способ получения фактора, подавляющего метастазы

Формула изобретения

Способ получения фактора, подавляющего метастазы (ФПМ), включающий контактирование адаптированных гематопоэтических клеток человека, способных к продуцированию фактора, подавляющего метастазы, и выделение указанного ФПМ, где пролиферацию этих клеток осуществляют в питательной культуральной среде, либо путем их имплантации в организм млекопитающего, исключая человека, или в организм птицы, либо в диффузной камере, обеспечивающей введение клеток наружно или изнутри в организм млекопитающего или птицы, отличающийся тем, что фактор, подавляющий метастазы, имеет мол. м. 10000-450000, измеренную гель-фильтрацией, а указанные клетки выбирают из группы, состоящей из клеток RAMOS (ATCC CRL 1596), HPB MLT-клеток (FERM BP-2430), клеток MOLT-3 (ATCC CRL 1552), клеток TALL-1 (JCRB 0086) и клеток U-937 (ATCC CRL 1593).

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается способа получения подавляющих метастазы фактора (в дальнейшем сокращенно MIF), в частности способа получения MIF, который включает предоставление возможности установленной человеческой гематопоэзной клетки производить MIF и выделение MIF.

Вероятная продолжительность жизни в Японии увеличивается из года в год. Согласно Nippon Tokei Nenkan (Japanese Statistical Yearbook), 37 изд. опубл. Японской статистической ассоциацией (1987 г.), продолжительность жизни в 1985 г. была 74, 78 лет для мужчин и 80, 84 года для женщин. Самой распространенной причиной смерти являются злокачественные опухоли, или рак, что составляет около 25% от общего числа смертей.

Лечение раковых заболеваний проводилось в основном хирургическим вмешательством, химиотерапией и облучением. Эти терапии, однако, могут убить основную часть растущего рака, но могут рассеивать оставшиеся пузырьковые раковые клетки в теле пациента, что ускоряет их метастазы. Это может привести к еще более опасному развитию рака и к еще большему сокращению остатка жизни пациента.

При подавлении метастаз рака страдания пациента уменьшаются и остаток его жизни может быть значительно продлен. Вследствие этого возникла потребность в разработке способа, который эффективно подавлял бы метастазы раковых опухолей.

Наиболее близким техническим решением той же задачи является способ получения фактора, подавляющего метастазы рака путем контактирования иммунокомпетентных клеток с индукторами с последующей их имплантацией в чистом виде или в диффузионной камере млекопитающему, либо птице и выделяют целевой продукт (FP, Патент N 2522267, кл. А 61 К 37/02, 1983 г.).

Вследствие этого основной целью изобретения является разработка способа получения MIF, который без особых трудностей можно осуществлять в промышленных масштабах.

Мы защищаем несколько подавляющих метастаз веществ, которые легко могут быть поставлены на коммерческую основу, а также возможность их получения в промышленном масштабе.

В результате этого нами установлено, что подавляющие метастазы вещества могут быть защищены при сопоставлении их подавляющей метастаз активности PRMI 4788 клеток (FERM BP-2429), появляющейся в результате рака толстой кишки человека. Более того, мы предлагаем способ получения MIF, который включает возможность выявления человеческой гематопоэзной клетки, способной производить MIF для производства MIF, и извлечения MIF.

Формулировка "выявленная человеческая гематопоэзная клетка" включает понятие, которое описано, например, в "Белки, нуклеиновые кислоты и энзимы", т. 20, N 6, с. 616- 643 (1975 г.), Catalogue of the Japanese Cancer Research Resources Bank (1988) и Catalogue of ATCC Cell Lines et Hybridomas, 6 изд. (1988 г.)

Соответственно предпочтительными являются выявленные человеческие гематопоэзные клетки, которыми являются T-группы, В-группы, ни Т-ни В-группы и миеломоноцитной группы. Например, человеческие Т-клетки, такие как ССRF-СЕМ клетка, HPB-MLT клетка, MOLT-3 клетка, MOLT-4 клетка, Р 12/IСН клетка и ТАLL-1 клетка являются предпочтительными для получения на коммерческой основе MIF ввиду того, что они обладают высокой MIF-продуктивностью.

