производные дезацетилколхицина, способ их получения и противоопухолевая композиция

Формула изобретения

1. Производные дезацетилколхицина общей формулы I



где представляет ацильный остаток сахарокарбоновой С₃-С₇-кислоты, в котором гидроксильные группы могут быть защищены ацильной или кетальной группой.

2. Производные по п.1, отличающиеся тем, что R группа формулы











в которых гидроксильные группы могут быть защищены ацильной или кетальной группой.

3. Производные по п.1, выбранные из ацетонидамида дезацетилколхицин-глицериновой кислоты, амида дезацетилколхицин-глицериновой кислоты, тетраацетатамида дезацетилколхицин-глюкуроновой кислоты, диацетатамида дезацетилколхицин-глюкуроновой кислоты, амида дезацетилколхицин-глюкуроновой кислоты, пентаацетатамида дезацетилколхицин-глюконовой кислоты и амида дезацетилколхицин-глюконовой кислоты.

4. Способ получения производных дезацетилколхицина общей формулы I



где представляет ацильный остаток сахарокарбоновой С₃-С₇-кислоты, в котором гидроксильные группы могут быть защищены ацильной или кетальной группой,

отличающийся тем, что дезацетилколхицин формулы



подвергают амидированию сахарокарбоновой кислотой формулы

R COOH,

где представляет ацильный остаток сахарокарбоновой С₃-С₇-кислоты, в котором гидроксильные группы могут быть защищены ацильной или кетальной группой.

5. Противоопухолевая композиция, содержащая производное дезацетилколхицина и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве носителя она содержит вещество, выбранное из группы, состоящей из воды, этанола, крахмала, лактозы, сахарозы, глюкозы, маннита, двуокиси кремния, карбоксиметилцеллюлозы, альгината, желатина, поливинилпирролидона, глицерина, агара, карбоната кальция, парафина, каолина, талька, стеарата кальция, стеарата магния и полиэтиленгликоля, а в качестве производного дезацетилколхицина соединение общей формулы I по п.1 в эффективном количестве.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новым производным дезацетилколхицина. Более конкретно, настоящее изобретение относится к производным дезацетилколхицина, представленным формулой:

(I)

где R представляет остаток, получаемый удалением COOH из сахарокарбоновой С₃-C₇-кислоты, и гидроксил, присутствующий в остатке, может быть соответствующим образом защищен защитной группой для гидроксила.

Давно известно, что колхицин, представленный формулой:



обладает фармацевтической активностью по отношению к клеткам опухолей, подагре и т. д. (Колхицин в сельском хозяйстве, медицине, биологии и химии (Пресс Амис колледжа штата Айова, Айова, 1955).

Колхицин, однако, характеризуется высокой токсичностью, в связи с чем полностью вытеснен демеколхицином (дезацетил-N-метилколхицином), открытым позднее (Chem. bugng. Huvs, 37, N 41, 67 (1959)/.

Создателями настоящего изобретения в этой связи предприняты многочисленные исследования в поисках производных колхицина, обладающих меньшей токсичностью и лучшей противоопухолевой активностью, в результате которых обнаружено, что производные дезацетилколхицина, представленные формулой (1), оказывают повышенное действие по ингибированию распространения клеток опухоли, и как ожидается, найдут применение в качестве противоопухолевых средств. Указанное открытие и привело к завершению настоящего изобретения.

Выражение "остаток, получаемый удалением COOH из сахарокарбоновой С₃-C₇-кислоты", представленный R, включает одновалентный остаток (далее "остаток сахара"), получаемый удалением COOH из моносахаридной карбоновой С₃-C₇-кислоты, такой как: глицериновая кислота, рибоз-карбоновая кислота, глюкуроновая кислота, глуконовая кислота или глюкогептановая кислота. Примеры подобных остатков приведены ниже.

, ,

,

По меньшей мере часть ряда гидроксильных групп, присутствующих в остатке сахара, могут быть соответствующим образом защищены защитной группой для гидроксила. Примеры защитных групп для гидроксила включают: ацильные группы, такие как: ацетил, пропионил, бутурил, пивалоил и бензоил, и ацетальные и кетальные группы, представленные следующими формулами:



Соединения настоящего изобретения могут быть образованы, например, участием дезацетилколхицина, представленного формулой:

(II)

в реакции амидирования с использованием сахарокарбоновой кислоты формулы:

R-COOH (III)

где R принимает вышеуказанные значения, или ее реакционноспособных производных.

