производные гризеоловой кислоты или их фармацевтически приемлемые соли или их сложные эфиры (варианты)

Формула изобретения

1. Производные гризеоловой кислоты общей формулы I



где R⁵ и R⁶ оба представляют собой дополнительную углерод-углеродную связь между углеродными атомами, к которым они присоединены; R²⁹ группу OH;

R³⁰ (C₁-C₄) алкил или арил (C₁-C₄) алкил,

R³¹ и R³² одинаковые или различные представляют собой атом водорода или карбоксизащитную группу, или их фармацевтически приемлемые соли, или их сложные эфиры.

2. Производные гризеоловой кислоты общей формулы II



где R⁵ и R⁶ оба представляют собой атом водорода или вместе представляют дополнительную углерод-углеродную связь между углеродными атомами, к которым они присоединены;

R²² и R²³ одинаковые или различные и каждый представляет карбоксизащитную группу;

R²⁹ гидроксильную группу;

R³⁰ алкил или аралкил, необязательно замещенный в арильной части по крайней мере одной нитро, метокси или галогеногруппой;

или их фармацевтически приемлемые соли и их сложные эфиры.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ряду новых производных гризеоловой кислоты к промежуточным обеспечивающим получение этих соединений и методы и композиции для их использования.

Гризеоловая кислота является соединением нуклеозидного типа, имеющим основание аденина и две группы карбоновой кислоты. Она впервые была описана inter alia в спецификации Европейской патентной заявки N 293229А, но ее структура не была известна на этой стадии. Ее структура была впервые описана в патенте США N 4 460 765. Некоторые производные гризеоловой кислоты были в последующем описаны в патентной заявке США N 664866 от 25 октября 1984 года, и там также описывается структура гризеолевой кислоты. Другие производные гризеолевой кислоты, конкретно дигидродезоксигризеолевая кислота и ее соли и сложные эфиры описаны в патентной заявке США N 734868 от 16 мая 1985 года.

В соответствии с рекомендациями Международного объединения чистой и прикладной химии (IUРАС), соединения изобретения названы как производные гризеолевой кислоты (или дигидродезоксигризеолевой кислоты), принимая гризеолевую кислоту в качестве исходной структуры. Применяемая система нумерации представлена в патентной заявке США N 664866.

Гризеолевая кислота и производные гризеолевой кислоты из патентных заявок США N 664866 и N 734868, а также производные данного изобретения, проявляют способность ингибировать активность фосфодиэстеразы, специфической к различным циклическим нуклеотидам, например, 3",5"-циклический аденозин монофосфат (сАМР) фосфодиэстеразы (PDE) или 3",5"-циклический гуанозин монофосфат (cGMP) PDE и может, таким образом, увеличивать уровень циклического нуклеотида, например сАМР или GMP, в клетках пациента, к которому применено такое соединение.

Хорошо известно, что сАМР, который очень широко распространен в тканях животных, функционирует в качестве второго носителя и занимает промежуточное положение по действию для большого числа гормонов; в результате этот сАМР имеет различное очень важное физиологическое и биохимическое значение. Кроме того известно, что он воздействует на или принимает участие в: делении, пролиферации и дифференциации клеток; систологической системе, особенной миокардо, гематопозис; различные функции центральной нервной системы; иммунные реакции; и выделение инсулина и гистамина. Его концентрация в тканях, и, следовательно, его действие на эти различные функции, зависят от баланса между энзимом, который синтезирует сАМР (то есть аденилат циклаза) и энзимом, который разлагает сАМР, сGMP PDE. Ингибитор против сАМР будет увеличивать уровень сАМP в клетках и, таким образом, может использоваться для различных терапевтических целей, например: в лечении сердечно-сосудистых заболеваний; как антиастматический агент; как мышечный релаксант; как психотропный или нейтротропный агент; как антивоспалительный агент; в терапии рака; для лечения диабетов.

Функции воздействия других циклических нуклеотидов, например сGMP, к настоящему времени изучены в меньшей степени. Однако, как полагают, они имеют область активности такую же, хотя и не идентичную, как и сАМР. Следовательно, ингибирование PDE, специфических к другим циклическим нуклеотидам, будет приводить к области терапевтических воздействий, подобных воздействиям за счет ингибирования сАМР PDE. Поскольку функции воздействия таких других циклических нуклеотидов, находятся в стадии объяснения, возникает потребность ингибирования PDE, связанных с такими другими нуклеотидами, ингибиторы которых проявляют увеличенную специфичность к тем или иным PDE других нуклеотидов, а не к PDE сАМР; действительно, развитие таких ингибиторов может даже помочь или стимулировать исследование таких других циклических нуклеотидов.

В дополнение к гризеолевой кислоте и ее производным, другие соединения, как известно, ингибируют PDE cAMP и cGMP, и эти соединения включают папаверин, дипиридамо и некоторые соединения, которые относятся к составным основаниям нуклеиновых кислот, такие как терфилин или MSB 22, 948 [Kukovetz et al. Naunyn-Schmiedeberg"s etrch. Pharmakol. , 129 (1979)]

Был открыт ряд соединений, которые относятся к гризеолевой кислоте и дигидродезоксигризеолевой кислоте и которые обладают активностью гризеолевой кислоты и дигидрорезоксигризеолевой кислоты. Некоторые из этих соединений неожиданно проявляют увеличенную активность против сGMP PDE, чем против сАМР PDE. Соединения изобретения, сохраняя целевую активность, являются также ценными как промежуточные в получении других соответствующих целевых соединений.

Целью изобретения является получение вещества нового состава, а именно производных гризеоловой кислоты и солей и сложных эфиров этих соединений.

Кроме того, целью изобретения является обеспечение промежуточных соединений для получения производных гризеолевой кислоты, которые проявляют способность ингибировать активность PDE, которые разлагают циклические нуклеотиды, например сАМР или сGMP PDE, и имеют следующую формулу I:



где R⁵ и R⁶ оба представляют собой дополнительную углерод-углеродную связь между углеродными атомами, к которым они присоединены;

R²⁹ представляет группу ОН;

R³⁰ представляет собой C₁-C₄-алкил или арил (С₁-C₄)-алкил;

R³¹ и R³² одинаковые или различные представляют собой атом водорода или карбокси защитную группу;

и его фармацевтически приемлемые соли и его сложные эфиры.

Соединения формулы I могут входить в фармацевтические композиции, включающие ингибитор фосфодиэстеразы в смеси с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, где указанный ингибитор фосфодиэстеразы выбирают из группы, состоящей из соединений формулы I, как определено выше, и фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров этих соединений.

Предлагаемые соединения используют при лечении животных, особенно млекопитающий, например человека, страдающих от расстройства, вызванного нарушением баланса в уровнях фосфодиэстеразы, путем применения к указанным животным ингибитора фосфодиэстеразы, где указанный ингибитор фосфодиэстеразы выбирают из группы, состоящей из соединений формулы I, как определено выше, и фармацевтически приемлемых солей и сложных эфиров этих соединений.

Дополнительной целью изобретения является обеспечение способа получения соединений формулы I.

Соединения изобретения, используемые в качестве промежуточных продуктов являются соединениями формулы II:



где R⁵ и R⁶ оба представляют собой атомы водорода или вместе представляют дополнительную углерод-углеродную связь между атомами углерода, к которым они присоединены;

R²² и R²³ одинаковые или различные, и каждый представляет карбоксизащищающую группу;

R²⁹ гидроксильная группа;

R³⁰ представляет собой алкильную или аралкильную группу, необязательно замещенную в арильной части, по крайней мере, одной нитро, метокси или галогено группой.

Там, где в описании встречается название "арильные" группы, либо сами по себе, либо как часть большей группы (например, "аралкильная группа"), это означает карбоциклическую арильную группу, предпочтительно имеющую 6 14, более предпочтительно 6 10, кольцевых атомов углерода (например, фенильная группа, или 1- или 2-нафтильная группа), которая может быть замещенной или незамещенной. Если группа является замещенной, то заместителей обычно выбирают из С_1-4-алкокси групп, атомов галогена, нитро групп.

В соединениях изобретения, где упоминается атом галогена, он означает атом фтора, хлора, брома или иода.

Соединения формулы I и формулы XL содержат две карбоксильные группы и таким образом могут образовывать моно- или ди-соли и моно- или ди- сложные эфиры. В случае ди-солей или ди-сложных эфиров, катионные фрагменты солей или спиртовых фрагментов сложных эфиров могут быть одинаковыми или различными. Однако на практике наиболее легко приготовить ди-соли или ди-сложные эфиры, в которых два катионных фрагмента или даже спиртовых фрагмента являются одинаковыми.