Скорость пролиферации и MIF-продуктивность такой человеческой клетки может возрастать с введением генов, которые кодируют MIF образование в гораздо более легко выявляемой при выращивании клетки, например, методом слияния с использованием полиэтиленового гликоля или вируса Sendai, или известного метода генной рекомбинации с использованием ДNA лигазы, содержащего энзимы (нуклеазы) и ДNA полимеразы.

Соответственно выбирается метод пролиферации для такой человеческой клетки. Примеры такого метода включают как способ выращивания ткани вне организма, в котором выявленная человеческая гематопоэзная клетка инокулируется и пролиферируется в питательной среде культуры и способ выращивания в организме, в котором выявленная человеческая гематопоэзная клетка сперва имплантируется в тело теплокровного животного или инокулируется в диффузионной камере, предусмотренной внутри или снаружи тела нечеловеческого теплокровного животного, а затем оставляется расти, получая питательную телесную жидкость из тела животного.

Вначале поясняется способ вне организма, который может осуществляться на любой питательной среде, поскольку выявляемая человеческая гематопоэзная клетка пролиферируется в тех случаях, когда она в ней инокулируется, например, на RPMI 1640 среде и малоценной Eagle-среде, которые могут быть дополнены витаминами, минеральными веществами, карбогидратами, аминокислотами и при необходимости сывороткой от млекопитающих животных.

Для выращивания соответствующим образом подбираются монослойная культура и суспензионная культура.

Температура устанавливается в пределах 20-40^oС, предпочтительно около 35-38^oС, в то время как прививочный материал подбирается таким, чтобы достигнуть максимального роста клетки примерно в течение недели после инокуляции, желательно около 10⁴-10⁷ исходя из числа клеток/мл среды культуры.

Среда выращивания с таким прививочным материалом выдерживается в таких условиях примерно 4-10 дней при достаточной подаче питательных веществ и промывке или разжижении метаболитов, выделяющихся в среде выращивания, путем замены ее время от времени свежей средой.

Далее поясняется способ в организме, при котором выявленная человеческая гематопоэзная клетка выращивается быстро, в то время как используемая питательная телесная жидкость подается из тела нечеловеческого теплокровного животного сперва имплантацией человеческой клетки в тело животного и с другой стороны помещением человеческой клетки в диффузионную камеру, в которую вдобавок к этому поступает питательная телесная жидкость, с последующим кормлением животного обычным образом. Тем самым в отличие от способа выращивания ткани вне организма, способ в организме обеспечивает получение большого количества MIF даже в том случае, когда исключена дорогостоящая сыворотка и питательная среда выращивания или в значительной степени сокращаются.

Более точно, способ, использующий нечеловеческое теплокровное животное, облегчает содержание и контроль в период пролиферации клетки, а также осуществление пролиферации наиболее стойкой клетки и увеличение получения MIF на каждую клетку, в частности в 2-10 раз или еще больше, чем в случае выращивания вне организма.

Способ в организме может осуществляться на любом нечеловеческом теплокровном животном до тех пор, пока продолжается пролиферация выявленной человеческой гематопоэзной клетки, например, птицах, таких как цыпленок и голубь и млекопитающих животных, таких как собака, кошка, обезьяна, коза, поросенок, корова, лошадь, кролик, морская свинка, крыса, хомяк, мышь и голая мышь.

Так как имплантация такой человеческой клетки может вызвать опасность возникновения нежелательных иммунореакций, желательно использовать нечеловеческое теплокровное животное как можно в более раннем возрасте, таком как яйцо, эмбрион или утробный плод и новорожденных и молодняк животных для того, чтобы подавить такую иммунореакцию, когда возможно.

Такие животные могут быть предварительно обработаны, например, облучением Х-лучами или -лучами около 200-600 рем или инъекцией антисыворотки или иммуноугнетающего вещества, чтобы ослабить возможную иммунореакцию до имплантации.

В частности, поскольку голая мышь проявляет слабую иммунореакцию, ей во взрослом возрасте можно имплантировать любую выявленную человеческую гематопоэзную легко разрастающуюся клетку без такой предварительной обработки. Именно поэтому использование голой мыши очень благоприятно.

