способ получения с1-инактиватора человека

Формула изобретения

Способ получения C₁-инактиватора человека путем осаждения донорского сырья полиэтиленгликолем до насыщения 16 вес/объем и использования ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе, отличающийся тем, что в качестве сырья используют осадок IY-I, образующийся в процессе производства препаратов гаммаглобулина человека спиртовым методом Кона, осуществляют осаждение полиэтиленкгликолем с молекулярной массой 4000 6000 D и завершают очистку аффинной хроматографией на гепарин-агарозе.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицинской промышленности и может быть использовано в прикладной иммунохимической практике для получения высокоочищенного C1-инактиватора в качестве антигенного материала.

C1-инактиватор является единственным прямым регулятором активации классического пути комплемента человека непрямым ингибитором калликреин-кининовой, свертывающей и фибринолитической систем. Это, а также особенности механизма его действия позволяет отнести его к семейству сывороточных белков крови, называемому "серпинами".

Выпуск C1-инактиватора человека в отечественной медицинской промышленности в настоящее время не налажен.

В зарубежной практике для приготовления концентрата C1-инактиватора в качестве лечебного препарата наиболее широко используется способ получения C1-инактиватора с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефацеле методом batchwise (с целью удаления протромбинового комплекса) и элюцией C1-инактиватора буферным раствором состава: 2М NaCl, 0,1 М трехзамещенного цитрата натрия. Элюат подвергали последовательному осаждению сульфатом аммония до насыщения 50% при температуре 0^oС и до насыщения образовавшегося супернатанта 65% и 0^oС. При этом в первом случае в преципитате оставались церрулоплазмин, компоненты системы комплемента С3 и С4, а во втором случае С1-инактиватор в преципитате и альбумин в растворе. Для стабилизации использовали 0,01 М цитрат натрия и 0,15 М хлорид натрия.

Описаны также методы удаления примесей церрулоплазмина с помощью хроматографии и бикарбоксиметиламино-агарозе или лизин-сефарозе. В лабораторной иммунохимической практике для очитки C1-инактиватора используются аффинные сорбенты, содержащие лектины в качестве связывающей группировки, например Jakalin, а также матрицы с гидрофобными группировками, такие, как, фенил-агароза.

Прототипом предлагаемого способа очистки C1-инактиватора является метод, предполагающий использование фракционирования пула донорской плазмы крови человека полиэтиленгликолем (ПЭГ) с молекулярной массой 4000 до насыщения 16% (вес/объем) в течение 1 часа при постоянном перемешивании, удалением преципитата с помощью центрифугирования и последующем насыщении полученного супернатанта ПЭГ 4000 до 45% (вес/объем). Осадок после отделения центрифугированием и растворения подвергали ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефацеле, а элюцию С1-инактиватора осуществляли с помощью линейного солевого градиента хлористым натрием до конечной концентрации ионов 0,3 М. На последующих этапах очистки использовали цинк-хелатную хроматографию с целью удаления примесей церрулоплазмина и аффинную иммуноадсорбентную хроматографию для получения высокочастотного C1-инактиватора.

Все перечисленные выше способы очистки C1-инактиватора сориентированы на получение препарата для лечебных и профилактических целей при приобретенном или врожденном ангионевротическом отеке типа Квинке, т. е. предполагают сохранение максимальной ферментативной активности белка, отсутствие контаминации НВS-антигеном, вирусом иммунодефицита человека и апирогенность. При этом в препарате допускается присутствие примесей некоторых белков (церрулоплазмин, альбумин и др.), которые не мешают реализации биологической функции C1-инактиватора и практически безвредны для пациента. Все выше перечисленное достигается использованием нормальной донорской плазмы крови человека в качестве основного сырья для приготовления препарата, применением разнообразных стабилизаторов С1-инактиватора, фракционирования с помощью сульфата аммония различных степеней насыщения, стерильных условий работы и пастеризацией готовой формы, что является основным недостатком производства и делает его дорогостоящим, а сам препарат малодоступным для широкой лабораторной практики. В то же время при использовании C1-инактиватора в прикладной иммунохимической практике в большей части исследований недостаточно сохранение только антигенных свойств препарата, но необходимо также, чтобы он обладал высокой степенью очистки, при этом уровень ферментативной активности практического значения не имеет.

