способ получения устойчивой водорастворимой кристаллической соли 2,3-дидеоксиинозина

Формула изобретения

Способ получения водорастворимой кристаллической соли 2,3-дидезоксиинозина общей формулы



или

отличающийся тем, что 2",3-дидезокси-2,3-дидегидротимидин или 2",3"-дидезоксиинозин или 2",3"-дидезокси-2-фторинозин соответственно подвергают действию водного раствора едкого натра с последующей кристаллизацией из раствора добавлением в качестве затравки изопропанола.

Описание изобретения к патенту

Изобретение касается водорастворимых, устойчивых кристаллических противовирусных (включая противоретровирусные) солей 2",3"-дидезоксиинозина, 2", 3"-дидезокси-2", 3"-дидегидротимидина и 2",3"-дидезокси-2"фторинозина, в частности, их натриевых солей.

Инфекционные вирусные заболевания признаны в качестве важной медицинской задачи. Борьба против инфекционных вирусных заболеваний требует разработки лекарственных препаратов с селективной противовирусной активностью, в то же время являющихся неопасными в отношении нормальных линий клеток. Нуклеозидные аналоги представляют собой целый класс противовирусных средств, исследуемых в настоящее время специалистами, и эти аналоги обладают, по-видимому, определенной селективностью. Вообще эти соединения представляют собой структурные аналоги распространенных в природе нуклеозидов. Структурная модификация в ядре или пиринового, или пиримидинового основания, и/или cахаридного компонента приводит к получению синтетически модифицированного нуклеозидного производного, который при введении в процесс образования вирусных нуклеиновых кислот оказывает разрушающее воздействие на дальнейший синтез вирусной нуклеиновой кислоты.

Эффективность этих противовирусных агентов зависит от селективной конверсии вирусными ферментами, но не ферментами-хозяевами, в соответствующий нуклеотидный аналог, который затем конвертируют в трифосфат с последующим внедрением в вирусную нуклеиновую кислоту. Проблема относительно данной противовирусной стратегии заключается в появлении определенных вирусных штаммов, чьи ферменты плохо промотируют фосфорилирование нуклеозидных аналогов. Для решения данной проблемы интактные нуклеотидные аналоги, кажется, являются потенциально вполне пригодными в качестве противовирусных агентов для внедрения в вирусную нуклеиновую кислоту.

Заявка РСТ N WO87/01284 на имя Мицуя и Бродера описывает использование 2", 3"-дидезоксиинозина для применения против синдрома приобретенного иммунного дефицита (СПИД). Европатент N 273277 на имя Лина и Прусоффа раскрывает использование 2", 3"-дидезокси-2",3"-дидегидротимидина при лечении пациентов, зараженных ретровирусом. Эрик де Клерк ("Потенциальные лекарственные препараты для лечения СПИДа", Журнал противомикробной химиотерапии, 23, приложение А, стр. 35-46 (1989), раскрывает использование дидеозксинуклеозидных аналогов с целью ингибирования инфективности и цитопатического эффекта вируса иммунного дефицита человека (ВИЧ). Европатент N 287313 раскрывает 2", 3"-дидезокси-2"-фторинозин (F-ddI) и его активность против ВИЧ.

Изобретение касается способа получения высоко-водорастворимых, устойчивых кристаллических солей 2",3"-дидезокси-2",3"-дидегидротимидина ("D4Т") формулы



2",3"-дидезоксиинозина ("DDI") формулы



и 2",3"-дидезокси-2э-фторинозина (F-ddI) формулы



где Х обозначает катион Na⁺.

На фиг. 1 показан инфракрасный спектр натрий-2",3"-дидезоксиинозина; на фиг. 2 термогравиметрический анализ (ТГА) натрий-2",3"-дидезоксиинозина; на фиг. 3 дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) натрий-2",3"-дидезоксиинозина; на фиг.4 ядерный магнитный резонанс (ЯMP) натрий-2",3"-дидезоксиинозина; на фиг.5 инфракрасный спектр (ИК) натрий-2",3"-дидезокси-2", 3"-дидегидротимидина; на фиг.6 ТГА натрий-2",3"-дидезокси-2",3"-дидегидротимидина; на фиг. 7 ДСК натрий-2",3"-дидезокси-2",3"-дидегидротимидина; на фиг.8 данные рентгенографического анализа натрий 2",3"-дидизокси-2",3"-дидегидротимидина; на фиг.9 ЯMP-данные относительно натрий-2",3"-дидезокси-2", 3"-дидегидротимидина; на фиг. 10 ИК-спектр натрий-2",3"-дидезокси-2"-фторинозина; на фиг.11 данные ЯMP относительно натрий-2",3"-дидезокси-2"-фторинозина; на фиг.12 ДСК натрий-2",3"-дидезокси-2"-фторинозина.