Мы можем получить стабилизированную пролиферацию выявленной человеческой гематопоэзной клетки и/или большее количество MIF, последовательно имплантируя человеческую клетку разным нечеловеческим теплокровным животным, например, сначала имплантируя и проращивая человеческую клетку у хомяка, затем трансплантируя голой мыши выращенные человеческие клетки.

В этом случае могут использоваться животные одного класса и типа, а также одного вида и рода. Выявленные человеческие гематопоэзные клетки могут быть имплантированы в любом месте животного до тех пор, пока они способны размножаться в этом месте, куда имплантированы, например, в аллатоис, внутривенно, внутрибрюшинно и подкожно.

В дополнение к непосредственной имплантации в тело животного любая из описанных выше человеческих клеток может размножаться путем внедрения в тело животного, например, внутри брюшины, известной диффузионной камеры с макропористым фильтром разной формы и размеров, таким как мембранный фильтр, ультрафильтр и полое волокно, размер пор примерно 10^-7-10^-5, который может блокировать проникновение животных клеток, но пропускать питательную телесную жидкость в человеческую клетку.

При необходимости такая диффузионная камера может быть подключена и размещена, например, на животном так, чтобы как питательный раствор в диффузионной камере, так и телесная жидкость могли циркулировать через диффузионную камеру. Таким образом, можно наблюдать размножающиеся человеческие гематопоэзные клетки через стенку камеры, и/или диффузионная камера сама по себе может заменяться свежей как для продолжения пролиферации в течение короткого периода жизни животного без его гибели, так и для еще большего увеличения получения клеток с каждого животного.

Поскольку из-за отсутствия непосредственного контакта человеческой клетки с животной клеткой такая диффузионная камера вызывает очень слабую нежелательную иммунореакцию, любое нечеловеческое теплокровное животное может легко использоваться без предварительной обработки для уменьшения такой иммунореакции и выращенные жизнеспособные человеческие клетки могут быть легко извлечены из диффузионной камеры.

Питание животного осуществляется обычным образом и даже после имплантации не требуется особой заботы.

Период, необходимый для получения предписанной пролиферации, обычно составляет около 1-10 недель.

Число человеческих клеток, полученных таким образом, составляет около 10⁷-10¹² или более от каждого животного.

В частности, число человеческих гематопоэзных клеток, выращенных способом, использующим нечеловеческое теплокровное животное, достигает примерно 10²-10⁷ или более, что составляет примерно в 10- -10⁶ раз или больше, чем получаемое инокуляцией и пролиферацией вне организма человеческой гематопоэзной клетки в питательной среде выращивания. Это очень благоприятно для получения MIF.

Способ для получения MIF с человеческой гематопоэзной клеткой, полученной таким образом, не должен быть ограничен каким-либо одним специальным способом. Человеческая клетка подвергается воздействию MIF индуктора у животного, в котором были выращены человеческие клетки. Например, человеческая гематопоэзная клетка, выращенная в асците в суспензии или опухолевая клетка, образованная, например, подкожно, подвергается воздействию в организме непосредственно индуктора MIF и полученный MIF выделяется из асцита, сыворотки и/или опухоли и затем очищается.

С другой стороны, выращенная человеческая клетка выделяется из животного и затем подвергается вне организма воздействию MIF индуктора. Например, человеческая клетка, которая выделяется из асцитной суспензии или получается экстракцией и разделением массы (масс) опухоли, образованной, например, подкожно, суспендируется в питательной среде культуры, выдерживается при температуре около 20-40^oС до получения плотности клетки около 10⁵-10⁸ клеток/мл и подвергается воздействию MIF индуктора для индукции производства MIFф. После этого полученный MIF извлекается и очищается.

Когда человеческая гематопоэзная клетка выращивается в диффузионной камере, выращенная человеческая клетка подвергается воздействию MIF индуктора в диффузионной камере для индуцирования MIF производства и, с другой стороны, извлекается из диффузионной камеры до индуцирования.

Производство MIF на каждое животное может быть еще увеличено благодаря применению способа, в котором выращенная человеческая клетка подвергается воздействию MIF индуктора в теле животного, выделяется из определенного места (мест) животного или его всего тела и подвергается воздействию MIF индуктора вне организма для индуцирования производства MIF, другая процедура, в которой человеческая клетка неоднократно подвергается воздействию MIF индуктора, и/или еще одна процедура, в которой диффузионная камера, которая внедряется или подключается к телу животного, время от времени заменяется свежей камерой.