Не имеется особого ограничения по природе спиртового фрагмента сложного эфира при условии, что, когда соединение предназначается для терапевтического использования, этот фрагмент должен быть "фармацевтически приемлемым", что, как хорошо известно специалистам в этой области науки, означает, что он не уменьшает или уменьшает в приемлемой степени активность соединения или его токсичность, и все сложные эфиры, подходящим образом получаемые из соединений этого типа, могут быть образованы с соединениями изобретения. Если сложные эфиры не предназначены для терапевтического использования (например, как интермедиаты), даже это ограничение не требуется. Примеры таких сложных эфиров включают: С_1-6-сложные эфиры, особенно метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил, и трет-бутил сложные эфиры; аралкил-сложные эфиры, особенно бензил, пара-нитробензил, орто-нитро-бензил, три-феринметил, бис/орто-нитрофенил/метил, 9-антрилметил, 2,4,6-триметилбензил-пара-бромбензил, пара-метоксибензил, пиперонил и бензгидрил сложные эфиры; С_1-6-галоалкил сложные эфиры, которые могут иметь 1 или более галогенов (например, хлор, бром, фтор или иод), вплоть до полного пергалогенирования, например 2,2,2-трохлорэтил, 2-хлорэтил, 2-бромэтил, 2-фторэтил, 2-иодэтил и 2,2-дибромэтил сложные эфиры; алкоксиметил сложные эфиры, где алкокси часть предпочтительно состоит из C_1-4, например метоксиметил, этоксиметил, пропоксиметил, изопропоксиметил и бутоксиметил сложные эфиры; алифатические ацилоксиалкил сложные эфиры (особенно ацилоксиметил и ацилоксиэтил сложные эфиры), такие как ацетоксиметил, пропионилоксиметил, бутирилоксиметил, пивалоилоксиметил, 1-ацетоксиэтил, 1-пропионилоксиэтил, 1-бутирилоксиэтил, и 1-пивалоилоксиэтил сложные эфиры; (С_1-4-алкил) оксикарбонилоксиэтил сложные эфиры, такие как 1-метоксикарбонилоксиэтил, 1-этоксикарбонилоксиэтил, 1-пропоксикарбонилоксиэтил, 1-изопропоксикарбонилоксиэтил, 1-бутоксикарбонилоксиэтил и 1-изобутоксикарбонилоксиэтил сложные эфиры; гетероциклические сложные эфиры, такие как фталидил сложные эфиры; гетероциклил-метил сложные эфиры, в которых гетероциклическая группа является, предпочтительно, группой, например (5-метил-2-оксо-1,3-диоксолен-4-ил)метиловые сложные эфиры; и сложные эфиры, которые легко гидролизуются in vivo, класс которых включает некоторые сложные эфиры классов, указанных выше, например алифатические ацилоксиалкил сложные эфиры, низший алкоксикарбонилоксиэтил сложные эфиры, (5-метил-2-оксо-1,3-диоксолен-4-ил/метил сложные эфиры ифталидил сложные эфиры.

Не имеется особых ограничений по природе катионов, используемых для образования солей соединений изобретения, при условии, что, если они предназначены для терапевтического использования, то они являются фармацевтически приемлемыми. С другой стороны, если они не предназначены для использования в терапевтических целях (например, в качестве интермедиатов), даже эти ограничения не требуются. Предпочтительные соли включают соли щелочных металлов (таких как натрий или калий) или с щелочно-земельными металлами (такими как кальций).

Природа кислоты, используемой для образования солей не является существенной, при условии, что если они предназначены для терапевтического использования, они являются фармацевтически приемлемыми. С другой стороны, если они не предназначены для использования в терапевтических целях (например, в качестве интермедиатов), даже такое ограничение не требуется. Примеры таких кислот включают: неорганические кислоты, такие как соляная кислота, серная кислота и фосфорная кислота; органические карбоновые кислоты, такие как уксусная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, винная кислота, фумаровая кислота, лауриновая кислота, стеариновая кислота и пальмитиновая кислота; и такие органические сульфокислоты как метансульфокислота, бензолсульфокислота, и пара-толуолсульфокислота.

Соединения изобретения имеют ряд асимметричных атомов углерода в своих молекулах и могут, следовательно, существовать в виде различных стереоизомеров. Изобретение включает как индивидуальные изомеры, так и смеси этих изомеров. Гризеолевая кислота, будучи натуральным продуктом, является единственным изомером, в котором оба 2" и 7" атома углерода находятся в R-конфигурации; соединения, полученные из гризеолевой кислоты, могут сохранить такую же конфиругацию или могут иметь инвертированную конфигурацию у одного или более асимметричных атомов углерода. Например, когда R" представляет собой группу или атом иной, чем водород, конфигурация соединений у 2"-положения может быть альфа или бета.

Когда R²⁹ представляет собой группу или атом иной, чем водород, конфигурация у 7"-положения может быть RS, R или S.

Как указывалось выше, гризеолевая кислота представляет собой известное соединение, раскрытое, например, в описании Европейского патента N 29.329 или в описании патента США N 4 460 765. Дигидродезоксигризеолевая кислота раскрыта в опубликованном Европейском патенте N 0162715. Как гризеоловая кислота, так и дигидродезоксигризеоловая кислота могут быть получены путем культивирования подходящих микроорганизмов, относящихся к виду Streptomyces, особенно Streptomyces griseodyrantidems ANK 63479 (депонированных 9 октября 1979 г. в ферментационном исследовательском Институте, Агенство промышленной науки и технологии, Япония, откуда они могут быть предоставлены в распоряжение потребителя под каталожным номером FE R M-Р5223 и 22 октября 1980 г. в Сельскохозяйственной исследовательской службе, Пеория, США, откуда они могут поставляться под каталожным номером NRRL 12314). Все подробности, касающиеся характеристики Streptomyces griseoduranteducs SANK 63479, приведены в публикации Европейского патента N 29329А и в описании патента США N 4 460 765.

Получение соединения формулы I, а также использование в качестве промежуточного продукта соединения формулы XL показано на следующих реакционных схемах:





где R⁵, R⁶ имеют указанные выше значения;

R²² и R²³ могут иметь одинаковое или различные значения и каждый из них представляет собой карбоксизащищающую группу;

R³⁰ представляет собой алкильную группу или аралкильную группу;

R³¹ и R³² могут иметь одинаковые или различные значения и каждый из них представляет собой атом водорода или карбокси-защищающую группу.

Соединение формулы XL получают из N"-оксида (XXXIX) по реакции N"-оксида (XXXIX) с низшим галоидным алкилом или галоидным алкилом или галоидным аралкилом, как показано на вышеприведенной схеме (стадия 30).

Реакцию проводят в присутствии органического основания и, предпочтительно, в присутствии растворителя. Природа используемого растворителя не имеет решающего значения при условии, что он не оказывает вредного влияния на ход реакции и может растворять реагенты, по крайней мере, в некоторой степени. Подходящие растворители включают амиды кислот, такие как диметилформамид или диметилацетамид. Подходящие органические основания включают триалкиламины, например триэтиламин. Не имеется конкретного ограничения, касающегося природы галоидного соединения при условии, что оно способно алкилировать или аралкилировать гидрокси группу. Подходящие для этой цели низшие аралкил галоиды включают бромистый бензил и бромистый п/нитробензил. Реакцию можно проводить в широком температурном интервале, хотя обычно удобнее всего проводить ее при температуре, лежащей в интервале 0 - 100^oС, более предпочтительно при температуре, близкой к комнатной. Время, требуемое для проведения такой реакции, может изменяться в широком диапазоне в зависимости от многих факторов, главным образом от природы реагентов и температуры реакции; однако обычно достаточно проводить реакцию в течение 1 - 20 ч.

После завершения реакции целевой продукт можно выделить из реакционной смеси обычными способами. Так, например, реакционную смесь при необходимости промывают водой, а затем растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток можно очистить различными способами, такими как перекристаллизация и различные хроматографические методики, например на хроматографической колонке или с помощью препаративной тонкослойной хроматографии для получения целевого соединения.

Стадия 31 и все последующие приведены для иллюстрации использования соединения формулы (XL) для получения конечного продукта формулы I.

Стадия 31.

Cоединение формулы XL, полученное как описано выше (применительно к стадии 30) превращают в соединение формулы I (стадия 31). Такую реакцию предпочтительно проводят следующим образом. Вначале соединение формулы XL обрабатывают щелочью в среде растворителя при значении рН в интервале 12 13 с целью раскрытия пиримидинового кольца (при этом также иногда удаляются карбокси-защищающие группы). Затем рН реакционной смеси повторно доводят до значения 7,0 и смесь подвергают нагреванию с целью повторной циклизации, в результате чего получают соединение формулы I, в котором содержатся незащищенные карбокси группы (т.е. оба радикала R³¹ и R³² представляют собой атомы водорода). Предпочтительными щелочами для первой стадии такой реакции могут служить водные растворы гидроокисей щелочных металлов, например гидроокисей натрий и калия. На природу используемого растворителя не накладывается конкретных ограничений при условии, что он не препятствует ходу реакции и способен растворять исходные соединения, по крайней мере, в некоторой степени. Предпочтительно использовать воду или смесь воды с низшим спиртом, например с метанолом или этанолом. Обе реакции могут проводиться в широком температурном интервале и выбор конкретной температуры не имеет решающего значения. Температура близкая к комнатной предпочтительна для реакции раскрытия кольца и при такой температуре и значении рН около 12 реакция обычно завершается за 30 60 мин. Реакцию циклизации предпочтительно проводят при температуре от 0^o до 100^oС и при такой температуре реакцию обычно завершают за 1 5 ч.