Амидирование дезацетилколхицина сахарокарбоновой кислотой формулы (III) или ее реакционноспособным производным (например, галоидангидридами и активными эфирами) может быть осуществлено реакцией амидирования, хорошо известной в химии пептидов.

К примеру, соединение настоящего изобретение может быть получено реакцией дезацетилколхицина с галоидангидридом сахарокарбоновой кислоты формулы (III) в присутствии основания. Вышеуказанная реакция может быть осуществлена при температуре 0-30^oC, предпочтительно от 0^oC до комнатной температуры. Количество галоидангидрида строго не лимитировано, обычно оно составляет 1 1,5 моль, предпочтительно 1 1,2 моль на моль дезацетилколхицина. Примеры оснований включают: третичные амины, такие как триэтиламин и пиридин; гидро(карбонаты) щелочных металлов, такие как: карбонат натрия, гидрокарбонат натрия, карбонат калия и гидрокарбонат калия. Количество основания обычно составляет 1 1,5 моль, предпочтительно 1 1,2 моль на моль дезацетилколхицина.

Вышеуказанная реакция может быть проведена в инертном растворителе. Примеры растворителей включают: галоидированные углеводороды, такие как: хлористый метилен, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтилен и трихлорэтилен; алифатические простые эфиры, такие как: этиловый эфир и метилцеллюлозольв и ароматические углеводороды, такие как: бензол и толуол.

Соединение настоящего изобретения может быть синтезировано прямой реакцией дезацетилколхицина с сахарокарбоновой кислотой в присутствии конденсирующего средства, такого как дициклогексилкарбодиимид или реакцией дезацетилколхицина со сложным эфиром (таким как: метиловый эфир, этиловый эфир или бутиловый эфир) сахарокарбоновой кислоты формулы (III).

Полученное в результате соединение настоящего изобретения может быть выделено и очищено известными методами, такими как: экстракция, хроматография, кристаллизация или их сочетанием.

В случае соединения настоящего изобретения, в котором в остатке сахара, представленного R, присутствует защитная группа для гидроксила, защитная группа может быть удалена в реакции удаления защитной группы, например, при необходимости в реакции гидролиза.

В вышеуказанной реакции используемый в качестве исходного соединения дезацетилколхицин является известным соединением ( J. Am. Chem. Soc. 75, 5292 (1953)/ и может быть образован известными методами. Или же дезацетилколхицин может быть образован реакцией колхицина формулы:

(IV)

с триалкилоксонийфторборатом с последующей обработкой реакционной смеси водой по методике, вновь созданной создателями настоящего изобретения.

Реакция колхицина с триалкилоксонийфторборатом может быть проведена при температуре 0-30^oC, предпочтительно от 0^oC до комнатной температуре в инертном органическом растворителе. Примеры инертного органического растворителя включают: галоидированные углеводороды, такие как: хлористый метилен, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтилен и трихлорэтилен; алифатические простые эфиры, такие как: этиловый эфир и метилцеллозольв и ароматические углеводороды, такие как: бензол и толуол.

Триалкилоксонийфторборат, который вводят в реакцию с колхицином, является соединением, отвечающим формуле:

(R)₃O⁺BF^-₄ (V)

где R^" представляет алкил.

Конкретно рекомендуется триэтилоксонийфторборат /(C₂H₅)₃O⁺BF₄^-/, известный под названием реактива Меервейна.

Количество триалкилоксонийфторбората обычно составляет 1 2 моль, предпочтительно 1 1,5 моль на моль колхицина.

Предполагается, что реакция колхицина с триалкилоксонийфторборатом дает соединение формулы:

(VI)

где R^" принимает вышеуказанное значение.

Дезацетилколхицин может быть образован обработкой соединения формулы (VI) как таковое водой. Обработка водой может быть осуществлена путем перемешивания при температуре 0-30^oC, особенно при комнатной температуре в течение от 30 мин до трех ч. Количество воды составляет по меньшей мере 1 моль, но обычно применяют избыточное количество на моль колхицина, используемого в качестве исходного продукта.