В качестве MIF-индукторов подходят, например, митогены, так же как фитогемагглютинин, конканавалин А, pokeweed митоген, липополисахарид, липид А, эндотоксин, полисахарид, бактерия, вирус, нуклеиновая кислота и полинуклеотид.

Такой MIF индуктор обычно используется с концентрацией примерно от 0,001 mг/мл до 10 мг/мл. Два или больше MIF индуктора могут свободно использоваться в комбинации для того, чтобы увеличить MIF и индуцировать одновременное производство другого лимфокина (лимфокинов).

Полученный таким образом MIF может быть легко выделен очисткой и сепарацией, используя соответствующую процедуру, например, высаливание, диализ, фильтрацию, центрифугирование, сгущение и лиофилизацию. Когда требуется более высокая очистка, применяется, например, адсорбция и десорбция с ионообменом, гелевая фильтрация, хроматография сродства, разделение изоэлектрической точки, эффективная хроматография жидкости, хроматография на колонке и электрофорез, в сочетании. В частности, можно выделять MIF в его, по возможности, самой чистой форме методом хроматографии, используя моноклональное антитело.

Полученный таким образом MIF предпочтительно применяется для профилактики и лечения восприимчивых к MIF болезней.

Формулировка "Восприимчивые к MIF болезни" означает болезни, которые могут быть предупреждены и/или излечимы с помощью MIF в частности, вирусные заболевания, например, эпидемический конъюктивит, герпетические кератиты, грипп, краснуха, сывороточные гепатиты и синдром приобретенного иммунного дефицита (СПИД) и невирусные заболевания, например, злокачественные опухоли, включая рак толстой кишки, рак легкого, рак печени и остеосаркому и иммунопатологии, такие как нетипичная аллергия, миастениягравис, коллагенновое заболевание, злокачественная анемия, суставной ревматизм и соматический лупус эритематодус.

Тип и форма такой профилактики и лечения свободно выбираются в соответствии с конечной целью, например, жидкие агенты, такие как nebula, collyrium collutory и инъекция, пастообразные агенты, такие как мазь и припарки и твердые агенты такие, как порошки, гранулы, капсулы и таблетки.

Такие профилактические средства и лекарства обычно применяются в количестве приблизительно 1-10.000.000 ед/г MIF. При необходимости их можно принимать с одним или более лимфокинами, и/или натуральным или синтетическими химиотерапевтическими средствами, например, интеферон-a, интерферон-b, интерферон-g, фактор омертвления опухоли, лимфотоксин, интерлейкин 1, интерлейкин 2 и фактор, дифференцирующий В-клетки для того, чтобы повысить их терапевтическую и профилактическую активность.

Конечно, в сочетании можно принимать один или более вспомогательных агентов, усилителей и стабилизаторов.

Полученные таким образом профилактические средства и лекарства предпочтительно применяются, например, в антивирусных агентах, противоопухолевых агентах, усилителях для противоопухолевой терапии, профилактических средствах для предупреждения повторных злокачественных опухолей, иммунорегуляторах и средствах для иммунопатологий, а также в средствах для подавления метастаза раков.

Активность MIF определялась в соответствии с методом, изложенным Y. Naomoto et al. Journal of Cancer Research Clinical Oncology, vol. 113, pp. 544-549 (1987 г.) с небольшим изменением, в котором метастаз легкого индуцируется RPMI 4788 клеткой (FERM BP 2429), на выявленной человеческой клетке рака толстой кишки у голой мыши, которой затем была введена жидкая проба, содержащая MIF для определения его подавляющей метастаз активности.

