штамм гриба aspergillus oryzal - продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз, амилолитических и цитолитических ферментов

Формула изобретения

Штамм гриба Aspergillus oryzae ВКПМ F-683 продуцент комплекса кислых и слабокислых протеаз, амило- и цитолитических ферментов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к получению штамма - продуцента комплекса гидролитических ферментов, в состав которого входят кислые и слабокислые протеазы, - амилаза, а также сопутствующие ферменты, такие как экзо -- глюканаза, цитаза, ксиланаза, и может быть применено в микробиологической промышленности при получении ферментных препаратов для гидролиза растительных, животных и микробных субстратов в пищевой промышленности, бродильных производствах, сельском хозяйстве, при получении аминокислотных смесей, ферментолизатов дрожжей и других биологически активных веществ.

Известны штаммы продуценты протеаз и - амилаз из рода Aspergillus oryzae: 3-9-15, 251-90 (1,2), при глубинном культивировании которых синтезируются протеаза и - амилаза. Недостатком этих продуцентов является их низкая продуктивность и отсутствие сопутствующих гидролитических ферментов, а также длительный период роста продуцентов, уровень активности по протеазе составляет 1,5 6,0 ед ПС/мл, по - амилазе 2,0 10,0 ед АС/мл.

Из известных продуцентов, синтезирующих протеазу и - амилазу, наиболее близким по техническому решению является штамм Aspergillus oryzae 824-32 (ВКПМ F-369). Однако, основным недостатком этого штамма является отсутствие синтеза сопутствующих гидролаз, а также длительный период роста и развития микромицета; штамм интенсивно продуцирует - -амилазу и протеазу на жидких средах лишь на 4 5 сутки.

Задачей, поставленной настоящим изобретением, является получение штамма гриба Aspergillus oryzae, обладающего высокой способностью к образованию комплекса протеаз, проявляющих максимальную активность в кислой и слабокислой зоне рН, - амилазы, а также сопутствующих ферментов: экзо -- глюканазы, ксиланазы, цитазы.

Штамм Aspergillus oryzae 387 (ВКПМ F-683) получен селекционным путем от уже известного штамма Aspergillus oryzae 251-90 (депонирован во ВНИИ биотехника, N 123) по признаку повышенного биосинтеза целевого продукта комплекса кислых и слабокислых протеолитических ферментов, - амилазы и сопутствующих ксиланазы, экзо -- глюканазы и цитазы. При культивировании на питательной среде, содержащей, ячменная мука 3,0; отруби 3,0; KH₂PO₄ 1,5; водопроводная вода, рН естественный, в аэробных условиях при 28 30^oC в течение 42 48 ч, гриб образует высокоактивный комплекс кислых и слабокислых протеаз с общей протеолитической активностью 11,5 ед ПС/мл, а также сопутствующие ферменты: - амилазу (12 ед/мл), ксиланазу (62 ед/мл), экзо глюканазу (0,3 ед/мл), цитазу (6,0 ед/мл).

Таким образом, предлагаемый штамм по скорости роста и биосинтезу комплекса протеаз и a- амилазы более чем в 2 раза превосходит известный Aspergillus oryzae 824-32 c одновременным синтезом других гидролитических ферментов, а именно: ксиланазы, экзо -- глюканазы и цитазы, что является основным отличительным признаком от известного. Кроме того, предлагаемый штамм имеет на 2-ые сутки роста более высокую продуктивность по протеазам и - амилазе, а также высокую рН-стабильность протеаз при кислых значениях рН, чем известный штамм.

Вместе с тем, предлагаемый штамм отличается от известного и по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим характеристикам.

Культурально-морфологическая характеристика штамма.

Культуральные признаки. На агаризованной среде Чапека через 3 суток роста при 30^oC образуются колонии диаметром 6 7 мм. Форма колоний округлая, профиль немного выпуклый, край ровный, поверхность бархатистая, легкая радиальная складчатость. Цвет в центре оливково-желтый, к периферии - грязно-зеленый, с возрастом темнеет. Цвет с обратной стороны темно-песочный.

