гистохимический способ определения локализации пероксидазы в сочной растительной ткани

Формула изобретения

Гистохимический способ определения локализации пероксидазы в сочной растительной ткани, включающий приготовление блоков исследуемого образца, получение срезов, инкубацию их с гваяколом и H₂O₂ и последующее микроскопирование, отличающийся тем, что в качестве исследуемого образца используют ткань плодов сладкого перца, полученные блоки предварительно фиксируют при температуре 20-25°С в течение 3-4 суток в 8-10%-ном растворе формалина на 1/15 М фосфатном буфере с рН 6,8-7,2, промывают их тем же буфером, а срезы инкубируют в течение 40-50 мин при 37°С в реакционной смеси следующего состава, об.

0,5 М KNO₃ 20-28

1/15 М фосфатный буфер 20-30

0,02 М гваякол 20-30

1%-ный раствор H₂O₂ 20-30

Описание изобретения к патенту

Предлагаемый способ относится к гистохимическим методам исследования растительных тканей. Позволяет определять локализацию пероксидазы в клеточных структурах сочной ткани плодов сладкого перца на основании качественной реакции окисления гваякола перекисью водорода в присутствии фермента. Разработанная методика определения пероксидазы в тонких срезах может быть использована в различных научных исследованиях с целью изучения локализации фермента при технологической или другой обработке.

Аналогом данного метода может служить формальдегид-ортодианизидиновый метод гистохимического определения активности тканевой каталазно-пероксидазной системы (Резников А.Ю. Перова Т.П. Породенко В.А. Диагностические показатели состояния каталазно-пероксидазной системы в танатогенезе алкогольных интоксикаций Тез. докл. 2-го Всероссийского съезда медиков. Иркутск

Москва, 1987, с. 201). Сущность аналогичного метода заключается в приготовлении блоков исследуемого образца, фиксации их в растворе формалина, изготовлении из фиксированных блоков серийных срезов и проведении на них качественной реакции на каталазно-пероксидазную систему. Однако, аналогичный метод предназначен для определения каталазы в животных или трупных тканях. Условия фиксации блоков исследуемых образцов и реакционной смеси для определения пероксидазно-каталазной системы разработаны для трупной ткани и не могут быть перенесены для работы с сочной растительной тканью плодов перца.

Аналогичными для предлагаемого изобретения являются способы гистохимического определения растительной пероксидазы, описанные В. Г. Конаревым ("Цитология и гистохимия растений"- Высшая школа, 1966) и З.П.Паушевой ("Практикум по цитологии растений"- Колос, 1974).

Ближайшим прототипом может служить способ определения пероксидазы гваяколовой реакцией по методу К.Т.Сухорукова (Г.Г.Фурст "Методы анатомо-гистохимического исследования растительных тканей" Наука, 1979, с.123). Указанный способ предполагает выполнение с помощью опасной бритвы срезов растительной ткани, расправление срезов в дистиллированной воде, обработку их насыщенным раствором гваякола и 1%-ным раствором перекиси водорода и последующее микроскопирование. Однако отсутствие при таком анализе фиксации образцов высоковлажной сочной ткани затрудняет выполнение тонких (до 20 мкм) расправленных срезов. Кроме того, при обработке нефиксированных срезов дистиллированной водой и, в последующем, реакционной смесью наблюдается диффузия фермента. Эти факторы осложняют гистохимический анализ, приводят к погрешности определения локализации пероксидазы в растительных тканях.

Техническим решением задачи данного изобретения является подготовка к гистохимическому анализу ткани плодов перца и определения в ней локализации пероксидазы.

Для решения этой задачи предусматривается фиксация блоков ткани плодов перца в 8-10%-ном растворе формалина в 1/15 М-ном фосфатном буфере рН 6,8-7,2. Фиксацию проводят при комнатной температуре в течение 3-4 суток. Далее блоки растительной ткани промывают в 1/14 М-ном фосфатном буфере рН 6,8-7,2 и выполняют из них серийные срезы толщиной 10-15 мкм в криостате-микротоме. Для проведения качественной реакции срезы помещают в реакционную смесь, которая содержит 0,5 М раствора KNO₃, фосфатный буфер рН 6,8-7,2, 0,02 М раствор гваякола и 1% -ный раствор перекиси водорода. Реакцию проводят в течение 40-50 мин в термостате при температуре 37^oС. Прореагировавшие срезы заключают в полистирол и микроскопируют. На фиг.1 изображена фотография тонкого среза сладкого перца, подготовленного и прореагировавшего описанным выше способом. Увеличение микроскопа при фотографировании составило ОБ 15ОК 20.

Очевидно, что предлагаемый способ обработки блоков растительной ткани позволяет фиксировать пероксидазу в клетках, избегать диффузию фермента в реакционную смесь. При фиксации растительная ткань сладкого перца приобретает упругость, необходимую для выполнения срезов желаемой толщины. Установлено, что предлагаемая фиксация не инактивирует растительную пероксидазу. Избирательность действия выбранного субстрата и "комфортные" условия реакции обуславливают специфичность способа в отношении пероксидазы перца. Качественная реакция окисления гваякола перекисью водорода дает окрашенные продукты в присутствии пероксидазы, что при микроскопировании позволяет судить о локализации этого фермента в клетке.

П р и м е р. Проводилось исследование локализации пероксидазы в ткани плода сладкого перца. В качестве объекта исследования был выбран сладкий перец технической спелости сорта "Подарок Молдовы". Из плодов перца острой битвой вырезали блоки размером 10,50,5 см и помещали в фиксируемую смесь. Фиксирующим агентом служил раствор нейтрального формалина в 1/15 М фосфатном буфере рН 7,0. Оптимальные результаты фиксации получены при концентрации формалина 85. Фиксацию проводили при температуре 20^oC в течение 3-х суток. Далее блоки ткани перца промывали в 1/15 М фосфатном буфере рН 7,0 и выполняли из них срезы толщины 15 мкм в криостате-микротоме. Полученные срезы помещали в реакционную смесь, содержащую:

[KNO₃] 510^-1 M.25%

1/15 М фосфатный буфер рН 7,0.25%

[гваякол] 210^-2 М.25%

[H₂O₂ 1%25%

Реакцию проводили на свободно плавающих срезах при температуре 37^oС в течение 50 мин. Микроскопирование заключенных в полистирол прореагировавших срезов выявило гранулированную красно-коричневую окраску, свидетельствующую об окислении гваякола перекисью водорода в присутствии пероксидазы перца в местах ее нативной локализации. Таким образом, предложенный способ позволяет определять локализацию пероксидазы в клетках растительной ткани перца и на основании этого судить о состоянии или причинах изменения активности фермента.

Установлено, что результат качественной реакции на пероксидазу, проводимой на фиксированных срезах описанным выше способом, очевиден при следующих предельных исходных соотношениях реагирующих веществ (таблица).