способ получения 
-ирона
| Классы МПК: | C12N1/22 способы, использующие, или питательные среды, содержащие целлюлозу или ее гидролизаты |
| Автор(ы): | Беатрис Белькур[FR], Дидиэ Куртуа[FR], Шарл Эрэ[FR] |
| Патентообладатель(и): | Живодан-Рур С.А. (FR) |
| Приоритеты: |
подача заявки:
1989-08-04 публикация патента:
20.11.1996 |
Использование: в пищевой и фармацевтической промышленности и касается получения g-ирона биоконверсией. Сущность способа заключается в том, что проводят биоконверсию путем обработки сырья бактериальной культурой Serratia liguefaciens или Enterobacter cloacae или Escherichia coli, или Pseudomonas fluorescens, или Pseudomonas maltophilia в течение 1 - 15 суток при температуре от 15 до 40oC на полутвердой или жидкой среде, представляющей собой традиционную смесь среды для культивирования клеток растений на мясопептонно-дрожжевой основе, либо путем обработки сырья культуральной средой, полученной при культивировании вышеуказанных бактерий на той же среде, или ее фракциями, а в качестве сырья используют корневища, части корневищ или культуры клеток растений Iris pallida, Iris florentina, Iris germanica или Iris of verona при соотношении сырье:среда от 1:20 до 2:1. 1 ил., 10 табл.
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4
Формула изобретения
Способ получения гамма-ирона путем биоконверсии из биологического сырья, включающий сбор сырья, его инкубацию, экстракцию и/или дистилляцию ирона из сырья, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности способа и сокращения времени процесса, биоконверсию осуществляют путем обработки сырья бактериальной культурой Serratia liguefaciens, или Enterobacter cloacae или Escherichia coli, или Pseudomonas fluorescens, или Rseudomonas maltophilia в течение 1 15 суток при температуре от 15 до 40oС на полутвердой или жидкой среде, представляющей собой традиционную смесь среды для культивирования клеток растений на мясопентонно-дрожжевой основе, либо путем обработки сырья культуральной средой, полученной при культивировании указанных бактерий на той же среде, или ее фракциями, а в качестве сырья используют корневища, части корневищ, отходы от экстракции корневищ, экстракты корневищ или культуры клеток растений Iris pallida, Iris florentina, Iris germanica или Iris of verona при соотношении сырье среда от 1 20 до 2 1.Описание изобретения к патенту
Изобретение относится к способу полученияЦель предлагаемого способа ускорить процесс биоконверсии с получением более высокого выхода
На чертеже показано кинетическое изучение получения
Используемую бактериальную культуру штаммов
Serratia liquefaciens,
Enterobacter cloacae,
Escherichia coli,
Pseudomonas fluorescens,
Pseudomonas maltophilia
предварительно и предпочтительно получают и выделяют из корневищ растения Iris. Для этого корневища чистят от грязи, очищают от кожуры, стерилизуют, разделяют на маленькие кусочки и помещают в питательный бульон, затем инкубируют для выращивания бактерий; выросшие штаммы изолируют, например, методом обычного разбавления, очищают и идентифицируют, например, с помощью биохимических тестовых полосок. Подходящий питательный бульон для роста бактерий может содержать
/I/ пептон;
/II/ мясной экстракт;
/III/ дрожжевой экстракт;
/IV/ неорганические соли, например NaCl, NH
(I) большинство неорганических питательных сред;
(II) следы элементов;
(III) источник ирона;
(IV) органические добавки (витамины);
(V) источник углерода;
(VI) органические добавки (регуляторы роста растений). Предпочтительными средами являются среда Мурашига и Скуга, среда Гамборга, модифицированная Геллер-среда, модифицированная среда Скуга. Эти среды могут использоваться в смеси с питательным бульоном, используемым для выращивания бактерий, таким как мясопептонный дрожжевой экстракт. В качестве сырья используют корневища растений семейства Iris, в частности Iris pallida, Iris florentina, Iris germanica или Iris og Verona. Корневища, предпочтительно взятые у этих растений в вегетативном состоянии, могут быть использованы свежими, то есть вскоре