Если желательно, то в ходе таких реакций может быть осуществлена защита карбокси групп с помощью процесса этерификации.

С целью защиты карбокси групп предпочитают проводить реакцию гризеоловой кислоты с диазосоединением, например с диазометаном или дифенилдиазометаном, или с триазиновым соединением, особенно с производным п-толилтриазина, например с N-метил-п-толилтриазином. Такую реакцию предпочтительно проводить в присутствии растворителя, природа которого не имеет решающего значения при условии, что он не оказывает вредного воздействия на реакцию, а также при условии возможности растворения исходных веществ в таком растворителе, по крайней мере, в некоторой степени. Подходящие для этой цели растворители включают: кетоны, например ацетон; эфиры, например тетрагидрофуран; амиды, например диметилформамид; а также смеси воды с одним или более из указанных выше органических растворителей. Реакция может протекать в широком температурном интервале и выбор конкретной температуры реакции не имеет решающего значения, хотя обычно предпочитают проводить реакцию в интервале температур от -20^oС до +50^oС. Время, требуемое для осуществления реакции, будет изменяться в зависимости от многих факторов, в особенности от природы исходных веществ и температуры реакции; однако, например, при комнатной температуре для осуществления такой реакции обычно требуется 1 24 ч.

Стадия 32.

На этой стадии удаляют алкильную или аралкильную группу R³⁰ и замещают ее атомом водорода каталитическим восстановлением. Реакцию предпочтительно проводят в присутствии растворителя, природа которого не имеет решающего значения при условии, что он не оказывает вредного побочного влияния на ход реакции и способен растворять исходные вещества, по крайней мере, в некоторой степени. Предпочтительными растворителями могут служить органические карбоновые кислоты, особенно такие жирные кислоты как уксусная кислота. Не имеется конкретного ограничения относительно природы катализатора и на этой стадии может использоваться любой катализатор, обычно применяемый для процессов каталитического восстановления, предпочтительно использовать окись платины, платину на угле, или палладий на угле, еще более предпочтительным является хлористый палладий, адсорбированный на активном древесном угле. Такую реакцию предпочтительно проводят путем перемешивания смеси катализатора с соединением формулы I в среде выбранного растворителя в атмосфере водорода. Реакцию можно проводит в широком температурном интервале и выбор конкретной температуры не имеет решающего значения. Как правило, удобнее всего проводить такую реакцию при температуре 5 60^oС. Время, требуемое для осуществления такой реакции, может изменяться в широком интервале в зависимости от многих факторов, включающих природу соединения I и условия проведения реакции, особенно температуру реакции; однако в предложенных выше условиях обычно достаточно проводить реакцию в течение 1 10 ч. Если желательно, то полученное в результате соединение может быть подвергнуто необязательному дальнейшему превращению, далее описанному для стадии 34.

Стадия 33.

На этой стадии проводят реакции раскрытия кольца и повторной циклизации, аналогичные тем, что описаны для стадии 3, не затрагивая при этом карбокси-защищающие группы. Такую реакцию предпочтительно проводят в присутствии растворителя, природа которого не имеет решающего значения при условии, что он не препятствует ходу реакции и способен растворять, по крайней мере, в некоторой степени исходное соединение. Предпочтительно, чтобы растворитель был способен поддерживать значение рН реакционного раствора в интервале 6 8 и, соответственно, предпочтительно использовать смесь буферного раствора с рН 6 8 и низшего спирта, например метанола или этанола, предпочтительно смесь буфера с рН 7,0 и метанола. Реакцию можно проводить в широком температурном интервале, например в интервале 30 150^oС. Время, требуемое для проведения реакции, может изменяться в зависимости от многих факторов, главным образом от температуры реакции, значения рН и природы исходных веществ и растворителей; однако в предложенных выше условиях такую реакцию достаточно проводить в течение 3 10 ч. Если желательно, то полученное в результате соединение может быть подвергнуто необязательной операции, описанной далее на стадии 34.

Стадия 34.

На этой стадии алкокси или аралкилокси группу -OR³⁰ замещают на атом водорода путем обработки соединения активным металлом в присутствии растворителя. Природа растворителя не имеет решающего значения при условии, что он не оказывает вредного влияния на ход реакции и способен растворять исходные вещества, по крайней мере, в некоторой степени. Подходящий для этой цели растворитель представляет собой смесь разбавленного водного раствора кислоты, например разбавленного водного раствора хлористоводородной кислоты, и смешивающего с водой органического растворителя, например ацетона. Предпочтительный растворитель представляет собой смесь равных объемов 1 н. водного раствора хлористоводородной кислоты и ацетона. На природу активного металла не накладывается конкретного ограничения при условии, что он может использоваться в реакции восстановления, где кислота служит донором протонов. Такие активные металлы как никель Рэнея являются предпочтительными. Реакцию проводят в широком температурном интервале, хотя обычно удобнее всего проводить такую реакцию при температурах 0 50^oС. Время, требуемое для осуществления реакции, может изменяться в широком диапазоне в зависимости от многих факторов, главным образом от природы реагентов и температуры реакции; однако в предложенных выше условиях обычно достаточно проводить реакцию в течение 1 10 ч.

Если желательно, то защищающие группы могут быть удалены, причем как хорошо известно, природа реакции удаления защитной группы зависит от природы защищающей группы.

В том случае, когда низшая алкильная группа используется в качестве карбокси-защищающей группы, она может быть удалена в результате обработки соединения основанием, особенно гидроокисью щелочного металла, например гидроокисью натрия. Предпочтительно использовать водный раствор гидроокиси щелочного металла, например 1 н. водный раствор гидроокиси натрия. Реакцию предпочтительно проводят в присутствии растворителя, природа которого не имеет определяющего значения для данного изобретения, при условии, что он не оказывает вредного влияния на ход реакции. Как правило, эффективным для этой цели является водный раствор. Реакцию можно проводить в широком температурном интервале, хотя обычно ее удобнее проводить при температуре, близкой к комнатной. Время, требуемое для проведения реакции, может изменяться в широких пределах, однако обычно достаточным является период времени от 30 мин до 10 ч.

В том случае, когда карбокси-защищающая группа представляет собой аралкильную группу или низшую галоалкильную группу, их предпочтительно удаляют восстановлением. Предпочтительными восстанавливающими агентами могут служить: в случае низших галоалкильных групп система цинк-водный раствор уксусной кислоты; а в случае аралкильных групп водород и катализатор (например, палладий на угле или пластина) или сульфид щелочного металла (например, сульфид калия или сульфид натрия). Реакцию предпочтительно проводят в присутствии растворителя, природа которого не имеет решающего значения при условии, что он не оказывает нежелательного влияния на ход реакции. Примеры подходящих растворителей включают такие спирты как метанол или этанол; такие эфиры как тетрагидрофуран или диаксан; жирные кислоты, например уксусная кислота; или смеси одного или более органических растворителей с водой. Время, требуемое для проведения реакции, не имеет решающего значения, хотя обычно предпочтительно проводить такую реакцию при температуре, лежащей в интервале от 0^oС до комнатной температуры. При такой температуре реакции обычно достаточно проводить в течение периода времени от 5 мин до 12 ч.

В том случае, когда карбокси-защищающая группа представляет собой алкоксиметильную группу, такая группа может быть удалена путем обработки соединений кислотой в среде растворителя. Предпочтительные кислоты включают: хлористоводородную кислоту; смесь уксусной кислоты с серной кислотой; или смесь п-толуолсульфокислоты с уксусной кислотой. Не имеется конкретных ограничений относительно природы растворителя, используемого в данной реакции при условии, что он не оказывает нежелательного воздействия на ход реакции. Подходящие для этой цели растворители включают: такие спирты, как метанол или этанол; такие эфиры, как тетрагидрофуран или диоксан; а также смеси одного или более из таких растворителей с водой. Не имеется конкретного ограничения относительно температуры реакции, хотя обычно удобнее всего проводить такую реакцию при температуре, лежащей в интервале 0 50^oС, причем реакцию обычно достаточно проводить в течение периода времени от 10 мин до 18 ч.

Если карбокси-защищающую группу удаляют путем обработки водным раствором аммиака, такая операция обычно приводит к превращению карбоксигрупп, находящихся в положениях 8" и 7", в карбамоильные группы.

