способ получения средства, обладающего противоопухолевым действием

Формула изобретения

Способ получения вещества, обладающего противоопухолевым действием, включающий экстракцию растительного сырья и очистку экстракта, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют кору осины при измельченности 5 10 мм, экстракцию проводят 40^o этиловым спиртом в батарее из 5 6 диффузоров с законченным или незаконченным циклом при температуре 18 25^oС при соотношении сырье экстрагент 1 2,3 3 в течение 8 16 ч однократно, а очистку проводят отстаиванием в течение 3 суток при температуре 6 8^oС.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, и может быть использовано для лечения больных злокачественным новообразованием.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является способ получения вещества, обладающего противоопухолевой активностью, включающей экстракцию скорлупы орешков сосны кипящей водой после промывания их спиртом.

Однако технологический процесс при данном способе несовершенен.

Целью предлагаемого изобретения является улучшение технологического процесса.

Поставленная цель достигается путем экстракции коры осины при измельченности 5-10 мм 40^o этиловым спитом в батарее из 5-6 диффузоров с законченным или незаконченным циклом при температуре 18-25^oC при соотношении сырья в экстрагент 1:2,5-1:3 в течение 8-16 часов однократно, а очистку производят отстаиванием в течение 3 суток при температуре 6-8^oC.

Сущность изобретения заключается в следующем: процесс экстракции проводится по двум вариантам.

Вариант 1 (законченный цикл). В каждый диффузор загружают в равных количествах кору осины, измельченную до 5-10 мм и 5-6 приемов для более плотной укладки.

В первый диффузор при открытом спускном кране заливают 40^o этиловый спирт до появления его первых порций, затем кран закрывают и добавляют экстрагент "до зеркала" (соотношение сырье экстрагент в данном и последующих диффузорах составляет 1:2,3-1:3).

Диффузор оставляют для настаивания в течение 8 часов, по истечении этого времени производят слив извлечения, которое направляется во 2-й диффузор. Недостающее "до зеркала" количество экстрагента во втором диффузоре получают путем пропускания необходимого количества 40^o этилового спирта через первый диффузор.

В 1-й диффузор заливают свежую порцию 40^o этилового спирта "до зеркала", оба диффузора оставляют для настаивания в течение 10 часов. В дальнейшем экстрагирование проводят аналогично, по принципу противотока, при котором извлечения, полученные из второго диффузора, заливают в третий, из третьего четвертый и т. д. Все шесть порций свежего экстрагента подаются в первый диффузор. После ввода в работу всех диффузоров батареи отбор всех шести порций экстракта производится из головного шестого диффузора, выводя поочередно хвостовые диффузоры. Экспозиция настаивания на каждой ступени экстрагирования составляет 72 часа, а общая продолжительность 6 суток.

Полученный экстракт тщательно перемешивают, отбирают пробу для анализа. Очистку жидкого экстракта производят путем отстаивания при температуре 6-8^oC в течение 3 суток, после чего готовый экстракт фильтруют.

Вариант II (незаконченный цикл). Кору осины обыкновенной, измельченную до размеров 5-10 мм, загружают поровну в четыре диффузора с 1 по 4. 40^o этиловый спирт подают в перколятор 1 при открытом спускном кране до появления его первых порций, затем кран закрывают и добавляют 40^o этиловый спирт "до зеркала" (в данном и последующих диффузорах соотношение сырье экстрагент 1: 2,5-1: 3). Диффузор оставляют для настаивания в течение 8 часов. По истечении этого времени производят слив извлечения, которое направляется во 2-й диффузор. Недостающие "до зеркала" количество экстракта во 2-м диффузоре получают путем пропускания 40^o этилового спирта через первый диффузор. В 1-й диффузор заливают свежую порцию 40^o этилового спирта "до зеркала", оба диффузора оставляют для настаивания в течение 16 часов.

В дальнейшем экстрагирование проводят аналогично, по принципу противотока, при котором извлечение, полученное из 2-го диффузора, заливают в третий, а затем в 4-й, из которого принимают первую порцию готовой вытяжки.