после сбора урожая. Перед обработкой корневища очищают от земли и от кожуры и стерилизуют. В случае, если в качестве сырья используют культуру клеток растений, то она может быть стимулирована из эксплантата на обычных культуральных средах, перечисленных выше, используя стандартные методики, и полученные таким образом клетки растения в конце концов соединяют с культурой микроорганизма. Подходящим температурным интервалом является интервал от 15 до 403C, а область от 25 до 35oC является предпочтительной. Время реакции составляет от 1 до 15 суток, а время реакции от 3 до 6 дней является предпочтительным. Соотношение корневище: среда составляет от 1:20 до 2:1, где соотношение 1:10 до 1:1 является предпочтительным. В случае добавки питательного бульона целесообразное отношение среды культуры клеток растения к общей среде (то есть среда культуры клеток растения + питательный бульон) составляет около 0,5 0,95:1. Для полутвердых сред, содержащих отверждающий агент, преимущественно агар, последний добавляют при окончательной концентрации около 6 15 г/литр, предпочтительно 8 12 г/литр. Выделение готового продукта осуществляют обычными методами, как это делается, например, для отделения летучих из растений или из ароматических и вкусовых добавок, т. е. перегонкой паром или техникой Likens-Nickerson, включающей одновременно перегонку паром и экстракцию, и использование любого летучего органического растворителя, предпочтительно метиленхлорида, диэтилового эфира, гексана и т.д. Естественно ферментативную обработку можно также осуществлять в биореакторах, например, путем дозированного культивирования или непрерывного культивирования. Во всех этих случаях обычные способы ферментации могут быть применены, включая использование разделенных фаз культур. Вместо использования бактерий можно также использовать культуральную среду, полученную при культивировании бактерий. Такие среды получают путем приготовления водных экстрактов бактерий и при желании очисткой таких фракций, например, хроматографическими методами, например ионообменной хроматографией, жидкостной хроматографией, гельфильтрацией (предпочтительно), электрофорезом геля, афинной хроматографией и т.д. Обычно работают в буферных растворах, например, при pH между 5,5 6,5. Очень часто очистка даже необязательна, и может быть использован необработанный экстракт. Выделения o-ирона из остающихся иронов обычно не требуется. Если необходимо, его можно, однако, выполнить обычным путем, например, хроматографическими методами. Пример 1. Получение g-ирона обработкой корневищ касатика культурой Serratia liquefaciens на полутвердой среде. Корневища Iris pallida берут из растения в вегетационном периоде. Их прежде всего очищают от избытка земли и от кожуры для того, чтобы удалить наружный эпидерм. Затем их обеззараживают путем погружения сначала в водный спиртовой раствор (70% EtOH/ 30% HaO по об.) в течение 30 секунд, затем в водный раствор HgCl2 (1 г/л) в течение 30 секунд и окончательно промывают их три раза дистиллированной водой. (Другим более простым средством стерилизации является автоклавирование при 1202C в течение 20 минут). Обеззараженные корневища (5 г) нарезают на маленькие кусочки весом около 0,5 г и помещают на поверхность полутвердой среды Мурашига и Скуга (агар:10 г/л) (см. примечание 1 ниже), которая предварительно инокулирована путем затравки бактериальной суспензией Serratia liquefaciens (примечание 2). В качестве контрольного эксперимента используют незасеянную бактериями твердую среду Мурашига и Скуга при прочих равных условиях. Инкубацию проводят при 30oC в течение 15 дней. В конце этого периода корневища и соответствующую среду экстрагируют либо вместе, либо раздельно (т.