штамм вируса лангат для получения живой вакцины против клещевого энцефалита

Формула изобретения

Штамм вируса лангат ВКВ N 909 для получения живой вакцины против клещевого энцефалита.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, к вакцинопрофилактике клещевого энцефалита, в частности, к поиску вакцинных штаммов.

В научной литературе имеются данные о свойствах нескольких штаммов вирусов комплекса клещевого энцефалита, подготовленных с целью получения живой вакцины против этой инфекции, хотя препарат так и не был создан.

Ослабленные варианты, селекционированные в культурах клеток из патогенного штамма вируса КЭ Hypr (НК 18 "3" и НК 28 "2"), отличались высокой степенью аттенуации, но не были стабильными. Пассирование в куриных эмбрионах поднимало их нейровирулентность до уровня исходного штамма [1-4]

Ослабленные варианты, полученные из патогенного штамма вируса клещевого энцефалита 17к61 (ВЭ-4 и В-67), апатогенные для обезьян при интрацеребральном заражении, так же не были стабильными, а вариант "Томский", испытанный на 10 добровольцах, обладал высокой остаточной нейровирулентностью для приматов [5-8]

Первая живая вакцина была создана в СССР на основе выделенного в природном очаге клещевого энцефалита естественно ослабленного штамма Еланцев, который по антигенным и другим биологическим свойствам был схож с малайским вирусом Лангат ТР-21. Опыт ее применения выявил недостаточность аттенуации этого штамма. Всего было привито 649470 человек. 35 привитых заболели поствакцинальным энцефалитом. Дальнейшее применение этой вакцины оказалось невозможным [9]

А. В. Дубов и соавт. получили дополнительно ослабленные пассированием через лимфоузлы белых мышей варианты штамма Еланцев-Е-30, Е-37 и Е-50. Эти варианты иммуногенны и обладают меньшей нейровирулентностью для приматов [9-11] однако их стабильность сомнительна [12]

Иной путь получения штаммов для живой вакцины состоял в селекции ослабленных вариантов малайского вируса Лангат ТР-21, отличающегося от других вирусов комплекса клещевого энцефалита сниженной нейровирулентностью для лабораторных грызунов и приматов, но обеспечивающего их резистентность к заражению патогенными штаммами [13, 14]

Штамм Egg 42Е5-селекционирован пассированием вируса Лангат ТР-21 в куриных эмбрионах [15] Он оказался стабильным при пассировании в куриных эмбрионах, через мозг мышей и в культурах клеток [16] иммуногенным для мышей и обезьян и стимулировал образование антител у человека [17-21] По уровню остаточной нейровирулентности для приматов штамм E_gg 42Е5 занял промежуточное положение между вакцинными вирусами полиомиелита 3-го типа и желтой лихорадки 17Д [22] При испытании безопасности этого штамма на 9 добровольцах, а также штамма Е5 "14" [23, 24] полученного В.Майером из штамма E_gg 42 "Е5" трехкратной очисткой методом бляшек, на 60 добровольцах осложнений у привитых не было [21, 25, 26] Несмотря на эти обнадеживающие результаты, дальнейшая работа со штаммом E_gg 42Е5 не проводилась. В том числе не были поставлены опыты длительного наблюдения за обезьянами подвергнутыми интрацеребральному заражению. Это не позволяет адекватно оценить безопасность штамма E_gg 42Е5 и рассматривать его как кандидата для живой вакцины.

Клоны вируса Лангат ТР-21 N 194 и N 237, выделенные Е.К.Левкович и соавт. методом бляшек в культуре клеток куриных фибробластов [27] описаны в научной литературе недостаточно, чтобы оценить их нейровирулентность в сравнении со штаммом E_gg 42Е5 в тесте интрацеребрального заражения [28-34] На людях они не испытывались. Можно также заметить, что культура клеток куриных фибробластов является селективной для патогенных клонов вируса Лангат ТР-21 [35-38] и поэтому, вероятно, не является оптимальной для отбора наиболее аттенуированных вариантов.