Если желательно, то свободная карбоновая кислота может быть превращена в соль, например в соль щелочного металла, общепринятыми методами. Так, например, подходящая для этой цели реакция заключается в растворении кислоты в смеси воды и несмешивающегося с водой органического растворителя, такого как этилацетат, добавлении водного раствора соответствующего карбоната или бикарбоната щелочного металла (такого как карбонат калия или бикарбонат натрия) при соответствующей температуре, например при температуре в интервале от 0^oС до комнатной температуры, и последующем регулировании рН системы, например на значении, равном 7, с тем, чтобы образовавшуюся соль можно было выделить осаждением.

Полученная в результате соль карбоновой кислоты, если это желательно, может быть превращена в эфир, карбоксильные группы которого защищают легко гидролизуемыми in vivo защищающими группами. Вначале соль кислоты растворяют в соответствующем растворителе, например в таком эфире как тетрагидрофуран; или в таком полярном растворителе как диметилформамид, диметилсульфоксид, триамид гексаметилфосфорной кислоты или триэтилфосфат. Затем проводят реакцию, по крайней мере, с двумя эквивалентными основания, например органического основания, такого как триэтиламин или дициклогексиламин, гидрида щелочного металла, например гидрида натрия, или карбоната или бикарбоната щелочного металла, такого как карбонат натрия, карбонат натрия или бикарбоната натрия, с образованием соли, и проводят реакцию между полученной в результате солью и низшим алифатическим ацилоксиметил галогенидом, например, ацетокесиметил хлоридом или пропионилоксиметил бромидом, с низшим алкоксикарбонилоасиэтил галогенидом, например 1-метоксикарбонилоксиэтилхлоридом или 1-этоксикарбонилоксиэтил иодидом, с фталидил галогенидом или с (2-оксо-5-метил-1,3-диоксолен-4-ил)-метил галогенидом. Реакцию предпочтительно осуществляют в присутствии растворителя, природа которого не имеет решающего значения, при условии, что он не оказывает вредного воздействия на ход реакции. Подходящими растворителями могут служить полярные растворители, на которые ссылались выше. Реакцию можно проводить в широком температурном интервале, хотя обычно удобнее всего проводить такую реакцию при температуре 0 -100^oС. Время, требуемое для проведения реакции, может изменяться в широких пределах; однако в предложенных выше условиях обычно достаточно проводить реакцию в течение времени от 30 мин до 10 ч. Указанная выше стадия может быть использована, если это желательно, на каждом из этапов стадий 32, 33, 34, 36, 37, 38, 50 и 54.

После завершения любой из описанных ранее реакций целевой продукт с каждой из этих стадий можно выделить из реакционной смеси обычными способами. Так, например, реакционную смесь при необходимости промывают водой, а затем растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток можно очистить различными способами, такими как перекристаллизация и различные хроматографические методики, например, на хроматографической колонке или с помощью препаративной тонкослойной хроматографии для получения целевого соединения.

Ингибирующая активность фосфодлиэстеразы (ФДЭ).

Были испытаны некоторые соединения изобретения (здесь и далее обозначенные по номерам примеров) наряду с теофиллином и соединениями патента Канеко (патент США N 463706, Кенако соответствует патентной заявке СССР N 38085/04) в качестве сравнительного соединения.

Испытание проводили практически в соответствии со способом, аналогичным методу A. L. Pichard и W. I. Cheung (Journal of biological chemistry), 251, 5726 5737, 1976). Неочищенный ферментный раствор, полученный из крысиного мозга, использовали в качестве источника сАМР ФДЭ. В качестве субстрата использовали ¹⁴С-меченый сАМР. Его использовали в буферном 0,1 М растворе Трис-соляной кислоты (рН 8,0) в количестве, достаточном для получения окончательной концентрации 0,14 мкМ. "Трис" является трис-(аксиметил)-аминометаном. Раствор субстрата смешивают с соответствующим количеством используемого соединения, растворенного в объеме 2,0 5,0 мкл, диметилсульфоксида и с 20 мкл раствора змеиного яда и 40 мкл неочищенного раствора фермента. Добавляют достаточное количество буфера Трис-соляной кислоты до получения полного объема 100 мкл. Полученной смеси дают реагировать при 30^oС в течение 20 мин. К концу этого промежутка времени реакционную смесь обрабатывают смолой "Амберлит" (торговая марка) IRP-58 и определяют уровень оставшейся радиоактивности аденозина в продукте. Эксперимент проводят для ряда различных концентраций для каждого активного соединения и отсюда рассчитывают значения 50 ингибирования (I₅₀).

Эксперимент повторяют, за исключением того, что вместо сАМР используют циклический гуанозинмонофосфат (сGMP). Снова рассчитывают значения I₅₀ в зависимости от cGMP ФДЭ.

Полученные результаты представлены в табл. 1 и 2, где значения I₅₀ представлены в мкмолях.

Теофиллин, приведенный в табл. 1, является известным соединением, используемым для сравнения также как и соединение патента Канеко (см. табл. 2). Теофиллин, как известно, ингибирует как сАМР ФДЭ, так и с GMP ФДЭ, и его используют терапевтически для этой цели. Наименее эффективное из испытаных соединений изобретения имеет значения I₅₀, которые примерно на порядок меньше, чем соответствующие значения для теофиллина, хотя наиболее эффективные из тестированных соединений изобретения имеют значения I₅₀ на 3 4 порядка ниже, что указывает на то, что активности соединений изобретения в качестве ингибитоpов ФДЭ исключительно велики. Различие в активностях против сАМР ФДЭ и сGMP ФДЭ также отчетливо видны.

Таким образом, возможны различные терапевтические применения соединений, например, при лечении сердечно-сосудистых заболеваний; в качестве противоастматических агентов; как релаксанты гладкой мускулатуры; в качестве психотропных или невротропных агентов; в качестве противовоспалительных агентов при лечении рака и при лечении диабетов.

Соединения формулы I могут также быть использованы в качестве терапевтических агентов при различных церебральных циркуляторных расстройствах, таких как церебральных последствий инсульта, и в качестве активаторов метаболизма в мозге, например при лечении старческого паралича или травматических поражений мозга. Соединения формулы I можно вводить орально или не орально, например подкожно или внутримышечно.

Соединения формулы I можно вводить орально в форме твердых препаратов, которые могут при необходимости содержать различного рода обычные добавки. Эти добавки включают: такие разбавители как сахара и препараты целлюлозы; такие связующие как крахмал, смолы, и метиленцеллюлозу; и распределяющие агенты. Дозы могут изменяться в зависимости от симптомов заболевания, возраста и веса пациента. Так, например, в случае взрослых пациентов подходящей дневной дозой может быть доза 0,1 100 мг/кг активного соединения, которые можно принимать либо сразу, либо в разделенных дозах.

Получение различных соединений изобретения иллюстрируется далее в примерах. Получение некоторых исходных материалов иллюстрируется в последующих примерах.

Пример 1.

1/a/ Диметил-1"-деаденино-1⁶-ацетокси-4"5"-дигидро-0², O⁷-диацетилгризеолат.

2 мл концентрированной серной кислоты добавляют к раствору 500 мг диметил-6-дезамино-6-окси-4",5"-дигидро-O², O⁷-диацетилгризеолата (полученного по способу примера получения 6 как описано в Приготовлении 2) в 100 мл смеси 4 1 по объему уксусной кислоты и уксусного ангидрида, и полученную смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 14 ч в атмосфере азота. К реакционной смеси добавляют 15 г ацетата натрия и полученный растворитель выпаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в насыщенном водном растворе бикарбоната натрия и полученный раствор трижды экстрагируют метиленхлоридом. Метиленхлоридные экстракты объединяют и сушат над безводным сульфатом магния. Затем растворитель выпаривают при пониженном давлении. Остаток очищают на хроматографической колонке с силикагелем, элюируя смесью циклогексан этилацетат 2 1. В результате выпаривания растворителя из второй фракции после элюирования получают 292 мг указанного в заглавии соединения.

ЯМР спектр (СDCl₃), , м. д. 2,44 (1Н, дублет, дублетов, J 6,4 и 14,7 Гц); 2,65 (1Н, дублет дублетов, J 14,7 и 3,0 Гц); 4;98 (1Н, дублет дублетов, J 2,5 и 6,4 Гц); 5,02 (1Н, дублет дублетов, J 2,9 и 4,0 Гц); 5,15 (1Н, дублет дублетов, J 4,0 и 2,5 Гц); 5,72 (1Н, синглет); 6,29 (1Н, дублет, J 2,9 Гц).

Масс-спектр (м/е): 474 (M+МЗ).

Масс-спектр (далее используется сокращение Масс-спектр с бомбардировкой быстрыми электронами: FAB Масс-спектр) с бомбардировкой быстрыми электронами (м/е):431 (М+).

/b/ Диметил-1"-деаденино-1"-a -ацетокси-4",5"-дигидро-O², O⁷-диацетилгризеолат

Первую фракцию, выделенную при хроматографировании на колонке как описано в примере 1/a/, концентрируют, выпаривая при пониженном давлении, до получения 33 мг указанного в заглавии соединения.