При росте на агаризованном сусле (7 8% сухих веществ, 30^oC, 3-ое суток) диаметр колоний 8,5 10 мм; форма колоний и цвет такие же, как при росте на среде Чапека.

При культивировании на картофельном агаре (30^oC, 3-oе суток) диаметр колоний 24 30 мм, форма колоний округлая, профиль выпуклый, край ровный, вдоль края зона гидролизованного крахмала шириной 3 мм, сильная радиальная и сегментная складчатость; цвет поверхности в центре грязно-зеленый, на периферии темно-оливковый, с возрастом темнеет.

На морковном агаре (30^oC, 3-oe суток) образуются колонии диаметром 7,5 8,0 мм, сильная складчатость, цвет темно-песочный.

На всех средах наблюдается обильное спорообразование, пигменты в среду не выделяются, эксудата нет, слабый запах плесени.

Морфология штамма. Мицелий сильно разветвленный, со вздутиями, септированный, диаметр гиф 10 12 мк. Конидии формируются экзогенно; поверхность конидий гладкая, форма округлая цилиндрическая или неправильная; диаметр 4,4 6,4 мк; расположение на конидиеносце цепочкой; цвет от оливково-желтого до темно-оливкового. Конидиеносцы без перегородок.

Физиолого-биохимическая характеристика. Тип катаболизма дыхание. Симбиотрофных отношений не обнаружено. Отношение к кислороду аэроб. Оптимальная температура роста 28 30^oC, максимальная 52^oC, минимальная 18^oC. Оптимальное значение рН для роста гриба и биосинтеза ферментов 5,7; рост продуцента отмечается в зоне рН от 2,5 до 10,0. Продуцент растет на средах с содержанием сухих веществ от 0,5 до 18%

В качестве источника углерода гриб используется крахмал, глюкозу, сахарозу, ксилозу, мальтозу, маннит, глицерин, галактозу. Продуцент ассимилирует нитраты, аммонийный и аминный азот, белки. Штамм не патогенный.

Продуцент на вторые сутки синтезирует высокоактивный протеолитический комплекс, имеющий оптимум действия при рН 4,5 5,5, в состав которого входят: карбоксильная, металлозависимая и сериновая протеиназы, лейцинаминопептидаза, карбоксипептидаза; а также - амилазу, экзо -- глюканазу, ксиланазу и цитазу в различных соотношениях в зависимости от условий культивирования.

Таким образом, по культурально-морфологическим признакам предлагаемый штамм отличается от известного формой конидий, которые являются более вытянутыми, цилиндрическими или неправильными, цветом, конидиеносцы без перегородок; длительностью роста, размерами и цветом колоний, образующихся на агаризованных средах; более высокой скоростью роста и биосинтеза ферментов на жидких средах; а также составом синтезируемых ферментов.

В результате этих особенностей предлагаемый штамм позволяет получать широкий комплекс гидролитических ферментов, в состав которого входят кислые и слабокислые протеазы, - амилаза, экзо -- глюканаза, ксиланаза, цитаза, что является существенным отличием от известного. Состав ферментативного комплекса и соотношение в нем ферментов регулируется изменениями условий культивирования продуцента. Наличие такого богатого комплекса гидролитических ферментов расширяет области применения ферментных препаратов, получаемых на основе предлагаемого штамма. Так, наличие протеолитических, амилолитических и целлюлолитических ферментов позволяет использовать его при гидролизе растительного сырья, содержащего белок, крахмал и другие некрахмалистые полисахариды, применяемого в бродильных производствах. Наличие протеолитических, амилолитических и цитолитических ферментов позволяет использовать его при гидролизе клеточных стенок, полисахаридов и белковых веществ хлебопекарных, пивных, кормовых дрожжей и БВК, с целью получения ферментолизатов и аминокислотных смесей пищевого, кормового и медицинского назначения. Наличие протеолитического комплекса, проявляющего активность в кислой и слабокислой зонах рН, позволяет использовать его для гидролиза животного и молочного белка в мясо-молочной и сыроваренной промышленностях.