Все 4 порции экстрагента поступают в 1-й диффузор.

Во время работы батареи загружают сырьем диффузор 5, а как только будет истощен диффузор 1, его отключают от батареи. 40^o этиловый спирт теперь поступает в диффузор 2, а готовую вытяжку принимают из диффузора 5. Освобожденный от отработанного сырья 1-й диффузор загружают свежим сырьем.

После истощения диффузора 2 40^o этиловый спирт поступает в диффузор 3, а готовую вытяжку принимают из диффузора 1. Разгружают и загружают диффузор 2. 40^o этиловый спирт поступает в диффузор 4, а вытяжку принимают из диффузора 2. Разгружают и загружают диффузор 3. 40^o этиловый спирт поступает в диффузор 5, а вытяжку принимают из диффузора 3. Разгружают и загружают диффузор 4.

Далее после отключения 5-го диффузора, в котором сырье истощено и включения диффузора 4 процесс извлечения идет по вышеописанной схеме. Процесс экстрагирования проводят при температуре 18-25^oС. За серию готовой продукции считают смесь извлечений, полученной из 5 перколяторов (диффузоров).

Очистку экстракта производят путем отстаивания при температуре 6-8^o в течение 3 суток, после чего фильтруют.

По данному варианту возможна экстракция в батарее из 6 диффузоров по следующей схеме: кору осины обыкновенной, измельченной до размеров 5-10 мм, загружают поровну в 5 диффузоров с 1 по 5. 40^o этиловый спирт подают в диффузор 1 при открытом спускном кране до появления его первых порций, затем кран закрывают и добавляют экстрагент "до зеркала" (в данном и последующих диффузорах соотношение сырье экстрагент составляет 1:2,3-1:3). Диффузор оставляют для настаивания в течение 8 часов. По истечении этого времени производят слив извлечения, которое направляют во 2-й диффузор. Недостающее "до зеркала" количество экстрагента получают путем пропускания 40^o этилового спирта через 1-й диффузор. В 1-й диффузор заливают порцию 40^o этилового спирта "до зеркала", оба диффузора оставляют для настаивания в течение 16 часов.

В дальнейшем экстрагирование проводят аналогично, по принципу противотока, по которому извлечение, полученное из 2-го диффузора, заливают в 3-й и 4-й, а затем в 5-й, из которого принимают первую порцию готового извлечения.

Все пять порций экстрагента поступают в 1-й диффузор.

Во время работы батареи загружают сырьем диффузор 6, а как только будет истощен диффузор 1, его отключают от батареи. 40^o этиловый спирт поступает теперь в диффузор 2, а готовую вытяжку принимают из диффузора 6. Освобожденный от отработанного сырья 1-й диффузор загружают свежим сырьем.

После истощения диффузора 2 40^o этиловый спирт поступает в диффузор 3, а готовое извлечение принимают из диффузора 1. Разгружают и загружают диффузор 2.

40^o этиловый спирт поступает в диффузор 4, а вытяжку принимают из диффузора 2. Разгружают и загружают диффузор 3.

40^o этиловый спирт поступает в диффузор 5, а извлечение принимают из диффузора 3. Разгружают и загружают диффузор 4.

40^o этиловый спирт поступает в диффузор 6, а вытяжку принимают из диффузора 4. Разгружают и загружают диффузор 5.

Далее после отключения диффузора 6 (в котором сырье истощено) и включения диффузора 5 процесс извлечения идет по вышеописанной схеме. За серию готового продукта считают смесь извлечений, полученных в шести диффузорах. Очистку экстракта производят путем отстаивания при температуре 6-8^o в течение 3 суток, после чего фильтруют.

Полученные экстракты представляют собой прозрачные коричневые жидкости со своеобразным запахом. Содержание суммы фенологликозидов в данных экстрактах составляет не менее 1,25% флавоноидов не менее 0,25% дубильных веществ 1,45-2,06% и липофильных веществ 0,31-0,43% Сухой остаток 9,96-11,84% Крепость спирта 36-38%

Предлагаем примеры конкретного выполнения способа.