Как указано выше, изобретение относится к способу получения фармацевтически приемлемых нетоксичных солей 2",3"-дидезоксиинозина, 2",3"-дидезокси-2",3"-дидегидротимидина и 2",3"-дидезокси-2"-фторинозина, содержащим катионы Na⁺. Соли могут быть получены путем взаимодействия гидроокиси натрия с 2", 3"-дидезоксиинозином, 2",3"-дидегидротимидином или 2",3"-дидезокси-2"-фторинозином.

Соединения изобретения имеют желательную противовирусную активность. Они проявляют активность против вирусов, например, вируса герпеса I, вируса герпеса II, вируса циотомегалии, вируса ветряной оспы, вируса гриппа, вируса коровьей оспы, вируса полиомиелита, вируса краснухи, вируса натуральной оспы, вируса (оспо)вакцины, вируса Эпштейна-Барр, вируса кори, респираторного вируса человека, вируса папилломы и вируса Sinbis, а также против ретровирусов, напримеp, вируса иммунного дефицита человека (ВИЧ).

Как указано выше, соединения изобретения являются полезными активными ингредиентами в области здравоохранения и ветеринарной медицины для лечения и профилактики заболеваний, вызванными ретровирусами. Примерами областей в здравоохранении человека относительно ретровирусов являются следующие:

(1) лечение или профилактика ретровирусных заражений человека;

(2) лечение или профилактика заболеваний, вызванных ВИЧ (вирусом иммунодефицитного состояния человека; ранее называемым ТЛВЧ III/ЛАВ или СПИД, где ТЛВЧ Т-лимфотропный вирус человека), и стадий, ассоциируемых с ним, как, например, ARC (CПИД-связанный комплекс) и LAV (cиндром аденопатии), а также иммунной слабости и энцефалопатии под влиянием данного ретровируса;

(3) лечение или профилактика заражения ТЛВЧ I или заражения ТЛВЧ II;

(4) лечение или профилактика состояния носителя СПИД;

(5) лечение или профилактика заболеваний, вызванных вирусом гепатита В.

Примерами показаний в области ветеринарной медицины являются следующие:

(1) Маеdivisna (у овец и коз),

(2) вирус прогрессирующей пневмонии (PPV) (у овец и коз),

(3) вирус артрита-энцефалита коз (у овец и коз),

(4) вирус Zwoegerziekte (у овец),

(5) инфекционный вирус анемии (лошади) и

(6) заражения, вызванные вирусом лейкоза кошек.

Для использования против вирусных заражений соединения изобретения могут быть введены в фармацевтические препараты. Такие препараты состоят из одного или более активных соединений изобретения вместе с фармацевтически приемлемыми носителями. Ссылка: Фармацевтические науки Ремингтона, 17-е издание, А. P. Дженнаро, редактор (Мак Паблишинг Компани, 1985) раскрывает типичные носители и способы получения.

Соединения изобретения вводят системно теплокровным животным, например, человеку. Под системным введением подразумеваются пероральный, ректальный и парентеральный (то есть, внутримышечный, внутривенный, подкожный и назальный) пути введения. Как правило, при пероральном введении соединения может потребоваться большее количество реакционноспособного вещества, приводящее к получению того же эффекта, который достигается при парентеральном введении меньшего количества. В соответствии с хорошо сложившейся клинической практикой предпочтительно вводить соединения изобретения при такой концентрации, которая приводит к получению эффективного противовирусного действия, не вызывая никаких вредных или неблагоприятных побочных эффектов.