е. после отделения частей корневищ, например, фильтрацией через нейлоновый холст, размер пор 50 мкм), осуществляя одновременно дистилляцию и экстракцию (методика Likens-Nickerson, см. примечание 3). Собранные экстракты (экстракты корневищ + среда), анализированные ГХ и ГХ/МС (примечание 4) показывают следующие приблизительные результаты: транс-o-ирон 5,4% цис-a-33% и цис-g-ирон 61% неидентифицируемый остаток 0,6% (считая, что общее количество иронов должно быть 100%). Если сравнить с контрольным экспериментом (2,8 мкг/г в собранных экстрактах/г свежих корневищ, использованных в качестве субстрата), то количество цис-g-иронов на (67 мкг/г свежих корневищ), главного природного изомера, полученного обработкой свежих корневищ с Serratia liquefaciens, увеличивается как фактор в 24 раза. Примечание 1. К среде Мурашига и Скуга добавляют 1 мг/л 6-фурфуриламинопурина (кинетин) и 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и вносят 12 мл среды и 0,5 г корневищ на каждую пробирку. Примечание 2. Получение, выделение и идентификация бактерий Serratia liquefaciens. Корневища Iris pallida очищают от избытка земли, от кожуры и обеззараживают (30 секунд в водном спиртовом растворе, 70% EtOH/ 30% H
транс-o-ирон 6,5%
цис-a-ирон 34%
цис-g-ирон 58%
b-ирон 1,5%
неидентифицированные ирон(ы) 0,2%
В отличие от вышеприведенного классическая экстракция по Likens-Nicherson (без микробиологической обработки) созревших корневищ (серия III) дает 700 мг иронов/кг сухого веса корневищ при следующем распределении:
транс-a-ирон 4%
цис-a-ирон 44%
цис-g-ирон 50%
b-ирон 1,2%
неидентифицированное 0,8%
Примечание 5. При нормальных условиях роста бактерий обработка корневищ касатика с Serratia liquefaciens с использованием только питательного бульона /т.е. обычный питательный бульон для роста бактерий/ не приводит к какому-либо увеличению содержания иронов. Примечание 6. Кинетическое исследование показало, что для серии I максимальное содержание (720 кг иронов/кг сухого веса корневищ) получают после 5 дней инкубации (сравни чертеж). б/ Эксперимент с некоторыми другими типами сред для культивирования клеток растений. Заменяют среду Мурашига и Скуга на следующие типы сред для культивирования клеток растений (среда Гамборга, названная средой B5, модифицированная среда Геллера, модифицированная среда Скуга, см. Plant Jissue Culture, Theory and Practure, S.S.Bhojwani and M.K. Razdaw, Elsevier, 1983), используя неизменные условия реакции (см. пример 2а), которые приводят также к существенному увеличению содержания иронов согласно результатам таблицы 2. Штамм Serratia liquefaciens, используемый в примерах, зарегистрирован как S. I.I.V под номером 1-780 12 июля, 1988 в Институте Пастера, Коллекция национальных культур микроорганизмов (C.N.C.M.). Пример 3. Получение g-ирона путем обработки корневищ растения Iris некоторыми другими бактериальными штаммами. Свежие корневища (серия I, пример 2) обрабатывают, как в примере 2а, в течение одной недели, используя одни из следующих бактерий:
Энтеробактерии:
Enterobacter cloacae g
Escherichia coli х
Псевдомонацеи:
Pseudomonas fluorescens xx
Pseudomonas maltophilia (АТСС 17866)
x Выделенный из корневищ Iris (методику выделения см. в примере 1, примечание 2) штамм Е. cloacae зарегистрирован как Е. cloacae 1 под номером 1-77, 12 июля, 1988 при C.N.C.M. x Штамм 54127, субкультивированный из коллекции Бактерийного отделения института Пастера. Штамм перерегистрирован как Е.Coli 2 под номером 1-794 28 июля, 1988 при C.N.C.M. 1-779, 1-780 и 1-794 являются депозитами Будапешта. После инкубации корневища соответствующую среду экстрагируют и анализируют, как описано в примере 1а. Результаты, выраженные в мг ирона/кг сухого веса корневищ, даны в таблице 3. Пример 4. Получение xx-ирона путем обработки других субстратов, полученных из Iris pallida с Serratia liquefaciens в жидкой среде. a/ Культивирование клеток растения Iris pallida. Культивирование каллуса Iris pallida было инициировано на среде Мурашига и Скуга (см. пример 1, примечание 1) и на среде Гамборга (см. пример 2б), согласно классической методике (Plant Tissue, Theory and Practice, S.S. Bhojwani and M. K. Razdaw. Elsevier, 1983). Два штамма 11 и 12 культур клеток растения Iris выдерживают на чашках Петри, содержащих 45 мл полутвердой среды Мурашига и Скуга, и субкультивируют в каждый месяц на свежей среде. Эти штаммы переносят в