В частности, BALB/c голой мыши инокулируются через хвостовую вену с 2х10⁶ жизнеспособными RPMI 4788 клетками в 0,2 мл физиологического раствора. Со следующего дня голым мышам через хвостовую вену вводят 0,1 мл какой-либо содержащей MIF жидкой пробы ежедневно в течение 10 дней. На 21-й день голые мыши умерщвляются и узелки на поверхности их легкого окрашиваются и производится подсчет метастазов RPMI 4788 клетки. Для контроля применяется физиологический раствор, и для каждой жидкой пробы используются 8 голых мышей. Одна тысяча единиц MIF определяется как количество MIF, которое делит пополам число узелков, при условии, что при этом контрольными являются 100 или более узелков. Интерферон-a, интерферон-b, интерферон-g, фактор-a омертвления опухолей, фактор-b омертвления опухоли, интерлейкин-1 и интерлейкин-2 удаляются из жидкой пробы до ее использования, если в ней содержится один из них.

Анализы гемагглутинационных титров проводятся в соответствии с методом, описанным у S.E. Salk, The Journal of Immunology, vol. 49, рр. 87-98 (1944 г.) с небольшим изменением.

Более подробно настоящее изобретение поясняется на следующих экспериментах.

Эксперимент. Сравнение выявленных человеческих гематопоэзных клеток по их MIF продуктивности.

Эксперимент 1. Образование MIF клеткой, выращенной вне организма.

Множество выявленных человеческих клеток было инокулировано в RPMI 1640 среде (рН 7,2) с добавкой 20 об/об сыворотки утробного плода теленка, выращенных при 37^oС обычным образом, промыто в свободной от сыворотки среде RPMI 1640 (рН 7,2) и суспендировано в свежеприготовленной той же среде культуры для обеспечения плотности клеток приблизительно 510⁶/мл.

В полученную клеточную суспензию добавляли 10 mгг/мм ВСG, выращенной при 37^oC в течение 1 дня, затем добавили 1 гг/мл липополисахарида, выращенного при 37^oС в течение дополнительного 1 дня для индуцирования образования MIF и центрифугирования. Поверхностный слой был сгущен в 50 раз мембраной, имеющей нижний предел молекулярного веса 6000 и затем было проведено определение MIF активности на 1 мл.

Результаты показаны в табл.1.

Как видно из результатов в табл. 1, выявленные человеческие гематопоэзные клетки обладают MIF продуктивностью. В частности, мы установили, что Т-клетки обладают более высокой MIF продуктивностью. HРВ-MLT клетка (FERM BP-24300), которая обладает наибольшей MIF продуктивностью, в изобретении имела предпочтительное использование.

Эксперимент 2. Производство MIF клетками, выращенными в организме.

Новорожденным хомякам ввели антисыворотку, полученную от кролика известным методом для того, чтобы ослабить их иммунореакцию, подкожно имплантировали множество выявленных человеческих гематопоэзных клеток и кормили 3 недели обычным образом. Массы опухолей, образованных подкожно у хомяков, были извлечены, измельчены, разделены на части их суспендированием в физиологическом растворе, содержащем трипсин и извлечены.

После этого каждая клетка была получена в суспензии наподобие эксперимента 1 и затем определялась ее MIF активность. Результаты показаны в табл.2.

Эксперимент 3. Частичная очистка MIF.

НРВ-MLT клетки, выращенные методом, описанным в эксперименте 2, были составлены для производства MIF и центрифугированы по методу эксперимента 1 с небольшим изменением. Поверхностный слой был сгущен в 50 раз мембраной, нижний предел молекулярного веса 6.000, и хроматофокусированы на "РВЕ-94", гелеобразный продукт Pharmacia LKB Biotechnology, Upsala, Швеция. Фракции, содержащие большое количество MIF (рН 5-7) были извлечены и подвергнуты хроматографии геля на фильтре, используя "Sephacryl S-200", гелеобразный продукт Pharmacia LKB Biotechnology, Upsala, Швеция и вновь образованные, содержащие большое количество MIF фракции были извлечены и сгущены для получения частично очищенной жидкости пробы, содержащей около 2.800.00 ед/мл MIF с достигнутым выходом активности около 60%

Продукт подавляет, в дополнение к метастазам легкого RPMI 4788 клетки, человеческую клетку рака толстой кишки, метастазы печени Lovo-клетки (АТСС ССL 229), человеческую клетку рака толстой кишки. Продукт предпочтительно применяется для лечения пациентов, больных раком, в чистом виде или в сочетании с другим лимфокином, химиотерапией, хирургической операцией и/или облучением.