Терапевтически и профилактически предлагаемые соединения обычно назначают в виде фармацевтически композиций, содержащих эффективное противовирусное количество соединения в соответствии с изобретением и один или более фармацевтически приемлемых носителей, указанных выше. Фармацевтические композиции для осуществления такого лечения будут содержать большее или меньшее количество, например, от 100 до 0,5% по крайней мере одного соединения изобретения в комбинации с фармацевтическим носителем, при этом носитель включает один или более твердых, полутвердых или жидких разбавителей, наполнителей и адъювантов (вспомогательных средств при приготовлении лекарственной формы), которые являются нетоксичными, инертными и фармацевтически приемлемыми.

Такие фармацевтические композиции предпочтительно существуют в лекарственной унифицированной форме, т.е. в форме физически дискретных единиц, содержащих заранее установленное количество лекарственного вещества, соответствующее однократной или многоразовой дозе, которую вычисляют для создания желательной терапевтической реакции. Также могут присутствовать и другие терапевтические агенты.

Фармацевтические композиции, обеспечивающие наличие около 50 мг-2 г активного ингредиента на унифицированную (стандартную) дозу, являются предпочтительными и обычно приготавливаются в виде таблеток, лепешек, капсул, порошков, гранул, водных или маслянистых суспензий, сиропов, эликсиров и водных растворов. Предпочтительные композиции для перорального применения находятся в форме таблеток или капсул и могут содержать традиционные носители, такие, как связующие вещества (например, сироп, аравийская камедь, желатина, сорбит, трагакант или поливинилпирролидон), наполнители (например, лактоза, сахар, кукурузный крахмал, кальций-фосфат, сорбит или глицин), смазочные вещества (например, стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль или кремнезем), дизинтеграторы (например, крахмал), буферные вещества (неорганические или органические) и смачивающие вещества (например, лаурилсульфат натрия). Растворы или суспензии предлагаемого соединения с традиционными фармацевтическими носителями используют для парентеральных композиций, таких, как водный раствор для внутривенной инъекции или маслянистая суспензия для внутримышечного введения. Такие композиции, имеющие необходимую чистоту, устойчивость и приемлемость для парентерального использования, получают путем растворения от 0,1 до 35% по массе активного ингредиента в воде или носителе, включающем многоатомный алифатический спирт, таком, как глицерин, пропиленгликоль и полиэтиленгликоль или их смеси. Полиэтиленгликоли содержат смесь нелетучих, обычно жидких полиэтиленгликолей, которые растворимы как в воде, так и в органических жидкостях и имеют молекулярные массы около 200-1500.

Предлагаемые соединения имеют склонность к кислотному гидролизу. С целью биологической доступности таблетки, капсулы и гранулы, предназначенные для перорального применения, должны быть защищены энтеросолюбильным покрытием, а также защитной зоной против кислоты желудочного сока, или и тем, и другим.

Соли являются устойчивыми, кристаллическими и отличаются очень высокой водорастворимостью (свыше 300 мг/мл), идеально приспособлены для использования при высоких концентрациях и малых объемах внутривенной-внутримышечной инъекции. Наиболее важно, что высокая щелочность (рН 9,5-11) этих новых солей позволяет осуществлять самозащиту против кислоты желудочного сока. Поэтому меньшее количество буфера необходимо в пероральной лекарственной форме.

Соли изобретения обратимо "иммобилизуются" в энольной форме и поэтому могут рассматриваться как промежуточные соединения для синтеза различных потенциально биологически активных производных, таких, как сложные энольные эфиры (пролекарства) и простые энольные эфиры. Сложные и простые эфиры также могут функционировать в качестве защитных (блокирующих) групп, позволяя осуществлять работу относительно других функций или частей молекул.

В отношении биологической активности, которой обладают соединения настоящего изобретения, можно заметить, что эти соединения имеют противовирусные свойства, особенно пригодные для их использования в борьбе с вирусными заражениями. Таким образом, другой аспект настоящего изобретения касается способа лечения вирусных (включая ретровирусные) инфекций у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, который заключается в системном введении такому млекопитающему эффективной дозы предлагаемого соединения.