ЯМР-спектр (CDCl₃) , м. д. 2,67 (1Н, дублет дублетов, J 7,4 и 15,1 Гц); 2,98 (1Н, дублет дублетов, J 15,1 и 2,9 Гц); 4,94 4,99 (2Н, мультиплет); 5,05 5,07 (1Н, мультиплет); 5,61 (1Н, синглет); 6,38 (1Н, дублет, J 4,9 Гц).

Масс-спектр (м/е): 474 (М+М3).

FAB масс-спектр (м/е): 431 (М+).

1/с/. Диметил-1"-диаденино-1" b -ацетокси-4", 5"-дигидро-², ⁷-дибензоилгризеолат.

Концентрированную серную кислоту (2 мл) добавляют при охлаждении на льду к раствору 400 мг диметил-(6-дезамино-6-окси-4",5"-дигидро-O², ⁷-дибензоилгризеолата), полученного по способу, аналогичному описанным в примерах получения 1 3, 5 и 7, однако, используя в примере получения 2-бензоилхлорид вместо уксусного ангидрида, растворенного в 80 мл смеси 4 1 по объему уксусной кислоты и уксусного ангидрида, и полученной смеси дают выстаиваться при комнатной температуре в течение 14 ч. Затем реакционную смесь смешивают с 15 мг ацетата натрия и концентрируют, выпаривая при пониженном давлении. Остаток растворяют в смеси метиленхлорида и насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и трижды экстрагируют метиленхлоридом. Метиленхлоридные экстракты объединяют и сушат над безводным сульфатом магния, а затем растворитель выпаривают при пониженном давлении. Остаток очищают на хроматографической колонке с силикагелем, элюируют смесью 2 1 циклогексана и этил-ацетата, а фракции, содержащие указанное в заглавии соединение, концентрируют, выпаривая при пониженном давлении до получения 243 г указанного в заглавии соединения.

Спектр ЯМР (CDCl₃), d, м.д. 2,50 2,60 (1Н, мультиплет); 2,96 3,04 (1Н, мультиплет); 5,06-5,16 (2Н, мультиплет); 5,48 5,52 (1Н, мультиплет); 5,88 (1Н, синглет), 6,50 6,58 (1Н, мультиплет).

Элементный анализ для C₂₇H₂₆O₁₂:

Рассчитано, С 59,78; Н 4,83; N 0.

Найдено, C 59,59; H 4,80; N 0,01.

Масс-cпектр (м/е): 585 /М+43/.

Пример 2. Диметилгризеолат N"-оксид.

8,14 г диметилгризеолата, полученного как описано в Приготовлении 1, суспендируют в метаноле. Добавляют 6,90 г мета-хлорпербензойной кислоты, полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 24 ч. Затем растворитель отгоняют при пониженном давлении. Когда растворитель уже почти отогнан, добавляют 300 мл диэтилового эфира и комки в растворе измельчают шпателем до полного исчезновения. Полученную смесь фильтруют, затем полученный остаток промывают 100 мл диэтилового эфира и сушат до получения 7,81 г белого порошкообразного вещества. Этот порошок растворяют при нагревании в 200 мл метанола и 300 мл метиленхлорида насколько возможно тщательно, а затем растворитель отгоняют при пониженном давлении с аспиратором для снижения объема оставшегося раствора приблизительно до 50 мл. Полученные кристаллы отфильтровывают до получения 6,31 г указанного в заглавии соединения в виде белых порошкообразных кристаллов.

Спектр ЯМР (CD₃)₂ SO), d, м.д. 3,63 (3Н, синглет), 3,78 (3Н, синглет), 4,60 (1Н, дублет, J 5,0 Гц), 4,67 (1Н, синглет), 4,15 (1Н, дублет, J 2,2 Гц), 5,90 (1Н, дублет, дублетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,53 (1Н, синглет), 8,53 (1Н, синглет), 8,72 (1Н, синглет).

Пример 3.

Диметил-1"-деаденино-1" b-2-амино-(1,2,4)-оксадиазоло- [3,2-i]-пурин-7-ил-гризеолата гидробромид.

8,46 г диметилгризеолат-N-оксида, полученного по способу примера 2, суспендируют в 400 мл метанола. Добавляют 2,52 г цианогенбромида, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 ч, а затем перемешивают еще час после добавления дополнительно 630 мг цианогенбромида. Растворитель отгоняют при пониженном давлении до получения объема около 100 мл оставшегося раствора. Добавляют 100 мл этилацетата и перегонку при пониженном давлении продолжают до тех пор, пока объем жидкости не достигает 100 мл. К оставшемуся раствору постепенно добавляют 1000 мл этилацетата при перемешивании. Суспензию, содержащую кристаллы, помещают в холодильник на ночь. Кристаллы отфильтровывают до получения 9,66 г указанного в заглавии соединения.

Спектр ЯМР ((СD₃)₂SO), d, м.д. 3,67 (3Н, синглет), 3,73 (3Н, синглет), 4,67 (1Н, дублет, J 5,0 Гц), 4,66 (1Н, синглет), 5,26 (1Н, дублет, J 2,2 Гц), 5,84 (1Н, дублет дублетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,76 (1Н, синглет), 9,07 (1Н, синглет), 10,23 (1Н, синглет).

Пример 4.

Диметил-N⁶-цианогризеолат-N"-оксид.

9,77 г гидробромида диметил-1"-деаденино-1"b-(1,2,4)-оксидиазоло-[3,2-i] -пурин-7-ил-гризеолата, полученного по способу примера 3, растворяют в 50 мл метанола. К полученной смеси добавляют 50 мл 20 (объем/объем) аммиака в метаноле и смесь оставляют выстаиваться при комнатной температуре в течение 60 мин, затем добавляют 200 мл этилацетата к реакционной смеси и растворитель отгоняют при пониженном давлении с аспиратором. Когда объем жидкости достигает 200 мл, добавляют этилацетат, а затем его отгоняют при пониженном давлении. Когда объем жидкости достигает 200 мл, полученную смесь помещают в холодильник на ночь. Полученные при этом кристаллы отфильтровывают до получения 8,53 г указанного в заглавии соединения в виде желтовато-белых тонких кристаллов.

Спектр ЯМР ((СD₃)₂ SO), d, м.д. 3,67 (3Н, синглет), 3,74 (3Н, синглет), 4,63 (1Н, дублет, J 5,0 Гц),6,66 (1Н, синглет), 5,16 (1Н, дублет, J 2 Гц), 5,93 (1Н, дублет дублетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,50 (1Н, синглет), 8,33 (1Н, синглет), 8,49 (1Н, синглет).

Пример 5.

Диметил-N"-бензилокси-N⁶-цианогризеолат.

8,53 г диметил-N⁶-цианогризеолат-N"-оксида, полученного по способу примера 4, растворяют в 100 мл диметилформамида. Добавляют 10 мл бензилбромида и 10 мл триэтиламина и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч. Растворитель отгоняют при пониженном давлении. Добавляют к остатку 30 мл этанола и 30 мл толуола, а затем их отгоняют. Эту процедуру повторяют 4 раза. Полученное таким образом маслянистое вещество смешивают с 500 мл диэтилового эфира и обрабатывают ультразвуковом при перемешивании шпателем до получения порошкообразного вещества бледно-желтого цвета. Это вещество отфильтровывают и растворяют в 300 мл воды и 500 мл этилацетата. Органический слой, который выделяется, промывают порциями (по 100 мл каждая) насыщенного водного раствора натрийхлорида, 0,2 н. водным раствором соляной кислоты и 10 (вес/объем) водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором натрийхлорида в указанном порядке, а затем сушат над безводным сульфатом магния. После обработки раствора активированным углем, растворитель отгоняют при пониженном давлении до получения 8,8 г указанного в заглавии соединения в виде желтого карамелеподобного вещества.

Спектр ЯМР ((СD₃)₂ SO), d, м.д. 3,68 (3Н, синглет), 3,76 (3Н, синглет), 4,61 (1Н, дублет J 5,0 Гц), 4,67 (1Н, синглет), 5,26 (1Н, дублет, J 2,2 Гц), 5,37 (2Н, синглет), 5,83 (1Н, дублет дублетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,57 (1Н, синглет) 7,2 7,8 (5Н, мультиплет), 8,56 (1Н, синглет), 8,81 (1Н, синглет).

Пример 6.

Диметил-N⁶-циано-N"-метоксигризеолат.

8,3 г триэтиламина и 3,9 г метилиодида добавляют к 40 мл диметилформамида, содержащего 4,5 г диметил-N⁶-цианогризеолат-N"-оксида (полученного по способу примера 4), при охлаждении на льду. Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4,5 ч. Затем растворитель отгоняют и к остатку добавляют 100 мл диэтилового эфира до получения порошка при измельчении смеси шпателем. Нерастворимый продукт отфильтровывают, промывают 30 мл диэтилового эфира и растворяют в смеси 80 мл этилацетата и 20 мл воды, а затем полученный раствор экстрагируют повторно этилацетатом. Этилацетатный слой сушат над безводным сульфатом магния. После того, как отфильтровывают осушающий агент, растворитель отгоняют до получения 3 г указанного в заглавии соединения.