В связи с вышесказанным целью предлагаемой разработки является удешевление способа производства С1-инактиватора для использования в лабораторной иммунохимической практике в качестве антигенного материала и повышения его частоты. Цель изобретения достигается тем, что в качестве сырья, помимо дефицитной и дорогостоящей нормальной донорской плазмы, используется бросовый осадок 1U-1, получаемый в процессе производства препаратов гамма-глобулина человека спиртовым методом Кона, содержащий некоторые белки плазмы крови, в частности С1-индикатор в практически неактивной форме, но с антигенной структурой, идентичной нативной, а также использование на одном из этапов очистки доступного и недорогого отечественного аффинного сорбента гепарин-агарозы, который обладает способностью неспецифически взаимодействовать с некоторыми белками системы комплемента человека, в том числе и с C1-инактиватором.

Выделение C1-инактиватора осуществляли следующим образом: 20 г осадка 1U-1 растворяли в 100 мл буфера состава 0,02 М двухзамещенного фосфата натрия, 0,05 М трилона Б, 1 М аминокапроновой кислоты, 0,009 М хлористого натрия, pН 7,4 (буферный раствор 1). При этом содержание C1-инактиватора составляло 130 мкг/мл. После растворения осадка проводили его экстракцию на холоде (4^oС) в течение 2 часов. Осадок подвергали центрифугированию на центрифуге К-24 "Janezki" при 10000 g, 20 мин, 5^oС. Осадок выбрасывали, а к супеpнатанту добавляли сухой (ПЭГ) с молекулярной массой 4000 6000 до насыщения 16% (вес/объем) и инкубировали на магнитной мешалке при 4^oС в течение 2 часов, после чего удаляли осадок центрифугированием, как было указано выше. Супернатант смешивали с буферным раствором 1 в соотношении 1 1 и подвергали хроматографическому разделению на ДЭАЭ-сефадексе (возможно использование любого аналогичного катионита), уравновешенного буферным раствором 1. Объем сорбента составлял 200 мл. Элюцию связавшейся фракции белков вели градиентом хлористого натрия: 300 мл буферного раствора 1 постепенно смешивали с 300 мл того же буфера, содержащего 0,6 М хлористого натрия при pН 7,4. Элюат собирали отдельными фракциями объемом 10 мл и отбирали пробы, содержащие C1-инактиватор, с помощью двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтеpлони с использованием моноспецифической антисыворотки к C1-инактиватору человека производства фирмы "Вehring" (Германия). С1-инактиватор обогащенные фракции объединяли и концентрировали на "Amicon" РМ 10. Концентрат подвергали ионообменной хроматографии на гепарин-агарозе, уравновешенной буфером 1 (объем сорбента 20 мл). Элюцию аффинно-связанной фракции осуществляли с помощью градиента хлористого натрия до насыщения 1,5 моль/л. Фракция, содержащая C1-инактиватор, отбиралась таким же образом, как и при фракционировании на ДЭАЭ-сефадексе, и концентрировалась. Иммунохимическая "чистота" препарата подтверждалась с помощью метода иммуноэлектрофореза по Уильямс и Грабар, а также электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ). При этом использовали моноспецифическую антисыворотку к C1-инактиватору производства фирмы "Behring" (Германия) и сыворотку, преципитирующую белки плазмы крови человека, производства Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии. Препарат формировал одну линию преципитации в альфа-2-зоне глобулинов при взаимодействии с сывороткой, преципитирующей белки плазмы крови, идентичную линии преципитации, образованной с моноспецифической антисывороткой к С1-индикатору. При электрофорезе в ПААГе после окраски выявилась единственная в альфа-2-зоне глобулинов.

Полученный таким образом С1-инактиватор является антигенным материалом, который можно с успехом использовать в прикладной иммунохимической практике в качестве:

1) антигена для иммунизации животных с целью получения моноспецифической антисыворотки к данному белку;

2) антигена для истощения примеси антител, специфично связывающих С1-инактиватор, при производстве других моноспецифических антисывороток;

3) стандарта при количественном анализе С1-инактиватора в сыворотках больных приобретенным и врожденным ангионевротическим отеком Квинке (при других патологических состояниях в соответствии с целями исследований) и здоровых доноров методом радиальной иммунодиффузии по Манчини;

4) в препаративной биохимической практике при идентификации С1-инактиватора.