способ получения конъюгатов белков с полиалкиленоксидами

Формула изобретения

Способ получения конъюгатов белков с полиалкиленоксидами путем восстановительного алкилирования -аминогрупп белка в водной среде алкилирующим агентом с последующей очисткой продукта, отличающийся тем, что в качестве алкилирующего агента используют моноальдегид блоксополимера окиси этилена и окиси пропилена общей формулы



где R C₁ C₅-алкил,

n 14 40,

m 20 35,

а очистку проводят осаждением избытка полимерного реагента насыщенным водным раствором -циклодекстрина.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к белковой инженерии, в частности к способу получения конъюгатов блоксополимеров окиси этилена и окиси пропилена (проксанолов) с белками, которые могут быть использованы в качестве агентов, способных проникать через биологические мембраны, а также в качестве солюбилизирующих агентов при изготовлении новых лекарственных форм.

Известен способ получения конъюгатов белков с полиэтиленгликолем (ПЭГ), заключающийся в восстановительном алкилировании -аминогрупп белка в водной среде моноальдегидом ПЭГ с последующей очисткой продукта методом гель-фильтрации.

К недостаткам этого способа можно отнести невозможность получения соединений, содержащих в своем составе полипропиленоксидный блок, и обладающих мембранотропными свойствами и солюбилизирующей способностью по отношению к нерастворимым биологически активным веществам.

Для устранения указанных недостатков был предложен новый алкилирующий агент на основе блок-сополимера окиси этилена и окиси пропилена (проксанола). Использование данного алкилирующего агента потребовало разработки процедуры очистки продукта от избытка полимерного реагента.

Задача изобретения разработка удобного и простого способа получения конъюгатов белков с полиалкиленоксидами, в том числе с проксанолами, которые обладают мембранотропными и солюбилизирующими свойствами, при сохранении нативной структуры белковой глобулы.

Способ состоит в восстановительном алкилировании e-аминогрупп белка в водной среде моноальдегидными производными блок-сополимеров окиси этилена и окиси пропилена (см. схему 1), с последующей очисткой продукта.

Очистку проводят осаждением избытка полимера насыщенным водным раствором -циклодекстрина. Осадок удаляют фильтрацией или центрифугированием.

В качестве белкового компонента использовались гидрофильные белки a-химотрипсин (a-ХТ), супероксиддисмутаза (СОД), цитохром С (ЦХ-С) и бычий сывороточный альбумин (БСА).

Второй компонент моноальдегиды проксанолов различного состава и молекулярных масс были получены по следующей методике. 50 мл 5% раствора полимера в чистом сухом хлороформе перемешивали с 2,5 г оксида марганца (IV) в течение 5 суток при температуре 20^oС. Затем оксид марганца отфильтровывали на стеклянном фильтре, и раствор упаривали на роторном испарителе. Содержание альдегидных групп в полимерах определяли спектрофотометрически (l=1735 см^-1).

Пример 1 Получение конъюгата a-химотрипсина (a-XТ) и проксанола.

К 2,5 мл раствора белка (810^-4 м) в 0,1 М боратном буфере, рН 8,4, добавляли при перемешивании 2,5 мл раствора моноальдегида проксанола ( R С₄H₃, n 14, m 20 ) в боратном буфере (15-50-кратный мольный избыток по отношению к белку). Реакционную смесь выдерживали при 20^oС в течение двух часов, затем добавляли 10 100-кратный мольный избыток цианборгидрида натрия при непрерывном перемешивании, и смесь выдерживали еще 30 мин. Затем добавляли насыщенный водный раствор b-циклодекстрина до прекращения выпадения осадка, смесь выдерживали 30 мин, затем осадок отделяли центрифугированием. Проводили диализ раствора для удаления остатков b-циклодекстрина, и лиофильно высушивали образец.

Конъюгаты остальных белков с проксанолами получали по аналогичной методике.

Аналогично были получены конъюгаты на основе проксанолов с другими значениями n, m и с другими концевыми алкильными радикалами.

Характеристики полученных соединений приведены в таблице 1. Видно, что, варьируя избыток моноальдегида проксанола в реакционной среде, можно регулировать число присоединенных полимерных цепей в конъюгатах.

Чистоту полученных конъюгатов контролировали методом тонкослойной хроматографии. Показано, что осаждение b-циклодекстрином позволяет в одну стадию удалить избыток полимерного реагента.

Практически полное сохранение нативной структуры белков после проведения реакции и выделения их конъюгатов с проксанолами подтверждено путем сравнительного анализа спектров кругового дихроизма исходных белков и их конъюгатов с проксанолами. Методом кругового дихроизма показано, что степень спиральности белков в конъюгатах совпадает со степенью спиральности исходных белков. Кроме того, изучены ферментативные свойства конъюгатов ряда ферментов (a-ХТ, СОД) с проксанолами, свидетельствующие о сохранении ферментативной активности.

На примере конъюгатов бычьего сывороточного альбумина (БСА) с проксанолами была изучена способность конъюгатов солюбилизировать биологически активные нерастворимые в воде соединения. В качестве такого вещества был выбран аналог витамина Б-12, 2",3",4",5"-тетрабензоил-5-ацетил-1,5-дигидрорибофлавин (бензафлавин). Сравнение эффективности конъюгата БСА с проксанолом с эффективностью исходного БСА указывает на то, что конъюгаты связывают в 2-3 раза большее количество бензафлавина, чем БСА. На примере изучения переноса бензафлавина в мембраны микросом печени крыс было показано, что эффективность переноса бензафлавина, солюбилизированного конъюгатами БСА с проксанолом, в 3-4 раза выше по сравнению с солюбилизатом на основе исходного БСА или конъюгата БСА с ПЭГ. Изучение функциональных свойств бензафлавина, входящего в состав солюбилизированных форм (способность ингибировать процессы перекисного окисления липидов и действие фермента оксидазы D-аминокислот) свидетельствуют о полном сохранении химических свойств бензафлавина. Таким образом, конъюгаты белков с проксанолами могут выступать в роли транспортных средств нового типа для доставки нерастворимых лекарственных веществ. На примере конъюгатов a-ХТ и БСА с проксанолами были изучены мембранотропные свойства конъюгатов. О прохождении через мембрану внутрь клетки судили по их способности подавлять окисление НАД-зависимых субстратов в митохондриях Т-лимфоцитов, что выражалось в снижении потребления кислорода Т-лимфоцитами. В то время как исходный белок не оказывает влияния на скорость потребления кислорода, конъюгаты вызывают ее заметное снижение, что свидетельствует об их проникновении в клетку. Было изучено ингибирующее действие ряда конъюгатов a-ХТ на процесс потребления кислорода Т-лимфоцитами. Как видно из таблицы 2, этот эффект начинает проявляться под действием конъюгатов, содержащих не менее трех полимерных цепей на молекулу белка, и возрастает по мере увеличения числа полимерных цепей в конъюгате.

Таким образом, разработан удобный способ получения конъюгатов белков с полиалкиленоксидами, в том числе с проксанолами, обладающих высокими мембранотропными и солюбилизирующими свойствами.