Спектр ЯМР ((СD₃)₂ SO), d, м.д. 3,60, 3,73 (вместо 3Н, каждый синглет), 4,14 (3Н, синглет), 4,58 (1Н, дублет, J 5,0 Гц), 4,64 (1Н, синглет), 5,21 (1Н, дублет, J 2,2 Гц), 5,83 (1Н, дублет дублетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,55 (1Н, синглет), 8,53 и 8,93 (вместо 1Н, каждый синглет).

Приготовление 1.

Диметиловый эфир гризеоловой кислоты.

Растворяют 700 мг гризеоловой кислоты в 100 мл диметилформамида и охлаждают раствор льдом. Добавляют раствор 1,0 1,2 ммоль диазометана в 1 мл диэтилового эфира при перемешивании к первому раствору, пока не появится желтое окрашивание, указывающее на образование диазометана. Затем смесь выдерживают в течение 10 мин. Добавляют уксусную кислоту, чтобы разложить избыток диазометана, затем удаляют растворители выпариванием при пониженном давлении, получая остаток. Этот остаток растворяют в метаноле, а нерастворенные вещества отфильтровывают, фильтрат выпаривают при пониженном давлении, получая остаток, который подвергают перекристаллизации из воды, что дает 540 мг указанного в заголовке вещества.

УФ-спектр поглощения (в метаноле), l_макс., нм: 258 (3 15600).

ЯМР-спектр (в дейтеродиметилсульфоксиде), м.д. 4,60 (1Н, д, J 6,0 Гц) 4,66 (1Н, с), 5,12 (1Н, д, J 3,0 Гц), 6,06 (1Н, дд, J 3,0 и 6,0 Гц) 6,53 (1Н, с), 8,33 (1Н, с), 8,37 (1Н, с).

Приготовление 2.

Диметиловый эфир 6-дезамино-6-гидрокси-0^2", 0^7"-диацетил-4"-бром-5"-гидрогризеоловой кислоты.

Смесь 500 мг диметилового эфира 0^2",0^7"-диацетил-6-дезамино-6-гидроксигризеоловой кислоты (приготовлен как описано в Приготовлении 1) и 10 мл уксусной кислоты, содержащей 1 г бромистоводородной кислоты, помещают в запаянный сосуд и растворяют, используя волны ультразвука, в течение 30 мин. Затем раствор выдерживают при комнатной температуре в течение 64 ч. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, получая остаток, к которому добавляют ацетон и толуол. Затем растворители отгоняют. Эти операции повторяют 3 раза. Смесь образовавшегося остатка и 30 мл этилацетата обрабатывают волнами ультразвука и фильтруют, получая нерастворимый материал. Этот материал растворяют в смеси 30 мл этилацетата и 30 мл водного раствора бикарбоната натрия, содержащего 1,5 г соли, и разделяют слои. Слой органической фазы промывают насыщенным водным раствором хлористого натрия (20 мл) и сушат над безводным сульфатом магния. Раствор очищают хроматографически на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента хлористый метилен, содержащий 3 об. метанола. Из основной фракции выпаривают при пониженном давлении растворитель и остаток растворяют в бензоле. При леопильной сушке бензольного раствора получают 60 мг указанного в заголовке соединения в виде белого порошка.

ЯМР-спектр (в дейтеродиметилсульфоксиде), м.д. 2,98 (1Н, д, J 15,6 Гц), 3,47 (1Н, д, J 15,6 Гц), 5,35 (1Н, д, J 4,2 Гц), 5,57 (1Н, синглет), 6,32 (1Н, д, J 6,6 и 4,2 Гц), 6,53 (1Н, д, J 6,6 Гц), 8,17 (1Н, с), 8,47 (1Н, с).

Пример 7.

2-амино-6-бензилоксигризоловая кислота.

100 мл 0,2 н. водного раствора гидроокиси натрия добавляют к 400 мл метанола, содержащего 8,8 г диметил-N¹-бензилокси-N⁶-цианогризеолата (полученного по способу примера 5) при перемешивании. Реакционный раствор подщелачивают до рН 12 - 12,5, добавляя 1 н. водный раствор гидроокиси натрия, а затем его оставляют выстаиваться при комнатной температуре в течение 60 мин. Растворитель отгоняют до тех пор, пока оставшийся объем жидкости не достигает около 100 мл. Полученной раствор смешивают с 50 мл воды и 150 мл этанола и нагревают при кипячении с обратным холодильником в течение 2 ч. Растворитель отгоняют снова при пониженном давлении до объема жидкости около 100 мл. Добавляют 100 мл 2 н. водного раствора гидроокиси натрия и полученный раствор оставляют выстаиваться при комнатной температуре в течение 60 мин. Добавляют к раствору 200 мл этилацетата и подкисляют до рН 0,5 концентрированной соляной кислотой при перемешивании.

Водные и органические слои разделяют, органический слой промывают 50 мл 0,1 н. водного раствора соляной кислоты, а затем соединяют с водным слоем и обрабатывают активированным углем. Доводят рН раствора до 2,3, добавляя твердый бикарбонат натрия при интенсивном перемешивании. Образовавшийся нерастворимый осадок помещают на ночь в холодильник. Полученное порошкообразное вещество отфильтровывают и сушат до получения 5,29 г указанного в заглавии соединения в виде желтовато-белого порошка.

Спектр ЯМР ((СD₃)₂ SO), d, м.д. 4,54 (1Н, синглет), 4,55 (1Н, дублет, J 5,0 Гц), 5,06 (2Н, синглет), 5,08 (1Н, дублет, J 2,2 Гц), 5,83, (1Н, дублет дублетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,27 (1Н, синглет), 7,2 7,6 (5Н, мультиплет), 7,79 (1Н, синглет).

Пример 8.

2-амино-N⁶-оксигризеоловая кислота.

200 мг 2-амино-N⁶-бензилоксигризеоловой кислоты, полученной по способу примера 6, нагревают с 20 мл метанола и 20 мл воды. Полученный раствор оставляют выстаиваться при комнатной температуре и охлаждении льдом. Добавляют 50 мг 10 (вес/вес) палладия на угле и полученную смесь перемешивают в потоке водорода. Так как реакционная смесь мутнеет за счет образования белого вещества за 30 мин, ее осветляют 5 мл 1 н. водного раствора соляной кислоты и полученный раствор перемешивают в течение 1,5 ч. Катализатор удаляют фильтрованием, метанол отгоняют при пониженном давлении и рН раствора устанавливают 2,2, добавляя насыщенный водный раствор бикарбоната натрия при перемешивании. Реакционную смесь оставляют выстаиваться на ледяной бане в течение 30 мин, а затем полученный желтоватый продукт отфильтровывают до получения 100 мг указанного в заглавии соединения.

Спектр ЯМР ((СD₃)₂ SO)? d, м.д. 4,54 (1Н, синглет), 4,75 (1Н, дублет, J 5,0 Гц), 5,11 (1Н, дублет, J 2,2 Гц), 5,95 (1Н, дублет дублетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,31 (1Н, синглет), 7,83 (1Н, синглет).

Пример 9.

2-аминогризеоловая кислота.

100 мг 2-амино-N⁶-бензилоксигризеоловой кислоты, полученной по способу примера 7, растворяют в смеси 20 мл 1 н. раствора соляной кислоты и 20 мл ацетона. Добавляют 1 мл никеля Ренея (W-2) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2,5 ч. Никель Ренея отфильтровывают и рН реакционной смеси устанавливают 2,3. Затем ее очищают на хроматографической колонке, используя RP-8 предварительно набитую колонку (Меrск), элюируя 3 (объем/объем) водным раствором ацетонитрила. Оставшуюся фракцию лиофилизируют до получения 12 мг указанного в заглавии соединения в виде белого порошка.

Спектр ЯМР ((СD₃)₂ SO), d, м.д. 4,46 (1Н, синглет), 4,55 (1H, дублет, J 5,0 Гц), 5,02 (1Н, дублет, J 2,2 Гц), 5,87 (1Н, дублет дублетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,28 (1Н, синглет), 7,90 (1Н, синглет).

Тонкослойная хроматография (отношение R_f к соответствующему значению для гризеоловой кислоты взято за 1,0).

Пластина силикагеля (Merск): 0,8 (проявляющий растворитель: вода метанол ацетонитрил 70 15 15 по объему).

Пластина RP-8 для обращенной фазы:

0,79 (проявляющий растворитель: вода, содержащая 2 (объем/объем) ацетонитрила и 0,02 (объем/объем) уксусной кислоты).

Пример 10.