На основании испытания можно ожидать, что эффективная доза составляет приблизительно от 0,1 до 5 мг/кг веса тела, предпочтительно около 1-4 мг/кг веса тела. Предполагается, что для клинического противовирусного применения соединения настоящего изобретения будут вводиться таким же образом, как и эталонное лекарственное средство зидорудин (AZТ). Однако для клинических применений система доз и схема приема лекарственного средства в каждом случае должны тщательно регулироваться с использованием здравой профессиональной оценки и учетом возраста, массы и состояния реципиента, пути введения лекарственного средства, а также природы и тяжести болезни. Вообще суточная пероральная доза составляет приблизительно от 150 мг до 5 г, предпочтительно 50-150 мг предлагаемого соединения, вводимого от одного до трех раз в сутки. В некоторых случаях достаточный терапевтический эффект может быть достигнут при более низких дозах, тогда как в других случаях потребуются более высокие дозировки.

Описание специфических вариантов. Температура дана в градусах по Цельсию, когда не конкретизирована. Все соединения изобретения дают удовлетворительные элементарные анализы.

Пример 1. Получение натрий-DDI моногидрата



Молекулярная масса: DDI 236,14; NaOН 40.

4,3 мл 1 н. раствора NaOН эквивалентны 1 г DDI для молярного отношения 1/1.

1. Прибавляют 1 г DDI к 4,51 мл водного 1 н. раствора NaOН (1,05 молярных эквивалентов) при умеренном перемешивании при температуре 10-25^oC в течение 5 мин. Получают раствор (рН 9,5-11) или почти раствор.

2. При необходимости раствор пропускают через эквивалент 0,2-0,45 мкм фильтра Gelman НТ-Тuffryn для осветления. Стадии 1 и 2 должны быть завершены в течение 1,5 ч.

3. В течение 10-15 мин прибавляют раствор Na-DDI к 50-75 мл тщательно перемешанного изопропанола (альтернативно, можно использовать ацетон). Форма кристаллов. Продолжают тщательное перемешивание (закрытая система) в течение 2 ч.

4. Кристаллы собирают с применением пригодной методики фильтрации под вакуумом. Через фильтровальную лепешку не протягивают избыточный воздух. Уплотняют кристаллическую фильтровальную лепешку (под вакуумом) с удалением любых расколов или трещин, которые могут образоваться. Через лепешку не протягивают избыточный воздух.

5. Промывают фильтровальную лепешку тремя отдельными 15-мл порциями изопропанола и затем тремя отдельными 20-мл порциями ацетона. Через фильтровальную лепешку между промывками не протягивают избыточный воздух. Удаляют любые расколы или трещины, которые могут образоваться между промывками, путем уплотнения.

6. Кристаллы сушат под высоким вакуумом при температуре 24-35^oC в течение 24 ч. Ожидаемый выход 1-1,1 г.

7. Если необходимо, ацетон может полностью заместить изопропанол. Кроме того, можно обратить прибавление, если желательно, а именно, растворители прибавляют к перемешанному водному раствору DDI в течение 0,5 ч.

Химические и физические свойства, полученные для Na-DDIH₂

1. Водорастворимость: cвыше 300 мг/мл (рН 9,5-11)

2. Устойчивость водного раствора: 5%-ная потеря в течение 1 недели при температуре 50^oC, 10%-ная потеря в течение 1 недели при температуре 70^oC.

3. Устойчивость в твердом состоянии: нет потери в течение 5 недель при температуре 70^oC.

4. Элементарный анализ: C₁₀H₁₁N₄O₃NaH₂О (С₁₀Н₁₃N₄O₄Na)

Молекулярная масса: 276,26.

Теоретически, C 43,5; H 4,7; N 20,3; Na (зола) 8,3; H₂OKF 6,5 (для моногидрата).

Обнаружено, C 43,18; H 4,6; N 20,16; Na (зола) 8,26; H₂OKF 6,57.

5. ИК: см.фиг.1.

6. ТГА: см. фиг.2.

7. ДСК: см. фиг.3.

Рентгеновская пленка: d-линии рентгеновского спектра (см. таблицу).

9. ЯMP: см.фиг.4 (растворитель отсутствует).

Анализ методом ВЭЖХ

Колонка: IBM Фенил, 5 мкм, 4,5 x 150 нм.

Подвижная фаза: 98% 0,015 М NH₄H₂PO₄ в воде Milli-Q, рН 7,1 с концентрированным NH₄OH/2% ацетонитрил.

Скорость потока: 0,1 мг/мл в воде.