Полученный в результате дезацетилколхицин находится в водной фазе, из которой может быть выделен и очищен известными методами. К примеру, дезацетилколхицин может быть выделен подщелачиванием водного слоя до рН в интервале 9 10 добавлением щелочи, такой как: гидроокись калия, карбонат натрия и гидрокарбонат натрия, с последующим экстрагированием органическим растворителем, например: галоидированным углеводородом, таким как: хлористый метилен, хлороформ, четыреххлористый углерод, дихлорэтилен и трихлорэтилен, алифатическим простым эфиром, таким как: этиловый эфир и метилцеллозольв или ароматическим углеводородом, таким как: бензол или толуол.

Выделенный в результате дезацетилколхицин может быть очищен, например, его переводом в соль с винной кислотой или яблочной кислотой.

Производные дезацетилколхицина формулы (I), даваемые настоящим изобретением, проявляют прекрасную противоопухолевую активность, о чем свидетельствуют результаты испытаний in vitro и in vivo на клетках опухолей, описанные ниже.

Пример испытаний 1. Испытание на ингибирование in vitro распространения клеток опухоли.

Адриамицин-резистентные клетки лейкоза мышей ПЗ88/ADR в количестве 2 х 10⁵ суспендируют в культурной среде RPMI 1640, содержащей 10% плодной сыворотки теленка, и культивируют 2 дня в присутствии испытуемого соединения (испытуемое соединение растворяют в диметилсульфоксиде до концентрации 1 мг/мл, после чего разбавляют фосфатным буферным раствором). Исследуют влияние на распространение клеток и определяют значения 50% ингибирующей распространение концентрации (ИК₅₀ в мкг/мл). Полученные результаты приведены в табл. 1.

Пример испытаний 2. Испытание in vivo на асцитной опухоли Саркомы 180, трансплантированной мышам.

Клетки Саркомы 180 в количестве 1 х 10⁶ трансплантируют в брюшную полость каждому самцу мышей линии ddy в возрасте 6 недель. Через семь дней после дня трансплантации клеток опухоли каждой группе, состоящей из 6 мышей, в брюшную полость раз в день вводят испытуемое соединение (растворенное в пропиленгликоле и разбавленное фосфатным буферным раствором до конечной концентрации пропиленгликоля 20% или ниже) и определят среднее число выживаний в день и процент пролонгирования . Полученные результаты приведены в табл. 2.

Пример испытаний 3. Испытание in vivo на твердой опухоли Саркомы 180, трансплантированной мышам.

Самкам мышей линии ddy в возрасте 6 недель трансплантируют каждой в спину подкожно клетки Саркомы 180 в количестве 2 х 10⁶ клеток. На 10-ый день от 6-го дня после трансплантации в группах, состоящих из 6 мышей, непрерывно вводят в брюшную полость раз в день испытуемое соединение (растворенное в пропиленгликоле и разбавленное фосфатным буферным раствором до конечной концентрации пропиленгликоля 20% или меньше). Через тридцать дней после трансплантации опухоли ее извлекают. Определяют массу опухоли и подсчитывают среднюю массу опухоли и процент ингибирования . Полученные результаты приведены в табл. 3.

Пример испытаний 4. Испытание на острую токсичность.

Самцам мышей линии ddy в возрасте 5 недель вводят испытуемое соединение и в течение 1 недели определяют смертность. Методом Литчфилда-Уилкоксона подсчитывают 50% летальную дозу (ЛД₅₀). Испытуемое соединение (соединение (а) суспендируют в 10%-ном пропиленгликоле. Готовят градиенты разбавления от максимальной концентрации 80 мг/кг в отношении 1,2 и проводят испытание (табл. 4).

Из результатов испытаний следует, что соединение настоящего изобретения обладает высокой ингибирующей активностью и, как можно ожидать, найдет применение в качестве противоопухолевого средства.

