РНК мозга интактных мышей. Постоянными отрицательными контролями также служат биотинилированные праймеры, которые наносят на пленку в количестве 1 мкл (концентрация 10 о. а. /мл). Появление окраски, соответствующее накоплению продукта реакции фермента с нитротетразолиевым синим и 5-бром-4-хлор-индолилом, свидетельствует о присутствии РНК вируса КЭ в исследуемом образце.

Заявляемый способ апробирован на 30 пробах крови, полученных от 30 больных. Использование нерадиоактивного варианта МГНК с процедурой ПЦР позволило при однократном обследовании больных подтвердить диагноз КЭ в 71,4% случаев, в то время как при исследовании в радиоактивном варианте гибридизационного анализа без ПЦР в 50,9%