Дибензигидрид-2-амино-N⁶-бензилоксигидризеолат

1,0 г 2-амино-N⁶-бензилоксигризеоловой кислоты, полученной по способу примера 7, суспендируют в 100 мл ацетонитрила и 100 мл воды. Добавляют дифенилдиазометан до тех пор, пока больше не наблюдается исчезновения его красной окраски. Затем реакционную смесь перемешивают во время добавления 4 мл 1 н. водного раствора соляной кислоты и добавляют дифенилдиазометан до тех пор, пока больше не наблюдается исчезновения его красной окраски.

Полученную смесь перемешивают в течение 60 мин. Ацетон удаляют перегонкой при пониженном давлении и воду удаляют декантированием. Остаток растворяют в смеси 50 мл этилацетата и 50 мл воды, органическийслой промывают 30 мл 5 вес/объем водного раствора бикарбоната натрия и 30 мл насыщенного водного раствора натрийхлорида и затем сушат над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении и остаток растворяют в 30 мл этилацетата, а полученный раствор выливают в 500 мл гексана при перемешивании. Полученное нерастворимое вещество собирают фильтрованием и очищают на предварительно набитой хроматографической колонке с силикагелем (Мегск), элюируя метиленхлоридом содержащим 2,5 объем/объем метанола. Из двух основных фракций собирают фракцию, которая выходит позднее, выпаривают досуха и лиофилизируют из бензола до получения 430 мг указанного в заглавии соединения в виде белого порошка.

Спектр ЯМР ((СD₃)₂ SO), d, м.д. 4,63 (1Н, дублет, J 5,0 Гц) 4,99 (1Н, синглет), 5,07 (2Н синглет) 5,31 (1Н, дублет, дублет, J 2,2 Гц) 5,97 (1Н, дублет дублетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,33 (1Н, синглет), 6,75 (1Н, синглет), 6,81 (1Н, синглет) 7,74 (1Н, синглет).

Пример 11.

Дибензигидрил-2-оксигризеолат.

0,6 г дибензигидрил-2-аминогризеолата растворяют в 50 мл 80 (объем/объем) водой уксусной кислоты. После замены в контейнере воздуха на азот, к полученной смеси добавляют 1 н. раствор нитрита натрия при охлаждении льдом и полученную смесь оставляют реагировать при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Растворитель отгоняют и остаток смешивают с водой, воду отгоняют снова. Оставшееся в осадке вещество суспендируют в воде и собирают фильтрованием. Остаток растворяют в 15 мл ацетона и рН раствора устанавливают 9 -10, добавляя концентрированный водный аммиак. Полученный раствор оставляют выстаиваться при комнатной температуре в течение 20 мин, а затем ацетон отгоняют. Остаток смешивают с 50 мл этилацетата и 50 мл воды и тщательно перемешивают. Полученный осадок отфильтровывают и очищают на хроматографической колонке с силикагелем (элюируя 10 (объем/объем) этанолом и метиленхлориде) до получения 0,35 г указанного в заглавии соединения. Выделенный этилацетатный слой промывают 10 (вес/объем) водным раствором бикарбоната натрия и насыщенным водным раствором натрийхлорида и сушат над безводным сульфатом магния. Осушающий агент удаляют фильтрованием и растворитель отгоняют. Полученный остаток очищают на хроматографической колонке, используя метиленхлорид, содержащий 10 (объем/объем) метанола в качестве элюента до получения 0,04 г указанного в заглавии соединения.

Спектр ЯМР ((СD₃)₂ SO), d, м.д. 4,59 (1Н, дублет, J 5,0 Гц), 4,90 (1Н, синглет), 5,25 (1Н, дублет, J 2,2 Гц) 6,06 (1Н, дублет дублетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,30 (1Н, синглет), 6,67 и 6,73 (вместе 1Н, каждый синглет), 7,0 7,5 (2Н, мультиплет), 7,93 (1Н, синглет).

Пример 12.

2-Гидроксигризеоловая кислота.

В 3 мл анилоза растворяют 0,37 г дибензгидрилового эфира 2-гидроксигризеоловой кислоты (приготовлена, как описано в примере 11). При охлаждении льдом добавляют 3 мл трифторуксусной кислоты и смеси дают выдержку 10 мин при комнатной температуре.

Затем добавляют толуол и после этого растворитель отгоняют. Затем добавляют смесь ацетона и толуола, которую в последующем отгоняют. Эту методику повторяют дважды, и полученную смесь суспендируют в 2 мл ацетона, которую выливают в 100 мл гексана при перемешивании. Выпавшее в осадок вещество собирают путем фильтрации. Остаток растворяют в растворе бикарбоната натрия (10 г в 100 мл) и этот раствор подкисляют до значения рН 1,2 добавлением концентрированной хлористоводородной кислоты. Полученную смесь очищают хроматографически с использованием предварительно заполненной колонки RP-8 (фирма Мерк). При элюировании водой получают 0,17 г указанного в заголовке вещества.

ЯМР-спектр (в дейтеродиметилсульфоксиде), м.д. 4,46 (1Н, синглет), 4,47 (1Н, дублет, J 5,0 Гц), 5,05 (1Н, д, J 2,2 Гц), 5,89 (1Н, пара дуплетов, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,24 1Н), с), 7,95 (1Н, с). Анализ методом тонкослойной хроматографии (относительное значение Rf) по сравнению с гризеоловой кислотой, взятой 1 0): на пластине RP-8 для обратной фазы (фирмы Мерк) R_f 1,32 (элюирующий растворитель: вода, содержащая 2 об. ацетонитрила и 0,02 об. уксусной кислоты).

Пример 13.

6-Дезамино-2-6-дигидроксигризеолевая кислота.

Растворяют в 1 мл анизола 40 мг дибензгидрилового эфира 6-дезамино-2,6-дигидроксигризеоловой кислоты. Добавляют 1 мл трифторуксусной кислоты при охлаждении льдом и смеси дают выдерживаться в течение 10 15 мин при комнатной температуре. Эти операции добавления и отгонки толуола, затем добавления и отгонки смеси ацетона и толуола повторяют дважды. Остаток суспендируют в 0,5 мл ацетона. После добавления 20 мл гексана выпавшее в осадок вещество собирают посредством фильтрации. Остаток растворяют в водном растворе бикарбоната натрия (10 г/100 мл). Раствор подкисляют до значения рН 0,6 добавлением концентрированной хлористоводородной кислоты. Полученный раствор очищают хроматографически с использованием предварительно заполненной колонки RP-3 (обратная фаза, типа Мерк). Элюируя водой, получая 25 мг указанного в заготовке вещества.

ЯМР-спектр (в дейтеросульфоксиде), м.д. 4,49 (1Н, синглет), 4,58 (1Н, дублет, J 5,0 Гц), 5,12 (1Н, д, J 2,2 Гц), 5,53 (1Н, дд, J 2,2 и 5,0 Гц), 6,41 (1Н, С), 7,91 (1Н, с).

Тонкослойная хроматография (значения R_f относительно гризеоловой кислоты, принятой за 1,0): на платине с силикагелем (фирмы Мерк) R_f 0,57 (элюирующий растворитель вода метанол ацетонитрил: 70 15 15 по объему), на пластине RP-8 для обратной фазы (Мерк) R_f 1,65 (элюирующий растворитель вода, содержащая 2 об. ацетонитрила и 0,02 об. уксусной кислоты).

Пример 14.

Диметиловый эфир N₁-бензилокси-2-(N⁶, N²-диметиламинометилен)-аминогризеолевой кислоты.

528 мг Диметилового эфира 2-амино-N¹-бензилоксигризеоловой кислоты растворяют в 10 мл диметилформамида. Добавляют 0,24 мл диметилацетата диметилформамида и смеси дают выдержку 2 ч при комнатной температуре. После исчезновения исходного вещества, что подтверждается методом тонкослойной хроматографии, растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в 40 мл хлористого метилена и 40 мл воды, и органический слой промывают 20 мл насыщенного водного раствора хлорида натрия. Все водные слои объединяют, и затем смешивают с 2 мл водного раствора бикарбоната натрия (5 г в 100 мл) и экстрагируют два раза 20 мл хлористого метилена. Органические слои объединяют, сушат безводным сульфатом магния и растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток подвергают хроматографической очистке на колонке с силикагелем (фирмы Мерк), элюируемой хлористым метиленом, содержащим 3 об. метанола. После очистки полученное вещество подвергают лиофильной сушке из бензола. Получают 322 мг указанного в заголовке вещества в виде белого порошка.

ЯМР-спектр (в дефтеродиметилсульфоксиде), м.д. 3,04 (3Н, синглет) 3,19 (3Н, с), 3,67 (3Н, с), 3,72 (3Н, С) 4,47 (1Н, дублет, J 5,0 Гц) 4,63 (1Н, С) 5,01 (2Н,с) 5,12 (1Н,д, J 2,2 Гц) 6,00 (1Н, дд, J 2,2 и 5,0 Гц) 6,38 (1Н, с) 7,2 7,6 (5Н, мультиплет) 7,83 (1Н, с) 8,50 (1Н с).