жидкую среду (Марашига и Скуга или Гамборга без агара), выдерживают на гераторном встряхивателе (26gC, 100 оборотов/мин, 15 дней), фильтруют через найлоновый холст (размер пор 50 мкм) и субкультивируют каждые две недели на свежей среде. После того, как культуры достигнут двухнедельного возраста, 5 г свежевзвешенных клеток помещают в 250 мл склянки Эрленмейера, содержащие 100 мл среды Мурашига и Скуга и 10 мл питательного бульона (см. пример 1). Каждую склянку за исключением тем, которые используют для контрольных экспериментов, засевают 0,5 мл культурой Serratia liquefaciens возраста 24 часов. Затем их инкубируют на гераторном встряхивателе (100 оборотов/мин) при 25oC в течение двух недель. В конце этого периода биомассу вместе со средой экстрагируют и анализируют, как описано в примере 1. Результаты, выраженные в мг иронов/кг сухого веса клеток касатика, даны в таблице 4. б/ Обработка отходов Iris. Эти отходы являются остатками, возвращенными после промышленной гидростилляции порошкообразных корневищ растения Iris. Эти отходы обрабатывают, как описано в примере 2а, с Serratia liquefaciens. В таблице 5 результаты анализа обработанных отходов (мг o-ирона/кг отходов) сравнивают с результатами контрольного эксперимента (без бактерий). в/ Обработка экстрактов растения Iris. Сырой экстракт корневищ растений Iris (из серии II, см. пример 2) приготавливают следующим образом: хорошо порезанные корневища (1000 г) экстрагируют дважды с 1000 мл метанола при перемешивании в течение 4 часов. После фильтрации собранные вместе метальные растворы концентрируют. 5 г образца этого полученного сырого экстракта растворяют в метаноле (10 мл) и порции этого раствора (0,5 мл), стерилизованные микрофильтрацией (Sartorius NMLPF 0,22 мкм мембрана), добавляют в склянки Эрленмейера, каждая из которых содержит 100 мл стерильной среды Мурашига и Скуга и 10 мл стерильного питательного бульона. После засеивания 0,5 мл культуры Serratia liquefaciens возраста 24 часа (питательный бульон, 25gC, гераторный встряхиватель) склянки инкубируют в течение 7 дней. Всю биомассу экстрагируют и анализируют, как описано в примере 1. Результаты перечислены в таблице 6. Пример 5. Получение o-ирона путем обработки свежих корневищ растения Iris культурой Serratia liquefaciens в биореакторах в массе или в условиях разделения двух фаз. а/ Получение иронов в массе в перемешиваемом биореакторе. Порошковые корневища (150 г) из серии 11 (см. пример 2) и три литра среды Мурашига и Скуга помещают в 5-литровый биореактор и автоклавируют при 115gC в течение 25 минут. После добавления 300 мл стерилизованного питательного бульона (см. пример 1) смесь засевают 50 мл бактериальной суспензии Serratia liquefaciens (см. пример 1). Культуру выдерживают при 25oC в течение 8 дней при механическом перемешивании (100 об/мин) и аэрации 0,2 об.об.мин (0,2 объемов воздуха/объем среды/мин). Пробы по 100 мл берут после 1, 2 и 5 дней для анализа. Контрольный эксперимент без бактериального засевания (то есть среда, не засеянная Serr. liq.) проводят в склянке Эрленмейера на гераторном встряхивателе в идентичных условиях. Экстракция образцов дает результаты, как представлено в таблице 7 (анализ проводят, как описано в примере 1). б/ Получение o-иронов в условиях разделения двух фаз. Рабочие условия для поддержания корневищ, отделенных от бактерий путем диализа на мембране. Маленькие кусочки очищенных от кожуры корневищ растения Iris (серия I, пример 2) помещают в 10 см трубки для диализа (Prolabo [BP 369; 75525 Paris Cedex] ссылка 24132, 5 г/трубка) и оба конца трубок закрывают специальными пластиковыми соединениями (Spectra [Spectrum Medical Industry Inc. 60916 Terminal Annex. Los Angeles, California 960] ссылка 132736). Каждую из приготовленных таким образом трубок для диализа помещают в 500 мл склянку, содержащую 250 мл среды Мурашига и Скуга, и все это актоклавируют при 115gC в течение 20 минут. После охлаждения и добавления питательного бульона (30 мл) каждую склянку, за исключением склянок, используемых для контрольных экспериментов, засевают 1,5 мл бактериальной суспензии Serratia liquefaciens (см. пример 1). После одной недели инкубации при 25oC на гераторном встряхивателе (100 об/мин) биомассу (корневища, за исключением трубки и бактерии, за исключением склянки) и среду (за исключением трубки и за исключением склянки) экстрагируют и анализируют, как описано в примере 2а. Результаты показаны в таблице 8. Пример 6