Прототипом предлагаемого ослабленного варианта вируса Лангат ТР-21 Л1/89 является апатогенный клон N 5, выделенный В.И.Ильенко и соавт. методом предельных разведений на интрацеребрально зараженных мышах. Клон N 5 был испытан на 2356 добровольцах, за которыми наблюдали в течение 3-х лет. Клинически выраженных патологических реакций не было. Уровень сероконверсий при оптимальной схеме иммунизации составлял 84% [39, 40] Однако, по данным А.И.Иваненко, клон N 5 не был стабильным: его нейровирулентность повышалась при пассировании в культуре клеток СПЭВ [41] Таким образом, клон N 5, несмотря на хорошие результаты испытания на добровольцах, так же не может рассматриваться как кандидат для живой вакцины против клещевого энцефалита.

Цель настоящего изобретения получить стабильный аттенуированный вариант вируса Лангат ТР-21 для живой вакцины против клещевого энцефалита. Поставленная цель достигается штаммом Л1/89.

Штамм Л1/89 вируса Лангат ТР-21 депонирован под N 909 в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского 25 июня 1990 года. Штамм Л1/89 получен пассированием музейного штамма Лангат ТР-21 на белых мышах при внутримозговом заражении.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА Л1/89

ПАТОГЕННОСТЬ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ.

Для нелинейных белых мышей весом 7-8 г инфекционный титр при внутримозговом заражении составляет 8-9 lg ЛД₅₀/мл, индекс инвазивности (разница между инфекционным титром при внутримозговом и подкожном заражении) - 3,0-5,3 lg ЛД₅₀.

Для белых мышей линии BAIB/c с весом 14-16 г инфекционный титр при внутримозговом заражении составляет 7-lg ЛД₅₀/мл. Индекс инвазивности - 6,4-7,1 lg ЛД₅₀.

Для обезьян M, mulatta, M.fascicularis, M.nemestrina и Papio hamadryas весом 1,5 5,6 кг штамм Л1/89 в дозах 6-8 lg ЛД₅₀ апатогенен при интрацеребральном заражении не вызывает клинически выраженного энцефалита. Патоморфологические изменения в индикаторных центрах ЦНС по усредненным данным не превышают 1 степени по шкале N.Nathanson [42]

РАЗМНОЖЕНИЕ В КУЛЬТУРАХ КЛЕТОК.

В культурах клеток СПЭВ (перевиваемая линия клеток почки эмбриона свиньи), КФ (первично-трипсинизированная культура клеток фибробластов куриного эмбриона), М 22 (культура диплоидных клеток кожно-мышечной ткани эмбриона человека), 385/10 (культура диплоидных клеток легочной ткани эмбриона человека) штамм Л1/89 репродуцируется. Инфекционный титр культуральной жидкости достигает 5-7 lg ЛД₅₀/мл на 3-и сутки культивирования при 37^oC.

При температуре 41,5-42^oC штамм Л1/89 в культурах клеток СПЭВ и КФ не репродуцируется (с культурами клеток М-22 и 385/10 опыты не ставили).

Таким образом, штамм Л1/89 не относится к категории температурочувствительных мутантов, но не способен размножаться при повышенной температуре.

В культурах клеток под агаровым покрытием вирус Л1/89 образует мелкие бляшки, до 2-х мм в диаметре, бесцветные в клетках СПЭВ, розовые, трудноотличимые от фона в клетках КФ.

РАЗМНОЖЕНИЕ В КУРИНЫХ ЭМБРИОНАХ.

При заражении 11-дневных куриных эмбрионов на хорионалантонскую оболочку титр вируса Л1/89 на 3-и сутки составляет 5,7 6,3 lg ЛД₅₀/ мл

ТЕРМОИНАКТИВАЦИЯ.

Штамм Л1/89 термолабилен. Индекс термоинактивации (снижение инфекционного титра при прогревании вируссодержащей жидкости при 50^oC в течение 20 минут) колеблется от 4,0 до 5,6 lg ЛД₅₀.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К МОЧЕВИНЕ.