Пример 1. Штамм Aspergillus oryzae 387 культивируют на питательной среде, состоящей из ячменной муки 3% отрубей 3% KH₂PO₄ 1,5% водопроводной воды, рН естественный. Выращивание осуществляют в колбах Эрленмейера объемом 750 мл на круговой качалке (220 240 об/мин) при температуре 28 30^oC в течение 42 часов.

Активность внеклеточных ферментов составляет: протеолитическая 11,5 ед/мл, амилолитическая 12,0 ед/мл, ксиланазная 62,0 ед/мл, экзо -- глюканазная 0,3 ед/мл, цитолитическая 6,0 ед/мл.

Пример 2. Штамм Asp. oryzae 387 культивируют на питательной среде, включающей ячменную муку 4% пшеничные отруби 1,5% БВК 0,5% KH₂PO₄ 1,5% водопроводную воду, рН естественный, в аналогичных условиях. Через 42 часа протеолитическая активность составляет - 13,5 ед/мл, амилолитическая 19,2 ед/мл, ксиланазная 64,8 ед/мл, экзо -- глюканазная 0,45 ед/мл, цитолитическая 7,1 ед/мл.

Пример 3. Штамм Asp. oryzae 387 культивируют на питательной среде, содержащей пшеничную муку 2% кукурузную муку 2% пшеничные отруби 1,0% БВК 0,5% KH₂PO₄ 1,5% проксанол 0,02% водопроводную воду, рН естественный, в аналогичных примеру 1 условиях. На 42 часа роста протеолитическая активность составила 16,9 ед/мл, амилолитическая 13,0 ед/мл, ксиланазная 50,3 ед/мл, экзо -- глюканазная 0,25 ед/мл, цитолитическая 5,1 ед/мл.

В табл. 1 приведены сравнительные данные, характеризующие физиологическую активность грибов Aspergillus oryzae шт. 387 и шт. 824-32 продуцентов протеолитических и амилолитических ферментов, культивируемых в одинаковых условиях биосинтеза на среде, содержащей 7,5% сухих веществ, являющейся наиболее технологичной и применяемой в производстве.

Как видно из табл. 1, протеолитические ферменты, синтезируемые предлагаемым штаммом, проявляют высокий уровень активности в более широком диапазоне рН (4,5 5,5). В сравниваемом аналоге уровень протеолитической активности при снижении рН до 4,5 падает на 39% и более чем в 2 раза ниже уровня активности в предлагаемой культуре.

Амилолитическая активность практически на одном уровне, в то время как скорость роста у предлагаемого штамма в 2 раза выше, чем у известного. Кроме того, штамм Aspergillus oryzae 824-32 не продуцирует другие гидролитические ферменты, синтезируемые штаммом 387.

В табл. 2 приведены сравнительные данные по продуктивности грибов Aspergillus oryzae штамм 387 и 824-32, культивируемых в одинаковых условиях в течение 2 и 5 суток на концентрированных питательных средах (18% сухих веществ).

Из табл. 2 видно, что использование предлагаемого штамма позволяет уже на вторые сутки в 2 3 раза повысить выход протеолитических ферментов и в 2,7 раза амилолитических ферментов. При увеличении длительности культивирования в 2,9 раза протеолитическая активность известного штамма возрастает, однако ее величина при рН 4,5 только к 5 суткам достигает того же значения активности, которое имеет место на 42 часа роста в случае использования предлагаемого штамма. Причем рН-стабильность протеаз это очень важный фактор в пищевой промышленности, особенно в бродильных производствах, где процесс спиртового брожения проходит при рН не выше 4,5. И хотя у известного штамма уровень протеолитической активности при рН 5,5 на концентрированной среде на 5 сутки роста превосходит в 1,3 раза величину активности при этом же рН у предлагаемого штамма, однако скорость роста и биосинтеза у известного штамма значительно ниже. Кроме того, потребность известного штамма в концентрированных средах является также достаточно негативным показателем, ввиду низкой технологичности этих сред.