Приближенное время удерживания: DDI 10 мин; гипоксантин 3 мин.

Пример 2. Получение натрий-D₄Т гидрата



Молекулярная масса: D₄Т 224,2.

Молекулярная масса: NaOH 40.

4,46 мл 1 н, раствора NaOН эквивалентно 1 г D₄Т для молярного отношения 1/1.

1. Прибавляют 1 г D₄Т к 4,7 мл водного 1 н. раствора NaOН (1,05 молярных эквивалента) при умеренном перемешивании при температуре 15-25^oС в течение 5 мин. Получают раствор (рН 9,5-11) или почти раствор.

2. Повторяют стадии 2-7, описанные в примере 1 для получения Na-DDI H₂О.

3. Ожидаемый выход составляет для D₄Т Н₂ 1,1 г.

Химические и физические параметры, полученные для Na-D₄Т H₂О

1. Водорастворимость водного раствора: 1 неделя при температуре 50^oC 20% остаточных

3. Устойчивость в твердом состоянии: нет потери в течение 1 недели при температуре 70^oC.

4. Элементарный анализ: C₁₀Н₁₁N₂O₄Nа Н₂О (C₁₀Н₁₃N₂O₀Na)

Молекулярная масса: 264,22.

Теоретически, C 45,5; H 5,0; N 10,6; Na 8,7; H₂OKF 6,8 (для моногидрата).

Обнаружено, C 45,05; H 4,89; N 10,37; Na 8,43; H₂OKF 6,9.

5. ИК: см. фиг.5.

6. ТГА: см. фиг.6.

7. ДСК: см. фиг.7.

8. Рентгенография: см. фиг.8.

9. ЯMP: см. фиг.9.

Анализ методом ВЭЖХ

Колонка: IВM Фенил, 5 мкм, 4,5 х 150 нм.

Подвижная фаза: 98% 0,015 М NH₄Н₂PO₄ в воде Milli-Q, рН 7,1, с концентрированным NН₄OH/2% ацетонитрил.

Cкорость потока: 0,1 мл/мин.

Объем введения: 25 мкл.

Время испытания: 20 мин.

Длина волны: 254 нм.

Температура: комнатная, 20-30^oC

Концентрация пробы: приблизительно 0,1 мг/мл в воде.

Приближенное время удерживания: D4T 8 мин, Тимин 3 мин.

Пример 3. Получение натрий F-ddI полугидрата



Молекулярная масса: FDDI 254,24; NaOН 40.

1,72 мл NaOН эквивалентно 436 мг FDDI для молярного отношения 1/1

1. FDDI (426 мг) суспендируют в 1,8 мл 1 н. раствора NaOН (256 мг/мл Na FDDI), рН 9,9 раствора получают через 2 мин.

2 Прибавляют 2 мл изопропанола. Раствор остается светлым.

3. Медленно при перемешивании прибавляют изопропанол. Игольчатая кристаллизация начинается после прибавления 15 мл изопропанола. Смесь суспендируют в течение 10 мин.

4. Прибавляют 15 мл ацетона и смесь суспендируют в течение 15 мин.

5. Кристаллы извлекают фильтрацией под вакуумом, промывают 15 мл ацетона и 20 мл простого эфира и подвергают вакуумной сушке (Р₂O₅ при температуре 50^oC в течение 2 ч и затем при температуре 24^oC в течение 24 ч). Выход: 430 мг.

Проба (21 мг) легко растворяется в 0,05 мл воды (около 400 мг/мл; рН 10,0).

Элементарный анализ: C₁₀Н₁₀N₄FO₃Na

Теоретически, C 42,0; H 3,9; N 19,6; F 6,6; Na 8,0; H₂OKF 3,23 (полугидрат).

Обнаружено, C 41,19; H 3,73; N 18,8; F 6,13; Na 8,11; H₂OKF 3,23.

Рентгенограмма (пленка): d-линии рентгеновского спектра

d I/I_о

16,20 50

9,40 50

6,91 50

5,81 50

5,40 100

ИК: см. фиг.10.

ЯMP: cм. фиг.11. Данные согласуются с предложенной структурой. Не обнаружено присутствия ацетона или простого эфира. -Изомер отсутствует.

ДСК: см.фиг.12.