При использовании соединения настоящего изобретения в качестве противоопухолевого средства для обработки и лечения опухоли такое соединение может быть введено либо перорально, либо парантерально (например: внутривенно, внутримышечно, подкожно или внутриректально). Доза соединения может меняться в широком интервале в зависимости от симптомов заболевания, пола и веса больного, пути введения, диагноза доктора и т.п. Обычно доза составляет 1 20 мг/кг. В случае перорального введения приемлемая доза составляет 5 10 мг/кг, в случае внутривенной инъекции 2 4 мг/кг.

Соединение настоящего изобретения может быть введено в состав таблеток, гранул, порошков, капсул, сиропов, инъекций, капель или свеч. Приготовление составов может быть осуществлено известными способами путем смешивания соединения настоящего изобретения с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем. Примеры носителя или разбавителя включают: воду, этанол, крахмал, лактозу, сахарозу, глюкозу, маннит, окись кремния, карбоксиметилцеллюлозу, альгинат, желатин, поливинилпирролидон, глицерин, агар, карбонат кальция, парафин, каолин, тальк, стеарат кальция, стеарат магния и полиэтиленгликоль.

Пример 1. Получение дезацетилколхицина.

В безводном хлористом метилене растворяют четыре грамма (10 ммоль) колхицина, охлаждают от 0^oC и к полученному раствору по каплям прибавляют раствор 15 ммоль триэтилоксонийфторбората (реактив Меервейна) в хлористом метилене. Раствор перемешивают 1 ч при 0^oC и еще 5 ч при комнатной температуре. К реакционной смеси добавляют тридцать миллилитров воды и образовавшийся раствор перемешивают 1 ч. Затем водный слой отделяют в делительной воронке, слой хлористого метилена 5 раз экстрагируют 50 мм воды. Слой хлористого метилена сушат над сульфатом магния и используют для извлечения непрореагировавшего колхицина. Водный слой добавлением 1 н. гидроокиси натрия подщелачивают до рН 10 и экстрагируют хлороформом. Слой хлороформа сушат над сульфатом магния и затем концентрируют в испарителе. Остаток растворяют в 30 мл этанола и добавляют 1 г винной кислоты с последующим нагреванием смеси 1 ч. После охлаждения смеси до комнатной температуры осадок отфильтровывают. Полученную соль винной кислоты сушат в эксикаторе (разлагается при температуре плавления 219 220^oС).

Соль винной кислоты растворяют в 50 мл воды, добавлением 1 н. гидроокиси натрия устанавливают рН 10 и экстрагируют хлороформом. Экстракт сушат над сульфатом магния и концентрируют при пониженном давлении в испарителе с получением 1,38 г маслянистого дезацетилколхицина. Выход 39%

Непрореагировавший колхицин может быть выделен колонной хроматографией на силикагеле начального слоя хлористого метилена из части, элюируемой растворителем бензол-ацетон (1,71 г). Выход дезацетилколхицина с учетом этого количества составляет 61%

Пример 2. Ацетонидамин дезацетилколхицин-глицериновой кислоты (Соединение I)



В 30 мл безводного эфира суспендируют ацетонид глицерида калия (3,6 г, 20 ммоль) и к суспензии по каплям прибавляют эфирный (5 мл) раствор 2,4 г (20 ммоль) тионилхлорида. По окончании прикапывания смесь кипятят 3 ч. После охлаждения смеси до комнатной температуры осадок отфильтровывают с отсосом и фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Остаток растворяют в добавленном хлористом метилене.

Одновременно в 30 мл хлористого метилена растворяют 2,96 г (8,3 ммоль) дезацетилколхицина и 2,02 г (20 ммоль) триэтиламина. Смесь охлаждают до 0^oC и к ней по каплям прибавляют вышеописанный раствор хлорангидрида глицериновой кислоты в хлористом метилене. После перемешивания 3 ч при 0^oC раствор хлористого метилена промывают водным раствором гидрокарбоната натрия. Слой хлористого метилена сушат над сульфатом магния и затем концентрируют при пониженном давлении. Остаток разделяют колоночной хроматографией с получением из порции, элюируемой смесью бензол-ацетон (5: 1), 1,11 г продукта (соединение 1а L-изомер). Выход 28% и т.пл. 251-253^oC (с разложением).