Штамм Л1/89 чувствителен к инактивирущему действию мочевины (контакт с 2М мочевиной в течение 20 минут при 35^oC). Инфекционный тир вируссодержащей жидкости падает под действием мочевины на 5,0-6,1 lg ЛД₅₀

СПЕЦИФИЧНОСТЬ.

Методом РПГА с использованием эритроцитов, сенсибилизированных малыми концентрациями видоспецифического иммуноглобулина к вирусу Лангат ТР-21, ацетоновый антиген штамма Л1/89 идентифицирован как антиген вируса Лангат ТР-21: эритроцитарные диагностикумы к вирусу Лангат имели одинаковую активность как с исходным вирусом Лангат ТР-21, так и с полученным из него клоном Л1/89. В то же время, эритроцитарный диагностикум к вирусу клещевого энцефалита не взаимодействовал с ацетоновым антигеном клона Л1/89.

АНТИГЕННАЯ АКТИВНОСТЬ.

У мышей линии ВAIB/c, весом 14 16 г через 14 дней после однократной подкожной иммунизации штаммом Л1/89, вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови содержатся в концентрации 3,6 lg ИН, у мышей линии СВА-2,2 lg ИН.

У кроликов породы шиншилла, весом 2,5 3,0 кг, на 14 21 день после 3-х-кратной иммунизации штаммом Л1/89 антигемагглютинины в сыворотке крови содержатся в титре 1:40, вируснейтрализующие антитела 2,0 lg ИН.

У обезьян, зараженных в головной мозг штаммом Л1, через 21 день 1,5 месяца титр антигемагглютининов к вирусу КЭ в сыворотке крови 1:20-1:40.

ИММУНОГЕННОСТЬ.

У мышей BAIB/c и СВА, весом 14 16 г однократно подкожно иммунизированных штаммом Л1/89, развивается резистентность к внутрибрюшинному заражению патогенным штаммом вируса клещевого энцефалита Абсеттаров. Индекс резистентности (разница в инфекционном титре тест-штамма на иммунизированных и контрольных мышах) составляет 6,9 7,4 и 5,4 6,6 lg ЛД₅₀, соответственно.

На мышах BAIB/c показана также иммуногенность штамма Л1/89 против патогенных восточных штаммов вируса клещевого энцефалита N 205 и Софьин (ИР6 lg ЛД₅₀), против вируса омской геморрагической лихорадки (ИР7 lg ЛД₅₀) и против вируса шотландского энцефаломиелита овец (ИР=4,0 lg ЛД₅₀).

СТАБИЛЬНОСТЬ.

Штамм Л1/89 стабилен, его свойства сохраняются неизменными в течение 10 пассажей в культурах клеток СПЭВ и КФ и через мозг нелинейных белых мышей весом 7 8 и 8 10 г.

ПРИМЕРЫ ИЛЛЮСТРИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕДЛАГАЕМОГО ШТАММА:

ПРИМЕР 1. Нейровирулентность штамма Л1/89 для приматов при интрацеребральном и интраспинальном заражении.

В опытах использовали яванских макак (M.fascicularis), макак-резусов (M. mulatta), лапундеров (M.nemestrina) и павианов-гамадрилов (Papio hamadrias), весом от 1,5 до 4,5 кг, из питомника НИИЭПиТ (г.Сухуми). Животных заражали под наркозом. В головной мозг вируссодержащую суспензию мозга мышей вводили в объеме 0,6 мл (в правый таламус), в спинной мозг в объеме 0,1 мл (в поясничное утолщение). За животными наблюдали 1-1,5 мес. Четыре обезьяны находились под долгосрочным наблюдением 6 и 12 мес. По методу D.Bodian [43] оценивали двигательную функцию конечностей животных в баллах от "5" (норма) до "0" (полный паралич) в порядке: правая рука, левая рука, правая нога, левая нога. По методу N. Nathanson [33] оценивали общий локомоторный статус животного по шкале от "0" (норма) до "4+" (тяжелый энцефалит с параличами, агония) в зависимости от появления и продолжительности следующих симптомов: ограниченность движений, тремор, судороги, парезы, параличи, атаксия. После окончания наблюдения животных усыпляли, а головной и спинной мозг фиксировали в 10% формалине для патоморфологического исследования. Гистологические препараты готовили и исследовали по методике N.Nathanson et al [42] заливка блоков ЦНС в парафин, окраска препаратов по методу Ниссля, оценка степени гистологических изменений на срезах в индикаторных центрах для всех отделов ЦНС, за исключением мозжечка, по шкале:

0 нет изменений.