Пример 15.

Диметиловый эфир 2-N",N"-диметиламинометилен) аминогризеоловой кислоты.

583 мг Диметилового эфира N⁶-бензилокси-2-N",N"-диметиламинометилен) аминогризеоловой кислоты (приготовлен как описано в примере 14) растворяют в 100 мл ацетона и 75 мл хлористоводородной кислоты (1 н.). Добавляют 10 мл никеля Ренея (марка W-2), суспендированного в воде, и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин, поддерживая значение рН не ниже 1,0, анализируя кислотность рН-метром. Никель Ренея (катализатор) удаляют посредством выпаривания при пониженном давлении. Когда ацетон почти полностью удаляют, образовавшуюся смесь перемешивают с 200 мл хлористого метилена и нейтрализуют водным раствором бикарбоната натрия. Оставшийся нерастворимый осадок удаляют путем фильтрации. После выделения органического слоя водный слой экстрагируют 3 раза, каждый раз по 50 мл хлористого метилена. Эти органические слои объединяют и высушивают над безводным сульфатом магния. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, и остаток подвергают очистке на хроматографической колонке (фирма Мерк), элюируемой хлористым метиленом, содержащим 5 об. метанола. Полученное вещество очищают и подвергают лиофильной сушке из бензола. Получают 180 мг указанного в заголовке вещества в виде белого порошка.

ЯМР-спектр (дейтеродиметилсульфоксиде), м.д. 3,04 (2Н, с) 3,15 (3Н, с) 3,67 (3Н,с) 3,73 (3Н,с) 4053 (1Н, д J 5,0 Гц) 4,64 (1Н, с) 5,13 (1Н, д J 2,2 Гц) 6,06 (1Н, дд, J 2,2 и 5,0 Гц) 6,47 (1Н, с) 7,33 (1Н, с).

Пример 16.

Диметиловый эфир 6-дезамино-2-(N", N"-диметиламинометилен-амино-6-гидроксигризеоловой кислоты.

477 мг Диметилового эфира 2-(N", N"-диметиламинометилен)-аминогризеоловой кислоты (приготовлен, как описано в примере 15) растворяют в 50 мл водного раствора уксусной кислоты (80 об.).

При охлаждении льдом добавляют 1,34 г нитрита натрия и смеси дают выдержку 17 ч при комнатной температуре. После исчезновения исходного вещества, что контролируется методом тонкослойной хроматографии, растворитель отгоняют при пониженном давлении.

Добавляют этанол и затем его отгоняют, причем эти операции добавления и отгонки повторяют до тех пор, пока не исчезнет запах уксусной кислоты. Остаток растворяют в смеси 50 мл хлористого метилена, 20 мл воды и 5 мл водного раствора бикарбоната натрия (5 г в 100 мл). Органический слой отделяют и экстрагируют 3 раза, порциями по 30 мл хлористого метилена и экстракты объединяют.

Растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток очищают, используя хроматографическую колонку (фирмы Мерк), предварительно заполненную силикагелем и элюируемую хлористым метиленом, содержащим 10 об. метанола. Основные фракции собирают и подвергают лиофильной сушке из бензола, получая 310 мг указанного в заголовке вещества в виде белого порошка.

Спектр УФ-поглощения (В метаноле), l_макс нм: кислотный 292, нейтральный

300, основной 279.

Пример 17.

2-Амино-6-дезамино-6-гидроксигризеоловая кислота.

130 мг Диметилового эфира 6-дезамино-2-(N", N"-диметиламино-метилен)-амино-6-гидроксигризеоловой кислоты (приготовлен как описано в примере 16) растворяют в 20 мл концентрированного водного аммиака и смеси дают выдержку при комнатной температуре в течение 3 ч. Раствор выпаривают насухо при пониженном давлении и остаток растворяют в 10 мл воды. Полученный раствор подкисляют до значения рН 2,3, и затем подвергают хроматографической очистке на предварительно заполненной колонке RP-8 (фирмы Мерк), которую промывают водой и затем элюируют водой, содержащей 5 об. ацетонитрила. Основные фракции собирают и подвергают лиофильной очистке, получая 67 мг указанного в заголовке соединения в виде белого порошка.

Спектр-УФ-поглощения (в воде), _макс, нм: кислотный 255, 273 (плечо) нейтральный 253, 278 (плечо); основной 264.

ЯМР-спектр (в дейтеродиметилсульфоксиде), м.д. 4,48 (1Н, синглет) 4,53 (1Н, дублет, J 4,9 Гц) 5,07 (1Н, д. J 2,4 Гц); 5,79 (1Н, дд, J 2,4 и 4,9 Гц) 6,25 (1Н, С) 7,87 (1Н, с).

Тонкослойная хроматография (относительное значение R_f, для гризеоловой кислоты R_f принято за 1,0):

для силикагелевой пластинки (фирмы Мерк) 0,80 (элюирующий растворитель вода интанол ацетонитрил 70 15 15 по объему) для пластинки RP-8 с обратной фазой (фирмы Мерк) 1,44 (элюирующий растворитель вода, содержащая 2 об. оцетонитрила и 0,02 об. уксусной кислоты).

Пример 18.

По методике примера 9, но используя 2-амино-N⁶-метоксигризеоловую кислоту вместо 2-амино-N⁶-бензилоксигризеоловой кислоты, получили тот же самый конечный продукт 2-аминогризеоловую кислоту, выход 30 в виде белого порошка.

Данные ЯМР и данные биологической активности аналогичны данным для соединения примера 9.

Данные биологической активности аналогичны данным соединения примера 9.

Пример 19.

Повторяли методику примера 5, но изменяя время реакции 1 ч и затем отдельно 5 ч получили готовый продукт практически с тем же самым выходом, что в примере 5.

Препаративный пример.

Дигидродезоксигризеоловая кислота.

Готовят 30 л среды, имеющей pH около 7,0 до стерилизации, следующего состава, масс-объемные проценты:

Глюкоза 5

Соевая мука 1

Дрожжевой экстракт 0,1

Полипептон 0,4

Мясной экстракт 0,4

Хлорид натрия 0,25

Карбонат кальция 0,25

Вода До 100

По 15 л этой среды загружают в каждый из двух 30-литровых вибрационных ферментеров. Затем среду стерилизуют под давлением при 120^oC в течение 30 мин. Культурную среду охлаждают и затем в каждый ферментер инокулируют 150 мл (1 по объему) культурального бульона Streptomyces geiseoausantiacns АПК 63479, который предварительно выдерживают в среде, описанной выше, в культиваторе с роторным встряхиванием при 28^oC в течение 72 ч. Затем проводят культивацию при 28^oC в течение 96 ч при аэрировании со скоростью 15 л воздуха в минуту и перемешивании со скоростью 200 об/мин.

Затем два культуральных бульона фильтруют, чтобы удалить мицелиальную лепешку и объединенные фильтраты (pH 7,0) общим объемом 28 л пропускают через колонку с ионообменной смолой "Диаион НР 20" (торговый знак смолы, производимой фирмой Мицубиши Кемикал Индастриз Лтд) и затем адсорбируют на колонке с активированным углем. Эту колонку промывают водой и затем адсорбированный материал элюируют смесью 40 60 (об.) ацетона и воды. Из полученного раствора выпаривают ацетон при пониженном давлении и оставшийся водный раствор концентрируют посредством выпаривания при пониженном давлении и затем подвергают лиофильной сушке, получая 150 мг неочищенного порошка.

Этот неочищенный порошок растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и затем адсорбируют на ионообменной смоле Доуэкс 1 х 4 (в форме CI^-, торговый знак смолы, производимой фирмой Доу кемикал Ко.). На этой стадии продукт представляет собой смесь гризеоловой кислоты и дигидродезоксигризеоловой кислоты. Эту смесь подвергают градиентному элюированию с градиентом хлористого натрия для того, чтобы разделить эти два компонента. Затем элюат подают на хроматографическую колонку, заполненную смолой Сефадекс IH-20 (торговый знак продукта фирмы Фармация Ко.), причем дигидродезоксигризеоловую кислоту элюируя водой. Фракции, содержащие это вещество, объединяют и подкисляют до значения pH 2,5 путем добавления 1 н. водной хлористоводородной кислоты. Затем продукт адсорбируют на колонке со смолой Диаион РН 20, промытой водой, и затем элюируют смесью 60 40 об. ацетона и воды. Элюат оставляют выдерживаться в течение ночи при 4^oC, после чего дигидродезоксигризеоловая кислота выделяется в виде пластинок. Эти пластинки отделяют из раствора, причем получают суммарно 1,87 мг дигидродезоксигризеоловой кислоты в виде белых пластинок, плавящихся при 160^oC (с разложением, сопровождающимся изменением цвета до коричневого). Это соединение дает одно пятно при хроматографировании методом тонкослойной хроматографии на силикагеле (силикагель артикул 5715, продукт фирмы Мерк и Ко, Инк.).