Кроме того, из фракции, элюируемой смесью бензол-ацетон (5:2), получают 0,58 г второго продукта (соединение 1b D-изомер). Выход 14%

Соединение 1а. ИК (KBr): 3250 см^-1 (NH), 1670 см^-1 (С=0). 1250 см^-1 (-0-);

ЯМР (DCD1₃): 1,4 (3H, c), 1,6 (3Н, с), 1,69 2,67 (4Н, м), 3,62 (3Н, с), 3,87 (3Н, с), 3,87 (3Н, с), 3,91 (3Н, с), 3,93 (3Н, с), 4-4,5 (4Н, с), 6,49-7,29 (4Н, м).

(0046)

Соединение 1b. ИК (KBr): 3250 см^-1 (NH), 1670 см^-1 (С=0), 1250 см^-1 (-0-);

ЯМР (DCD1₃): 1,37 (3Н, с), 1,46 (3Н, с) 1,69 2,67 (4Н, м), 3,62 (3Н, с), 3,86 (3Н, с), 3,91 (3Н, с), 3,97 (3Н, с), 4 4,5 (4Н, с), 6,49 - 7,29 (4Н, м).

Пример 3. Амид дезацетилколхицин-глицериновой кислоты (N-(5,6,7,9-тетрагидро-1,2,3,10-тетраметокси-4-оксобензол/a/ гептален-7-ил)глицероамид/ (соединение 2)



К метанольному раствору (30 мл) ацетонидамида дезацетилколхицин-глицериновой кислоты (0,94 г, 2 ммоль; соединение 1), синтезированного согласно примеру 2, добавляют десять миллилитров 5%-ной соляной кислоты и смесь перемешивают при комнатной температуре 5 ч. По окончании перемешивания добавляют 200 мл хлороформа, смесь промывают водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным водным раствором NaCl. Слой хлороформа сушат над сульфатом магния и затем концентрируют при пониженном давлении. Остаток разделяют колоночной хроматографией на силикагеле. Элюированием смесью бензол-ацетон (1:2) получают 0,45 г (выход 52%) заглавного соединения (соединение 2.D, L-смесь) с т. пл. 45 59^oC.

ИК (KBr): 3350 см^-1 (ОН), 1660 см^-1 (С=0), 1280 см^-1 (-О).

ЯМР (DCDL1₃): 1,87 2,64 (4Н, м), 3,62 (3Н, с), 3,87 (3Н, с), 3,91 (3Н, с), 3,96 (3Н, с), 3,56 4,84 (6Н, м), 6,51 7,58 (4Н, м), 7,9 (1Н, уш.с.)

Пример 4. Тетраацетатамид дезацетилколхицин-глюкуроновой кислоты (Соединение 3).

К 30 мл хлороформенного раствора 1,81 г (5 ммоль) тетраацетата глюкуроновой кислоты добавляют тионилхлорид и смесь кипятят 3 ч. После охлаждения смеси до комнатной температуры растворитель и избыток тионилхлорида удаляют при пониженном давлении. Полученный в остатке хлорангидрид кислоты растворяют в 10 мл хлористого метилена. В то же время в 30 мл хлористого метилена растворяют 1,78 г (5 ммоль) дезацетилколхицина и 0,6 г триэтиламина и раствор охлаждают до 0^oC. К охлажденной смеси добавляют полученный хлорангидрид кислоты и смесь перемешивают 1,5 ч при 0^oC и 15 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь промывают водным раствором гидрокарбоната натрия и затем сушат над сульфатом магния. После концентрирования раствора остаток разделяют колоночной хроматографией на силикагеле. Элюированием смесью бензол-ацетон (11:3) получают 1,3 г заглавного соединения (соединение 3). Выход 37% т.пл. 145 147^oC (с разложением).

ИК (КВr): 1750 см^-1 (ОН), 1680 см^-1 (С=0).

ЯМР (DCDL₃): 1,91 (3Н, с), 1,96 (3Н, с), 2 (2Н, с), 2,09 (3Н, с), 2,1 2,64 (4Н, м), 3,58 (3Н, с), 3,87 (3Н, с), 3,89 (6Н, с), 4 4,22 (1Н, м), 5 5,38 (4Н, м), 5,8 5,89 (1Н, м), 6,47 7,53) (4Н, м).