1 1 периваскулярная муфта или 1 глиальный узелок, могут быть изменения нейронов.

2 2-5 маленьких периваскулярных муфт или инфильтратов, изменения нейтронов могут быть, но не превышают 33%

3 изменены или дегенерировали 33-90% нейронов, 6 или более периваскулярных муфт или инфильтратов или эквивалентная зона диффузной инфильтрации.

4 более 90% нейронов изменены или погибли, обширные воспалительные инфильтраты.

Для мозжечка:

1 1 маленький глиальный узелок или участок лептоменингита.

2 2-10 маленьких глиальных узелков или участков лептоменингита.

3 11 или более маленьких глиальных узелков или участков лептоменингита или эквивалентная зона сливного менингита, могут быть изменения нейронов, но не обязательно.

4 по крайней мере 50% клеток Пуркинье изменены или погибли, тяжелые воспалительные изменения.

Индикаторные центры:

В головном мозге стриопалидарная система, зрительный бугор, черное вещество, кора мозжечка, ретикулярная формация;

в спинном мозге передние рога серого вещества и передне-боковые столбы белого вещества в шейном и поясничном отделах.

В таблице 1 представлены результаты клинических наблюдений над обезьянами, зараженными в головной мозг штаммом Л1/89. Все 26 обезьян (представители 4-х видов) были клинически здоровы в течение всего срока наблюдения, функция конечностей не изменялась.

В таблице 2 представлены результаты клинических наблюдений над обезьянами, зараженными штаммом Л1/89 интраспинально. Все 8 обезьян оставались клинически здоровыми весь период наблюдения.

В таблице 3 представлены результаты патоморфологического исследования ЦНС обезьян, зараженных в головной или спинной мозг штаммом Л1/89 (13 животных из таблицы 1). Через 1-1,5 месяца после заражения изменения в индикаторных центрах ЦНС имели воспалительный характер, деструкция нейронов не была выявлена, усредненные результаты указывают на высокую степень аттенуации вируса (менее 1 по шкале N.Nathanson et al). Через 6 месяцев после заражения у обезьян NN 765 и 785 были выявлены только единичные периваскулярные муфты в стриопалледарной системе. Через 12 месяцев после заражения у обезьяны N 974 не зарегистрировано патологических изменений в ЦНС. Таким образом, степень выраженности воспалительных изменений в ЦНС снижается к отдаленным срокам после заражения, что свидетельствует о затухании процесса. Признаков хронизации инфекции, ее прогредиентного течения, деструкции нервных клеток не установлено.

ПРИМЕР 2. Стабильность вируса Л1/89.

Исследовали уровень остаточной нейровирулентности варианта Л1/89 при его пассировании на белых мышах, весом 7-8 и 8-10 г, и в культурах клеток КФ и СПЭВ. Стабильность варианта Л1/89 на выборочных пассажах контролировали по индексу инвазивности (разности инфекционных титров при внутримозговом и подкожном заражении) на мышах BAIB/c весом 14-16 г, поскольку этот показатель находится в тесной корреляции с уровнем нейровирулентности для обезьян при интрацеребральном заражении. Пассирование вируса Л1/89 в указанных биологических системах не приводило к существенному изменению его остаточной нейровирулентности, поскольку индекс инвазивности оставался на высоком уровне (табл.4). Даже пассирование вируса Л1/89 в культуре клеток КФ при 40^oC, т.е. в условиях селективных для патогенных частиц (опыт N 4) не приводило к повышению нейровирулентности штамма по данным контроля, на мышах. В противоположность прототипному клону N 5 штамм Л1/89 стабилен в клетках СПЭВ.

ПРИМЕР 3. Иммуногенность штамма Л1/89.