Получение o-ирона путем обработки корневищ растений Iris культуральной средой, полученной при культивировании бактерий, свободной от клеток бактерий. Способ проводят в две стадии:
первая стадия: получение "кондиционированной среды", т.е. инкубация корневищ растений Iris со штаммом Serratia liquefaciens в жидкой среде культуры клеток растения + питательный бульон и отделение оставшихся корневищ, эта среда теперь содержит ферменты;
вторая стадия: инкубация корневищ Iris в "кондиционированной среде". a/ Первая стадия:
Сухие корневища (серия II, пример 2) инкубируют с Serr. liq. как в примере 2а (4х250 мл склянок Эрленмейера) в течение одной недели за исключением того, что среду Мурашига и Скуга заменяют буферной средой для культивирования клеток растения, которую готовят следующим путем:
биологический буфер (М.Э.С. т.е. 2-/N-морфолин/-этансульфокислота, Sigma ссылка: M N 8250) добавляют к нестерилизованной среде Мурашига и Скуга, чтобы получить концентрацию 50 ммоль/л и pH доводят до 6, используя раствор 3N КОН. Смесь автоклавируют при 115gС в течение 20 минут или стерилизуют микрофильтрацией (Millipore мембрана, 0,2 мкм). После инкубации в течение одной недели не наблюдают никакой бактериальной жизнедеятельности в четырех склянках. По окончании этого периода оставшиеся корневища отделяют от среды фильтрацией через найлоновый холст с пористостью 50 мкм. В дальнейшем полученный таким образом фильтрат (среда + убитые клетки бактерий + ферменты) называют "кондиционированной средой". б/ Вторая стадия. "Кондиционированную среду" (100 мл) центрифугируют при температуре 0 - 4oC при 12000 g в течение 10 мин или при 43140 g в течение 20 мин для того, чтобы отделить сначала мертвые клетки бактерий от среды. Супернатант используют для того, чтобы инкубировать 5 г корневищ растения Iris (серии II, примера 2, стерилизованные автоклавированием при 120oC в течение 30 мин) в 250 мл склянке Эрленмейера, на гераторном встряхивателе (100 об/мин, при 25oC в течение одной недели). Остаток от центрифугирования смешивают с 100 мл предварительно приготовленной буферной средой Мурашига и Скуга, pH которой доводят до 5 и затем используют, как указано выше, для того, чтобы инкубировать 5 г корневищ. Контрольные эксперименты, используя "кондиционированную среду" с и без корневищ, проводят в остальном в идентичных условиях. Экстракция образцов и анализ, как описано в примере 1, дали результаты, представленные в таблице 9. Выводы:
a/ установлено образование o-ирона за исключением (несозревших) корневищ в жидкой среде (см. также пример 2). б/ установлен факт, что основная часть активных ферментов, растворимых в воде, является внеклеточными ферментами. Пример 7. Получение g-ирона путем обработки корневищ растений Iris фракцией культуральной среды, полученной при культивировании бактерий. Методика является той, как описано в примере 6, за исключением того, что "кондиционированную среду", приготовленную в первой стадии примера 6, замещают так называемой "прекультурой" (без использования корневищ), полученной следующим путем:
100 мл буферной среды культуры клеток растения, полученной, как описано в примере 6, и 10 мл питательного бульона (см. пример 1) добавляют в каждую склянку из группы 4х250 мл склянок Эрленмейера. Каждую из склянок засевают штаммом Serratia liquefaciens и инкубируют, как в примере 2. После инкубационного периода в 24 часа эту культуру, названную прекультурой, используют на второй стадии вместо "кондиционированной среды", как описано в примере 6. Результаты даны в таблице 10.
Класс C12N1/22 способы, использующие, или питательные среды, содержащие целлюлозу или ее гидролизаты