Пример 5

Диацетатамид дезацетилколхицин-глюкуроновой кислоты (Соединение 4)



(вероятная формула)

Заглавное соединение получают по методике примера 4 за исключением того, что используют 3,62 г (13 ммоль) диацетата глюкуроновой кислоты, 1,71 г (15 ммоль) тионилхлорида, 2,89 г (8 ммоль) дезацетилколхицина и 1,52 г (15 ммоль) триэтиламина. Получено 1,67 г (выход 35%).

ЯМР (DCDL₃): 2,15 (6Н, с), 2,26 2,71 (4Н, м), 3,64 (3Н, с), 3,89 (6Н, с), 3,98 (3Н, с), 3,37 4,48 (8Н, м), 6,53 7,81 (4Н, м).

Пример 6. Амид дезацетилколхицин-глюкуроновой кислоты /N-(5,6,7,9-тетрагидро-1,2,3,10-тетраметокси-9-оксобензо/a/ гептален-7-ил/глюкуронамид/ (соединение 5).

В 30 ммоль метанола растворяют диацетатамид дезацетилколхицин-глюкуроновой кислоты (соединение 4) (1,52 г, 2,5 ммоль), охлаждают до 0^oC, по каплям прибавляют пять миллилитров 1 н.гидроокиси натрия и смесь перемешивают 1 ч при 0^oC. Добавлением разбавленной соляной кислоты в смеси устанавливают рН 7, после чего концентрируют при пониженном давлении. К остатку добавляют хлороформ и осадок отфильтровывают с последующим разделением фильтрата колоночной хроматографией на силикагеле. В результате их элюируемой смесью бензол-метанол (5: 1) фракции получено 0,93 г (выход 73%) заглавного соединения (соединение 5) с т.пл. 53-57^oC.

ЯМР (DCDL₃): 2,22 2,67 (4Н, м), 2,96 3,27 (4Н, м), 3,62 (3Н, с), 3,87 (6Н, с), 2,93 (3Н, с), 3,54 4,22 (6Н, м), 6,48 7,78 (4Н, м).

Пример 7. Пентаацетатамид дезацетилколхицин-глюконовой кислоты (Соединение 6).

К 30 мл раствора хлороформа, содержащего 2,57 г (6,3 ммоль) пентаацетата глюконовой кислоты, добавляют тионилхлорид (1,5 г, 13 ммоль) и смесь кипятят 3 ч. После охлаждения смеси до комнатной температуры растворитель и избыток тионилхлорида удаляют при пониженном давлении. Полученный в остатке хлорангидрид кислоты растворяют в 10 мл хлористого метилена. В то же время в 40 мл хлористого метилена растворяют 1,53 г (4,3 ммоль) дезацетилколхицина и 1 г (10 ммоль) триэтиламина и охлаждают до 0^oC. К охлажденной смеси добавляют полученный хлорангидрид по каплям и перемешивают 1,5 ч при 0^oC и 1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь промывают водным раствором гидрокарбоната натрия и затем сушат над сульфатом магния. После концентрирования раствора остаток разделяют колоночной хроматографией на силикагале. Элюированием смесью бензолацетон (11: 3) получают 1,83 г (выход 57%) заглавного соединения (соединение 6).

Пример 8. Амид дезацетилколхицин-глюконовой кислоты (Соединение 7).

В 30 мл метанола растворяют пентаацетатамид дезацетилколхицин-глюконовой кислоты (соединение 6) (3,37 г, 5 ммоль), полученного согласно примеру 6, и раствор охлаждают до 0^oC. По каплям прибавляют пять миллилитров 1 н.гидроокиси натрия и перемешивают 1 ч при 0^oC. Добавлением разбавленной соляной кислоты в смеси устанавливают рН 7 и затем концентрируют при пониженном давлении. К остатку добавляют хлороформ и осадок отфильтровывают. Фильтрат концентрируют и остаток разделяют колоночной хроматографией на силикагеле. В результате из фракции, элюируемой смесью бензол-метанол (5:1), получено 1,12 г (выход 42%) заглавного соединения (соединение 7).