В табл. 3 приведены данные по составу ферментативного комплекса, синтезируемого грибом Aspergillus oryzae 387 на различных средах.

Пример 4. Штамм Aspergillus oryzae 387 выращивали на Вышневолоцком заводе ферментных препаратов в промышленном ферментаторе объемом 20 м³. Состав питательной среды: кукурузная мука 2% пшеничная мука 2% отруби пшеничные 1,5% БВК 0,5% KH₂PO₄ 1,5% вода водопроводная, рН естественный. Режим культивирования: температура 30 1^oC, аэрация 150 500 м³/час, продолжительность 48 ч. Протеолитическая активность составила 10,5 ед/мл, амилолитическая 11,3 ед/мл.

Пример 5. Глубинную культуру Aspergillus oryzae 387 амилопротооризин Гх, выращенную на ВЗФП (по примеру 4), применяют для ферментолиза пекарских дрожжей. Амилопротооризин Гх дозируют на протеолитической активности из расчета 15 ед ПС/г сухих дрожжей. Режим протеолиза: 50^oC, длительность 3,0 3,5 ч. По окончании процесса прирост аминного азота составил 240 мг% Высушенный на распылительной сушилке ферментолизат дрожжей применяют в животноводстве в качестве белково-кормовой добавки или как пищевую добавку с высоким содержанием аминокислот для нуждающихся в усиленном белковом питании и спортсменам.

Пример 6. Глубинную культуру Aspergillus oryzae 387 амилопротооризин Гх, выращенную на ВЗФП (по примеру 4), применяют для ферментативного гидролиза пекарских дрожжей с целью получения очищенной аминокислотной смеси для медицины и пищевой промышленности.

Пример 7. Ферментный препарат амилопротооризин Г10х, полученный при глубинном культивировании Aspergillus oryzae 387, применяют в пивоварении на стадии проращивания ячменного солода, добавляя его в замочную воду. При этом улучшается качество солода; увеличивается белковое растворение на 5% повышается степень растворения эндоспермы зерна на 2,1% снижается длительность осахаривания пивного сусла в 2 раза.

Пример 8. Ферментные препараты амилопроторизин Г10х и Г20х, полученные из глубинной культуры A. oryzae 387, применяют в пивоваренном производстве на стадии приготовления пивного сусла и стабилизация готового продукта. При этом сокращается расход высококачественного солодового зерна на 30 40% увеличивается выход экстракта на 4 5% улучшается качество пива, и его стойкость возрастает с 7 до 1,5 месяцев.

Пример 9. Амилопроторизин Гх, полученный при глубинном культивировании A. oryzae 387, применяют в спиртовом производстве на стадии приготовления солодового молока. При этом активность амилаз солода возрастает на 50 80% сокращается длительность проращивания солода на 2 суток и на 30 40% сокращается расход высококачественного зерна.

Пример 10. Амилопроторизин Гх, полученный из глубинной культуры A. oryzae 387, применяют в спиртовом производстве на стадии приготовления сусла для выращивания дрожжей. При этом количество дрожжевых клеток в 2 раза превышало контрольный уровень, а их бродильная активность возрастала на 25%

Пример 11. Амилопротооризин Гх, полученный при глубинном культивировании A. oryzae 387, применяют в спиртовом производстве на стадии осахаривания сусла. При этом срок брожения сокращается на 1 сутки, экономится 0,2 т зерна, увеличивается выход спирта на 1 2% и улучшается его качество за счет снижения количества побочных продуктов.

Пример 12. Амилопротооризин Г10х, полученный при глубинном культивировании A. oryzae 387, применяют в молочной промышленности для приготовления диетического и детского питания и сыроделии при получении молочно-белковой основы для сыров.

Пример 13. Амилопротооризин Г10х, полученный из глубинной культуры Aspergillus oryzae 387, применяют в мясной промышленности для мягчения мяса и повышения его сортности.