Пример 1. 480 г коры осины, измельченной до частиц размером 5 мм, загружают поровну по 80 г в шесть диффузоров в 5-6 приемов для более плотной укладки. 20^o этиловый спирт в количестве 1104 мл порциями по 184 мл заливают в шесть приемов в 1-й диффузор. Экстрагирование проводят по принципу противотока, при котором извлечение, полученное из 2-го диффузора, направляют в 3-й, а из 3-го в 4-й и т.д. (см. схему "вариант 1"). Экспозиция настаивания составляет 8 или 16 часов. Готовую продукцию получают из 6 диффузоров в шесть приемов по 87-88 мл. Общий объем вытяжки составляет 522-528 мл.

Полученный экстракт отстаивают при температуре 8^oС в течение 3 суток, затем фильтруют.

Содержание суммы фенологликозидов в данном экстракте составляет 1,52-1,54% флавоноидов 0,23-0,24% дубильных веществ 2,04-2,06% и липофильных веществ 0,38-0,40% Сухой остаток составил 10,44-11,98% Крепость спирта 16-18%

Пример 2. 480 г коры осины, измельченной до частиц размером 5 мм, загружают поровну по 80 г в шесть диффузоров в 5-6 приемов для более плотной укладки. 40^o этиловый спирт в количестве 1104 мл порциями по 184 мл заливают в шесть приемов в 1-й диффузор. Экстрагирование проводят по принципу противотока, при котором извлечение, полученное из 2-го диффузора, направляют в 3-й, из 3-го в 4-й и т.д. (см. схему "вариант 1").

Экспозиция настаивания составляет 8 или 16 часов. Готовую продукцию получают из 6-го диффузора в шесть приемов по 87-89 мл. Общий объем вытяжки составляет 522-534 мл.

Полученный экстракт отстаивают при температуре 8^oC в течение 3 суток, затем фильтруют.

Содержание суммы фенологликозидов в данном экстракте составляет 1,83-1,85% флавоноидов 0,25-0,36% дубильных веществ 2,04-2,06% а липофильных веществ 0,40-0,43% Сухой остаток 9,96-10,20% крепость спирта 36-38%

Пример 3. 480 г коры осины, измельченной до частиц размером 5 мм, загружают поровну по 80 г в шесть диффузоров в 5-6 приемов для более плотной укладки. 60^o этиловый спирт в количестве 1104 мл порциями по 184 мл заливают в шесть приемов в 1-й диффузор. Экстрагирование проводят по принципу противотока, при котором извлечение, полученное из 2-го диффузора, направляется в 3-й, из 3-го в 4-й и т.д. (см. схему "вариант 1"). Экспозиция настаивания составляет 8 или 16 часов. Готовую продукцию получают из 6-го диффузора в шесть приемов по 84-88 мл. Общий объем вытяжки 504-528 мл. Полученный экстракт отстаивают при температуре 8^o в течение 3 суток, затем фильтруют.

Содержание фенологликозидов в данном экстракте составляет 1,74-1,77% флавоноидов 0,25-0,26% дубильных веществ 2,02-2,04% и липофильных веществ 0,51-0,55% Сухой остаток 11,98-12,40% крепость спирта 56-58%

Пример 4. 480 г коры осины, измельченной до частиц размером 5 мм, загружают поровну по 80 г в шесть диффузоров в 5-6 приемов для более плотной укладки. 80^o этиловый спирт в количестве 1104 мл порциями по 184 мл заливают в шесть приемов в 1-й диффузор. Экстрагирование проводят по принципу противотока, при котором извлечение, полученное из 2-го диффузора, направляют в 3-й, из 3-го в 4-й и т.д. (см. схему "вариант 1").

Экспозиция настаивания составляет 8 или 16 часов. Готовую продукцию получают в шесть приемов из 6-го диффузора по 85-87 мл. Общий объем вытяжки составляет 510-522 мл.

Полученный экстракт отстаивают при температуре 8^oС в течение 3 суток, затем фильтруют.

