способ получения средства, обладающего мочегонной и противовоспалительной активностью
Классы МПК: | |
Автор(ы): | Нагаслаева Л.А., Глызин В.И., Даргаева Т.Д., Николаев С.М., Шантанова Л.Н., Мондодоев А.Г., Дугаржапов А.М. |
Патентообладатель(и): | Бурятский институт биологии СО РАН |
Приоритеты: |
подача заявки:
1993-06-08 публикация патента:
27.07.1996 |
Использование: изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается способа получения средства, обладающего мочегонной и противовоспалительной активностью. Сущность способа заключается в экстракции листьев толокнянки обыкновенной 45 - 55% этиловым спиртом в соотношении сырье:экстрагент 1:10-14 трижды по 60 минут, упаривании экстракта, очистки сепарированием и сушки методом распыления. Технологический результат заключается в повышении степени очистки целевого продукта. 13 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13
Формула изобретения
Способ получения средства, обладающего мочегонной и противовоспалительной активностью путем экстракции листьев толокнянки обыкновенной (Aratostaphylos Uva. ursi L. ), отличающийся тем, что экстракцию проводят 45-55% -ным этиловым спиртом в соотношении сырье: экстрагент 1 10-14 трижды по 60 мин, водно-спиртовые извелечения упаривают, очищают сепарированием и высушивают методом распыления.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к области медицины и касается способа получения биологически активных веществ из растительного сырья. Известен способ получения отвара толокнянки обыкновенной, применяющегося в качестве мочегонного средства. Для приготовления отвара листья толокнянки обыкновенной измельчают до частиц размером не более 1 мм. Измельченное лекарственное растительное сырье заливают водой комнатной температуры, взятой с учетом коэффициента водопоглощения, в соответствующей емкости и настаивают на кипящей водяной бане при частом помешивании в течение 30 мин. Процеживают без охлаждения (отжимая растительное сырье) и прибавляют воду до требуемого объема извлечения /ГФ XI, вып. 2, С. 147-148. Недостатком данного способа является относительно низкая мочегонная активность по сравнению с суммой, полученной по заявляемому способу. Целью изобретения является получение суммы экстрактивных веществ для повышения мочегонной активности. Для достижения поставленной цели растительный материал экстрагируют 45-55% спиртом этиловым в соотношении сырье и экстрагент 1: (10 14) с учетом коэффициента водопоглощения и ложного дна экстрактора в течение 60 мин при температуре +50oC и постоянном помешивании. Процесс повторяют трижды. Водно-спиртовые извлечения фильтруют через сукно и последовательно упаривают до 1/10 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от 3-х извлечений доупаривают до объема 15 л объединенного водного остатка. Упаренное извлечение сепарируют, затем высушивают на распылительной сушилке. Выход готового продукта составляет 32,30% от массы растительного материала. По мнению заявителя, признаки, отличающие предложенное техническое решение от прототипа, являются существенными, поскольку при проведении патентных исследований не обнаружены. Одной из актуальных проблем медицинской науки о здравоохранении являются вопросы профилактики и лечения заболеваний почек и мочевыделительной системы. Социальная значимость этой проблемы обусловлена широким распространением, разнообразием этиологических факторов и особой тяжестью заболеваний, приводящих к потере трудоспособности населения. В связи с этим, поиск и разработка новых эффективных лекарственных средств из растительного сырья, обладающих малой токсичностью и не оказывающих побочное действие при длительном применении, является также актуальной задачей. Учитывая потребности практического здравохранения в лекарственных препаратах растительного происхождения для лечения заболеваний почек и мочевыделительной системы, разработан способ получения суммы биологически активных веществ из листьев толокнянки обыкновенной. Предложенный способ позволяет получить конечный продукт, представляющий собой аморфный порошок желтовато-зеленого цвета, потеря в массе при высушивании 2,5%1. На основании качественного фитохимического анализа суммы экстрактивных веществ установлено наличие:
1) флавоноидов: двумерной хроматографией на бумаге марки "Filtrak" FN - 12 в системах 1, 15% уксусной кислоты и 2. Этилацетат муравьиная кислота вода (3:1:2), просматриванием хроматограмм в УФ свете до и после проявления 5% спиртовым раствором хлористого алюминия с достоверными образцами обнаружены кверцетин Rf 0,28 (1), Rf 0,75 (2); мирицетин Rf 0,20 (1), Rf 0,53 (2); гиперозид Rf 0,64 (1), Rf 0,84 (2). 2) дубильных веществ: при добавлении к водному извлечению 2 3 капель раствора железоаммониевых квасцов появляется черно-синее окрашивание и осадок. 3) фенолкарбоновых кислот: методом TCX на пластинке "Silufol" в системе хлороформ уксусная кислота (9:1), просматривая в УФ-свете, обнаружили фенолкарбоновые кислоты по ярко-голубой флюоресценции. После обработки хроматограмм в парах аммиака, идентифицированы со свидетелем галловая кислота Rf 0,5, протокатеховая кислота Rf 0,19. 4) органических кислот:
путем хроматографического разделения на пластинке силуфол в системе 95% спирт этиловый концентрированный раствор аммиака (16:4,5), проявитель 0,05% спиртовой раствор бромкрезолового зеленого. Обнаружены муравьиная (Rf 0,23 и хинная Rf 0,39) кислоты. 5) урсоловая кислота:
из хлороформных извлечений методом TCX на "Silufol" в системе хлороформ-этилацетат (1:1) установлено наличие вещества тритерпеновой природы. По величине Rf 0,36 со свидетелем и окраске после обработки пятихлористой сурьмой идентифицировали с урсоловой кислотой. 6) арбутин:
путем хроматографического разделения на бумаге FN-12 в 15% уксусной кислоте хроматограмму обрабатывают 10% раствором натра едкого водно-спиртовым, а через 10 минут диазореактивом. Арбутин имеет Rf 0,85 и проявляется в виде ярко-красного пятна. II. Количественное определение. Арбутин
Титриметрическим методом /ГФ XI изд./ найдено 14,43
![способ получения средства, обладающего мочегонной и противовоспалительной активностью, патент № 2064301](/images/patents/408/2064017/177.gif)
Как видно из таблицы 2, 45 55% спирт этиловый является оптимальным экстрагентом, так как позволяет получить наибольшее количество арбутина с учетом выхода экстрактивных веществ. Как известно, размер частиц сырья обусловливает полноту и скорость перехода в раствор экстрагируемых веществ. Для изучения влияния степени измельчения на выход экстрактивных веществ и арбутина, сырье подвергалось измельчению до диаметра частиц 0, 5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 7,0; 10,0 мм. В таблице 3 представлены результаты исследований. Установлено, что оптимальной степенью измельчения для сырья является размер частиц, не превышающий 2 мм. Подобрано оптимальное соотношение сырье-экстрагент 1:(10:14) для однократного залива сырья. См. табл. 4. Дальнейшее увеличение объема экстрагента нецелесообразно, т.к. не наблюдается увеличения выхода извлекаемых веществ. На основании экспериментальных данных можно заключить, что увеличение температуры экстрагента положительно влияет на ход процесса. Установлена оптимальная температура экстракции (+50
![способ получения средства, обладающего мочегонной и противовоспалительной активностью, патент № 2064301](/images/patents/408/2064017/177.gif)
Исследовали острую токсичность суммы экстрактивных веществ по общепринятому методу Кербера (Требования. 1984). Опыты проведены на 36 беспородных белых крысах-самцах с исходной массой 160 180 г. Испытуемое вещество в виде водного раствора вводили однократно внутрибрюшинно в дозах от 150 до 400 мг/кг. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток. Проведенные исследования показали, что ЛД50 суммы экстрактивных веществ при внутрибрюшинном введении белым крысам составляет 225 мг/кг (136,2oC313,8). Полученные результаты позволяет классифицировать испытуемое средство как малотоксичное вещество по классификации Сидорова К.К. (1973). Диуретическую активность суммы экстрактивных веществ оценивали по общепринятому методу к 2,5 водной нагрузкой. На 18 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 190 200 г. Описание схемы эксперимента см. в предыдущем разделе. Испытуемое средство в виде водного раствора вводили однократно внутрижелудочно в дозе 12 мг/кг. Полученные результаты приведены в таблице 9. Как следует из приведенной таблицы, сумма экстрактивных веществ в дозе 12 мг/кг оказывает выраженное диуретическое действие, о чем свидетельствует увеличение объема выделяемой мочи у белых крыс. Наряду с этим, отмечается достоверное повышение экскреции ионов натрия с мочой. При этом диуретическая активность испытуемого средства несколько превосходила таковую у отвара толокнянки. В следующей серии экспериментов исследовали противовоспалительную активность суммы экстрактивных веществ по методу Менкина (Ойвин, Шетель, 1961), описанному в предыдущем разделе. Опыты проведены на 18 белых беспородных крысах обоего пола с исходной массой 160 180 г. Испытуемое средство в виде водного раствора вводили по вышеописанной схеме в дозе 25 мг/кг. Полученные результаты приведены в таблице 10. Данные, приведенные в таблице 10, свидетельствуют, что курсовое введение суммы экстрактивных веществ в дозе 25 мг/кг оказывает выраженное противовоспалительное действие, оказывая протекторное антиальтеративное действие и способствуя ускорению регенерации поврежденной ткани. При этом, противовоспалительная активность предлагаемого средства на ранних сроках исследования превосходит таковую у отвара толокнянки обыкновенной. Исследовали также противовоспалительную активность суммы экстрактивных веществ с использованием модели отека конечности по методу Стрельникова Ю.Е. (1960). Опыты проведены на белых беспородных крысах обоего пола массой 180 - 200 г. Отек конечности вызывали субплантарным введением 0,1 мл 3 раствора формалина. Сумму экстрактивных веществ в виде водного раствора вводили внутрижелудочно в дозе 25 мг/кг в объеме 1 мл/100 г 3-х кратно: первое ведение осуществляли за 3 часа до субплантарного введения формалина, а затем через 5 и 18 часов после этого. Животным контрольной группы вводили дистиллированную воду в равном объеме 1 мл/100 г. Через 24 часа после введения формалина животных умерщвляли и мгновенной декапитацией под эфирным наркозом ампутировали задние лапки на уровне коленного сустава и производили оценку антиэкссудативной активности по формуле:
![способ получения средства, обладающего мочегонной и противовоспалительной активностью, патент № 2064301](/images/patents/408/2064301/2064301t.gif)
где: Pк разность веса лапок с отеком и без отека у животных контрольной группы. P разность веса лапок с отеком и без отека у животных опытной группы. Полученные результаты приведены в таблице 11. Как следует из приведенной таблицы, сумма экстрактивных веществ в дозе 25 мг/кг оказывает умеренное антиэкссудативное действие, аналогичное действию отвара толокнянки. Пример 3. 10 кг листьев толокнянки обыкновенной измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2 мм (сито N 20 ГОСТ 214 83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 150 л спирта 55 в соотношении сырье-экстрагент 1:10 с учетом коэффициента водопоглощения. Экстрагируют при температуре 60oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно. Заливают спиртом 55 в количестве равном слитому и экстрагируют. Операцию повторяют трижды. I слив 128 л; II слив 128 л; III слив 128 л. Водно-спиртовые извлечения последовательно упаривают до 1/10 первоначального объема. Объединенные кубовые остатки от 3-х извлечений доупаривают до объема 15 л объединенного водного остатка. Концентрированный экстракт сепарируют и сушат на распылительной сушилке. Получают 3,217 кг готового продукта, что составляет 32,17 экстрактивных веществ от веса исходного сырья. Аморфный порошок желтовато-зеленого цвета, комкуется, потеря в массе при высушивании 2,8 Изучали диуретическую активность полученной суммы экстрактивных веществ с использованием 2,5 водной нагрузки по вышеописанному методу. Испытуемое средство в виде водного раствора вводили однократно внутрижелудочно в дозе 12 мг/кг. Установлено, что сумма экстрактивных веществ в указанной дозе обладает умеренной диуретановой активностью, способствуя увеличению экскреции воды и электролитов у белых крыс. См. табл. 12. При этом, желчегонная активность испытуемого средства была аналогичной таковой у препарата сравнения. Таблица 12. Как следует из приведенной таблицы, при однократном введении суммы экстрактивных веществ в дозе 12 мг/кг наблюдается умеренное повышение диуреза у белых крыс, о чем свидетельствует достоверное увеличение объема мочи и экскреции ионов натрия. Диуретическая активность испытуемого вещества была аналогичной таковой у отвара толокнянки. В следующей серии экспериментов изучали противовоспалительную активность суммы экстрактивных веществ по методу Менкина (Ойвин, Шетель, 1961), описанному в предыдущих разделах. Сумму экстрактивных веществ в виде водного раствора вводили по вышеописанной схеме в дозе 25 мг/кг. Результаты исследований показали, что курсовое введение суммы экстрактивных веществ в указанной дозе оказывает противовоспалительное действие, несколько уступающее действию отвара листьев толокнянки. См. табл. 13. Источники информации
1. Государственная Фармакопея X издания. М. 1968. 2. Государственная Фармакопея XI издания. Вып. 1, 2. М. 1987. 1990. 3. Машковский М.Д. Лекарственные средства. 1 т. 1988. с. 498
4. Макаров А. А. Химическая оценка сырья толокнянки /Учен. зап. Якут. Ун-та. Вып. 18. 1971. с. 41-44. 5. Методические рекомендации по экспериментальному (доклиническому) изучению диуретических веществ (Изд. официальное). М. 1989. с. 17
6. Ойвин И. А. Шетель С.Л. Методика изучения местных нарушений капиллярной проницаемости // Материалы по патогенезу воспаления и патологии белков крови. Душанбе. 1961. Т. 49, N 5, с. 167 173. 7. Пономарев В.Д. Экстрагирование лекарственного сырья. М. 1976. с. 202
8. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения и их химический состав, использование. Л. 1987. с. 73 74. 9. Сидоров К. К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. Токсикология новых промышленных химических веществ. М. 1973, с. 47 51. 10. Стрельников Ю.Е. Сравнительная характеристика противовоспалительного действия некоторых пиримидиновых производных. Фармакол. и токсикол. 1960. N 6. c. 526 531. 11. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ. М. 1984. 12. Шнякина Г.П. Седельникова В.А. Цыганкова Н.В. О содержании арбутина в листьях некоторых растений Советского Дальнего Востока. Растит. ресурсы. -1981. N 4, с. 568 571. 13. Hochleistungsflussigchromotographishe Trennung und quantative bestimmung von Arbutin, Methylarbutin, Hydrochinon and hydrochinonmonomethylaether in Arctostaphylos, Bergenia, Calluna und Vaccinium Arten // Planta medica. 1979. Vol. 35 P. 53 261.