способ дифференциальной диагностики сублейкемического миелоза и истинной полицитемии

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики сублейкемического миелоза и истинной полицитемии путем исследования функции нейтрофилов, отличающийся тем, что проводят постановку цитохимических реакций по определению в нейтрофилах активности миелопероксидазы, НАД-оксидазы и содержание катионных белков, рассчитывают суммарную цитохимическую активность на абсолютное число сегментоядерных нейтрофилов и при ее величине 10,3 и ниже диагностируют сублейкемический миелоз, а при величине 10,4 и выше истинную полицитемию.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности, к гематологии.

Эритроцитемическая фаза сублейкемического миелоза и начальная стадия истинной полицитемии имеют сходные морфологическое /эритроцитоз, гиперплазия гранулоцитарного ростка, тромбоцитоз, омоложение лейкоцитарной формулы/ и клинические /цианоз кожных покровов, плеторический синдром, увеличение размеров паренхиматозных органов/ признаки.

Сходство клинических и морфологических проявлений сублейкемического миелоза и истинной полицитемии затрудняет проведение дифференциальной диагностики этих заболеваний. В то же время необходимость точного разграничения этих заболеваний продиктована различной тактикой терапии.

Наиболее широко распространенным способом диагностики сублейкемического миелоза и истинной полицитемии является изучение костно-мозгового кроветворения по данным трепанобиоптатов подвздошной кости / Теодорович В.П. Абдулкадыров К. М Трепанобиопсия костного мозга при некоторых гематологических заболеваниях. Л. Метод. рекомендации, 1977; Н.Н.Коцюбинский, Н.С.Петров Дифференциальная диагностика истинной полицитемии. В кн. Новые достижения в диагностике и лечении нелимфоцитарных лейкозов: Тез. докл. Рига, 1983. c. 139-140/.

Однако гематологам-клиницистам хорошо известно, что у больных полицитемией возможно развитие вторичного миелофиброза, что значительно снижает диагностическую ценность трепанобиопсии.

Наиболее близким к заявляемому способу дифференциальной диагностики являются методы, основанные на функциональном зондировании нейтрофилов крови /З. В. Шницар. Значение иммунных комплексов и характеристика бластных клеток при хронических миелопролифератных заболеваниях. Автореф. дис. канд. мед. наук. Киев, 1983, 22 с./. Полученные результаты свидетельствуют о повышении активности миелопероксидазы как при сублейкемическом миелозе, так и при истинной полицитемии. Кроме того, выявлено повышение содержания формазанположительных нейтрофилов, более выраженное при истинной полицитемии. Несмотря на выявленные различия в функциональной активности нейтрофилов при этих патологиях, метод имеет недостатки, значительно снижающие его дифференциально-диагностическую ценность. Так, активность миелопероксидазы отражает лишь конечную стадию активации нейтрофилов, а подсчет количества формазан-положительных нейтрофилов /HCT-реакция/ олиферативных заболеваниях в большом проценте случаев дает недостоверные результаты, вследствие наличия "ложноположительных" данных. Кроме того, недостатком подобных работ является фактологическая константация изменения функциональной активности нейтрофилов без разработок их изменений для проведения дифференциальной диагностики этих заболеваний.

Целью предполагаемого изобретения является повышение точности дифференциальной диагностики для раннего назначения патогенетического лечения миелопролиферативных заболеваний.

Поставленная цель достигается тем, что проводят постановку цитохимических реакций на определение активности в нейтрофилах периферической крови миелопероксидазы, НАДФ-оксидазы и катионных белков, рассчитывают их суммарную активность на абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов и при ее величине 10,3 и ниже диагностируют сублейкемический миелоз, а при величине 10,4 и выше истинную полицитемию.

Способ осуществляют следующим образом.

При поступлении больного в клинику наряду с общепринятыми гематологическими методами обследования проводят забор периферической крови. Готовят мазки крови и мазки фиксируют следующим образом: 60% раствором ацетона /в течение 60 секунд/ для определения активности НАДФ-оксидазы, 5% раствором сульфосалициловой кислоты в течение 1 минуты для определения содержания катионных белков и в парах 40% раствора формалина для определения активности миелопероксидазы. Мазки промывают дистиллированной водой, высушивают и на них наносят инкубационную смесь.

1. Определение активности миелопероксидазы проводят по методу Zoile /1936/. При комнатной температуре на мазки крови наносят смесь, состоящую из:

40^o этилового спирта 10 мл

3% раствора перекиси водорода 0,02 мл

бензидин 40 мг

Через 10 минут мазки промывают проточной водой, высушивают и микроскопируют. Активность миелопероксидазы /МПО/ рассчитывают с помощью среднего гистохимического коэффициента /СГК/.

2. Определение содержания катионных белков /КБ/ в цитоплазме нейтрофилов проводили по методу М.Г.Шубича /1978/. На фиксированные мазки наносили на 2 минуты 0,1% раствор бромфенолового синего в 0,05 M боратном буфере /pH 8,2/. Затем мазок крови промывали в 3-х сменах того же буфера, просушивали и микроскопировали его. Содержание катионных белков выражали в условных единицах с вычислением среднего гистохимического коэффициента /СГК/.

3. Активность НАДФ-оксидазы в нейтрофилах определяли по методу Novikoff, Maser /1958/: после фиксации мазков на них наносили на 2 часа при 37^oC инкубационную смесь следующего состава:

НАДФН₂ 4 мг

0,1 M фосфатный буфер /pH 7,4/

0,8 мл

HCT /1 мг/мл/ 1,0 мл

Дистиллированная вода до 2,0 мл

После промывания мазков дистиллированной водой, высушивания и докрашивания ядер клеток проводили микроскопирование. Активность НАДФ-оксидазы определялась в виде отложений гранул диформазана в цитоплазме нейтрофилов и выражалась в единицах активности /средний гистохимический коэффициент/.