Содержание суммы фенологликозидов в данном экстракте составляет 1,55-1,57% флавоноидов 0,24-0,25% дубильных веществ 2,06-2,08% и липофильных веществ 0,90-0,92% Сухой остаток 12,05-12,48% крепость спирта 76-78%

Приведенные в таблице 1 результаты показывают, что выход суммы основных биологических активных веществ (фенологликозидов и флавоноидов) из коры осины зависит от концентрации этанола. Повышение концентрации до 60^o и более и уменьшение до 20^o приводит к снижению их выхода. Оптимальной концентрацией этанола следует считать 40^o, т.к. в результате эксперимента получен наибольший выход фенологликозидов 83,9811,3% и флавоноидов 82,822,21% Выход дубильных веществ почти не зависит от концентрации спирта, выход же суммы липофильных веществ увеличивается с повышением концентрации спирта.

Кроме того, данная концентрация этанола (40^o) обеспечивает большую микробиологическую устойчивость препарата в процессе экстракции по сравнению с 20^o этанолом и меньший расход этилового спирта по сравнению с 60^o и 80^o.

Увеличение количества диффузоров в батарее (таблица 2) приводит к увеличению выхода основных биологически активных веществ с 70,90 до 83,96% и 66,65 до 82,82% соответственно для фенологликозидов и флавоноидов (реперколяция с законченным циклом).

Оптимальное время экстрагирования определяли по одному из основных биологически активных веществ флавоноидам. Результаты исследования, приведенные в таблице 3, показывают, что оптимальным временем однократного настаивания следует считать 8 часов, т.к. увеличение времени до 12 часов и выше не приводит к повышению содержания суммы флавоноидов.

Таким образом, равновесное состояние в системе достигается в течение 8 часов настаивания.

Увеличение продолжительности настаивания в ряде диффузоров с 8 часов (время достижения равновесного состояния в системе) до 16 часов объясняется односменной работой фармацевтических предприятий, на которых предполагается изготовление данного экстракта.

Данные таблицы 4 показывают, что размер частиц 5-10 мм обеспечивает одинаковый выход основных биологически активных веществ, а увеличение до 15 мм приводит к незначительному снижению выхода фенологликозидов (с 83,98 до 83,19%) и значительному снижению выхода флавоноидов (с 82,82 до 75,71%).

В таблице 5 приведены данные, позволяющие определить оптимальное время отстаивания жидкого экстракта при 6-8^oC, которые показывают, что увеличение времени отстаивания более 3 суток не приводит к увеличению объема образовавшегося осадка, а при его снижении не достигается требуемая степень очистки.

Из данных таблицы 6 видно, что содержание биологически активных веществ в полученных экстрактах следующее: флавоноидов 0,25-0,29% фенологликозидов 1,25-1,85% дубильных веществ 1,45-2,08% липофильных веществ 0,31-0,43% при истощенности сырья на 82,28-83,17% что достигается при соотношении сырье-экстрагент 1:2,3-1:3.

Изучение противоопухолевого действия заявляемого средства проводилось на модели аденокарциномы Эрлиха. В качестве препарата сравнения был выбран винбластин индолиндолиновый алкалоид из растения барвинок розовый (Vinca Rosca L), который широко используется в настоящее время в клинической химиотерапии.

В экспериментах показано, что однократное введение экстрактов из коры осины на 20% 40% 60% этаноле приводит к статистически достоверному торможению роста опухоли. Винбластин инъецировали внутривенно в дозе 1/5 LД₅₀ через 48 часов четыре раза (МПД=2,2 мг/кг, LД₅₀=2,4 мл/кг) (1).

Следует отметить, что вышеуказанные экстракты обладают идентичным эффектом по сравнению с винбластином в данном эксперименте.

На модели перевиваемой аденокарциномы Эрлиха мышей показана наибольшая противоопухолевая эффективность экстракта из коры осины на 40% этаноле, полученного предлагаемым способом. Торможение роста опухоли после курсового введения в дозе 1 мл/кг предлагаемого препарата составило 30-73% при этом данный эффект был сопоставляем с идентичным действием винбластина.

Полученный описанным способом экстракт обладает противоопухолевой активностью, превышающей или сравнимой с известным препаратом винбластином.