Ниже описаны несколько примеров выполнения изобретения.

Пример 1. RAMOS клетка (АТСС СRL 1596) была инокулирована в RPMI 1640 cреде (рН 7,2) в дополнении с 10 об/об сыворотки утробного плода теленка для получения плотности клетки 5х10⁵ клеток/мл.

После этого клетка была выращена при 37^oС при освежении время от времени среды культуры, промывкой свежеприготовленной той же самой средой культуры и суспендированием с той же средой культуры для получения плотности клеток 2х10⁶ клеток/мл. В суспензию добавили ВСG и липополисахарид в количестве около 10 гг/мл и выращивали при 37^oС в течение двух дней для индуцирования производства MIF.

Центрифугирование полученной культуры дало верхний слой, который содержал около 60 единиц/мл MIF.

Пример 2. Новорожденным хомякам ввели антисыворотку, полученную от кролика известным методом для ослабления их иммунореакции, подкожно имплантировали HPB-МLT клетку (FERM BP-2430) и кормили в течение 5 недель обычным образом. Массы опухоли, образованные подкожно у хомяков, около 20 г каждая были извлечены, разделены на части их суспендированием в физиологическом растворе, содержащем коллагеназу и извлечены.

Полученная клетка была промыта малоценной Еаgle- средой, разведена в той же свежеприготовленной среде при 37^oС для получения плотности клеток около 2х10⁶ клеток/мл с добавлением 200 гг/мл фитогемагглутинина и 5 гг/мл липида А и выращивалась при 37^oС в течение двух дней для индуцирования производства MIF. Центрифугирование полученной культуры дало поверхностный слой, который содержал около 9,400 ед/мл MIF. Таким образом, от каждого хомяка было получено около 16.500.000 ед. MIF.

Пример 3. Новорожденным крысам внутривенно имплантировали MOLT-3 клетку (АТСС СRL 1552) и кормили в течение 4 недель обычным образом.

Массы тумора, образованные подкожно у крыс, около 20 г каждая, были извлечены и разделены на части подобно примеру 2 для получения клеточной суспензии, в которую затем добавили около 100 гемагглутинационных титров/мл вируса Sendai и около 5 гг/мл липополисахарида и выращивали при 37^oС в течение двух дней для индуцирования производства MIF.

Полученная культура была центрифугирована, ультрацентрифугирована и отфильтрована на мембране для удаления вируса, до получения около 4.200 ед. MIF на мл фильтрата. Таким образом, от каждой мыши было получено около 6.900.000 ед. MIF.

Пример 4. ТаLL-1 клетку (JCRB 0086) суспендирования в физиологическом растворе в примерно 10 мл пластмассовых цилиндрических диффузионных камерах, имеющих мембранный фильтр, размер пор около 0,5 , которые затем интраперитонально были внедрены взрослым крысам.

Затем крыс кормили обычным образом в течение 4 недель, после чего диффузионные камеры были извлечены.

Из диффузионных камер были извлечены клетки, которые обрабатывали наподобие примера 1 для индуцирования производства MIF. Центрифугирование полученной культуры дало верхний слой, который содержал около 1.600 ед/мл MIF. Таким образом, от каждой мыши было получено около 1.800.000 ед. MIF.

Пример 5. U-937 клетку (АТСС СRL 1593) имплантировали в яйца-эмбрионы, которые выдерживали при 37^oС в течение 5 дней и выращивали при 37^oС в течение недели. Затем яйца разбили и извлекли выращенные клетки. После этого клетки были обработаны наподобие примера 2 для индуцирования производства MIF. Центрифугирование полученной культуры дало поверхностный слой, который содержал около 120 ед/мл MIF. Таким образом, из каждых 10 яиц-эмбрионов было получено около 9.000 ед. MIF.

Как описано выше, изобретение направлено на разработку способа получения MIF, используя человеческие гематопоэзные клетки.

С другой стороны, подавляя метастаз рака для облегчения страданий пациентов и продления срока их жизни, MIF применяются для предупреждения и лечения восприимчивых к MIF болезней, например, вирусных болезней, злокачественных опухолей и иммунопатологий. Тем самым MIF очень важен для фармацевтической промышленности.