Оценку цитохимических реакций проводили на основании подсчета 100 нейтрофилов с учетом интенсивности окраски в цитоплазме по четырехбальной системе. Интенсивная окраска соответствовала высокому /+++/, средняя /++/ - умеренному, слабая /+/ незначительному содержанию вещества в клетке. Отрицательная обозначалась как 0. Средний гистохимический коэффициент /СКГ/ вычисляли по формуле /Astaldi, Verga, 1957/:

СГК 3А + 2Б + 1В + ОГ/100,

где: цифры 3, 2, 1, 0 степень интенсивности окраски / от +++ до 0/, буквы число клеток с той или иной интенсивностью окраски. Цифра 100 в знаменателе число подсчитанных клеток.

Примером конкретного осуществления способа могут служить выписки из истории болезни.

Пример 1. Больная 3-на /N ист. болезни 626-143/ поступила в гематологическое отделение с жалобами на повышенную утомляемость, головные боли, боли сжимающего характера в области сердца. При объективном исследовании: цианоз кожных покровов.

В анализе крови: эритроцитоз /5,9х10¹²/л/, повышение содержания гемоглобина 180 г/л. Количество лейкоцитов 4,7х10⁹/л, содержанием сегментоядерных нейтрофилов 53% Активность миелопероксидазы составила 2,52; НАДФ-оксидазы 0,7; содержание катионных белков 1,12. Суммарная цитохимическая активность на абсолютное количество сегментоядерных нейтрофилов составила 10,81. При исследовании трепанобиоптата подвздошной кости определялись участки миелофиброза. При исследовании НСТ-реакции количество формазан-положительных нейтрофилов составило 25% /способ-прототип/. В дальнейшем больная наблюдалась в гематологическом отделении. Продолжал нарастать эритроцитоз, отмечалось периодическое повышение гемоглобина. В течение 7 лет больная наблюдается в гематологическом отделении диагноз истинной полицитемии подтвержден клиническими и гематологическими методами.

Пример 2. Больная Б-ко, /N ист. болезни 6719-545/ поступила в гематологическое отделение 9/IV-88 года с жалобами на повышенную утомляемость, чувство тяжести в левом подреберье, головные боли, В анализе крови: эритроцитоз 6,0x10¹²/л, повышение содержания гемоглобина 190 г/л, нормальное содержание лейкоцитов 5,2x10⁹/л. Данные трепанобиоптата - очаги миелофиброза. При исследовании ферментативной активности получены следующие данные: активность миелопероксидазы 2,12; НАДФ-оксидазы 0,58; содержание катионных белков 1,09. Суммарная цитохимическая активность на абсолютное количество нейтрофилов /2,704x10⁹/л/ составила 10,24. НСТ-реакция 22%

В дальнейшем у больной отмечено постепенное увеличение размеров селезенки, нормализация, а затем и снижение показателей красной крови, то есть диагностированы клинические и гематологические признаки сублейкемического миелоза.

Экспериментально-клиническое изучение способа проведено на кафедре терапии и гематологии на 20 больных сублейкемическим миелозом и 21 больном истинной полицитемией.

Дифференциальная диагностика у этих больных проведена различными способами: по данным трепанобиопсии /архивный материал и собственные данные / базовый способ /; по результатам определения НСТ-реакции / способ-прототип/; по определению суммарной цитохимической активности абсолютного количества нейтрофилов /предлагаемый способ/.

По данным архивного материала и литературы, диагностические возможности трепанобиопсии при миелопролиферативных заболеваниях снижены приблизительно / по данным разных авторов/ от 15 до 20% случаев. Кроме того, трепанобиопсия является травматичным для больного методом, интерпретацию результатов трепанобиопсии обычно проводят через 10 дней.

При исследовании НСТ-реакции у 10 /29,26%/ больных миелопролиферативными заболеваниями обнаружены практически одинаковые результаты. При использовании предлагаемого способа по результатам наблюдения за больными в динамике в течение 4 5 и более лет, ошибка в диагнозе составила 9,7% /4 больных.

Таким образом, эффективность дифференциальной диагностики по сравнению с базовым способом была повышена в 1,5 2 раза, а по сравнению со способом-прототипом в 2,5 раза.

Литература

1. Н. Н. Коцюбинский, Н.С.Петров Дифференциальная диагностика истинной полицитемии: В кн. Новые достижения в диагностике и лечение нелимфоцитарных лейкозов: Тез.докл. Рига, 1983, c.139 140.

2. Теодорович В.П. Абдулкадыров К.М. Трепанобиопсия костного мозга при некоторых гематологических заболеваниях. Л. Метод. рекомендации, 1977.

3. Шницар З. В. Значение иммунных комплексов и характеристика бластных клеток при хронических миелопролиферативных заболеваниях: Автореф. дис. канд.мед.наук. Киев, 1983, 22 с.

4. Шубич М.Г. Выявление катионного белка в цитоплазме лейкоцитов с помощью бромфенолового синего // Цитология, 1974, N 10, c. 1321 1322.

5. Astaldi G. Verga Z. Jhe glycogen contet of the cells of lymphatic leukaemia // Acta Haemat. 1957, V.17, p. 129 131.

6. Zoele W. Eine danerfarbung der Oxydasen in myelodischen Zeukocyten in Blutansstrich // Dtsch. med. Wochensehr. 1936, V.62, 38, p.2004 2008.

7. Novikoff A. B. Masek B. Iurvivae of Lactic dehydrogenase aud DPNH-diaphorase activities after formoe-calcium fixation // J. Histochem. Cytochem, 1958, V.6, N 3, p.217.