Иммуногенность штамма Л1/89 исследовали на мышах BAIB/c весом 14-16 г. Определяли резистентность мышей, иммунизированных однократно, подкожно к внутрибрюшинному заражению патогенными штаммами вируса клещевого энцефалита (Абсеттаров, N 205, Софьин) и вирусами омской гемаррагической лихорадки (ОГЛ) и шотландского энцефаломиелита овец (ШЭО). В таблице 5 представлены результаты этих исследований. Иммунизация штаммом Л1/89 защищает мышей не только от патогенных штаммов вируса КЭ, но и от других патогенных вирусов комплекса клещевого энцефалита. Индекс резистентности против вируса КЭ и ОГЛ превышает 5,5 lg ЛД₅₀, против вируса ШЭО равен 4 lg ЛД₅₀.

Экспериментальные вакцины, на основе штамма Л1/89, приготавливали путем заражения культур клеток вируссодержащей суспензией мозга мышей, забитых на стадии клинического проявления энцефалита. Первично-трипсинизированную культуру клеток КФ и перевиваемую линию диплоидных клеток М-22 культивировали в монослое. В качестве вакцины использовали культуральную жидкость на высоте репродукции вируса. В таблице 6 представлены данные определения иммуногенности экспериментальных вакцин в опытах на мышах BAIB/c. Индекс резистентности против патогенных штаммов, в среднем, составлял 7 lg ЛД₅₀.

Представленные примеры позволяют сравнить штамм Л1/89 с прототипным клоном N 5 вируса Лангат ТР-21 и выявить его преимущества. Штамм Л1/89 стабилен по нейровирулентности при пассировании в культурах клеток КФ, СПЭВ и на мышах. Клон N 5 повышал нейровирулентность при пассировании в клетках СПЭВ [41] Таким образом, штамм Л1/89 отличается от прототипного большей стабильностью.

По данным А.Е.Чигиринского [12] клон N 5 при интрацеребральном заражении вызвал клинически выраженный энцефалит у одной из 7 обезьян, а патоморфологические изменения в спинном мозге у 3-х животных достигали второй степени, у 3-х третьей степени, у одной четвертой. Штамм Л1/89, в нашем исследовании, не вызвал клинически выраженного энцефалита ни у одной из 26 интрацеребрально зараженных обезьян (табл.1). Патоморфологические изменения в спинном мозге практически отсутствовали у 5 из 6 животных, обследованных в аналогичные сроки после заражения, только у одной обезьяны реакция в спинном мозге на вирусную инфекцию была выражена. По усредненным показателям патоморфологические изменения были ниже 1 степени по шкале N.Nathanson (табл.3).

Прямое сопоставление остаточной нейровирулентности штамма Л1/89 и вируса Еланцев было проведено нами на павианах. Как уже указывалось (табл.1), интрацеребральное заражение 11 павианов штаммом Л1/89 в дозах 5,8-7,5 lg ЛД₅₀ не вызвало клинически выраженного энцефалита. Все 9 павианов, зараженных в головной мозг вирусом Еланцев в дозе 6,8 lg ЛД₅₀ заболели на 12 15 день (табл. 7). Клиника болезни имела типичную картину энцефаломиелита, в двух случаях с фатальным течением. По данным научной литературы, вирус Еланцев вызывал клинически выраженный энцефалит у 30 75% обезьян M.mulatta [7,44] Таким образом, более низкая остаточная нейровирулентность предлагаемого штамма Л1/89 по сравнению с первым вариантом живой вакцины против клещевого энцефалита на основе вируса Еланцев, несомненна.

По иммуногенности на мышах штамм Л1/89 близок вирусу Еланцев: минимальная иммунизирующая доза составляет 10-100 мышиных интрацеребральных ЛД₅₀, спектр протективного действия включает вирусы комплекса клещевого энцефалита, индекс резистентности превышает 5 lg ЛД₅₀.

Таким образом, штамм Л1/89 отличается от ранее предложенных кандидатов для живой вакцины против клещевого энцефалита стабильностью и меньшей остаточной нейровирулентностью для приматов.